Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ل Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

لقد قمنا بتطوير رواية فيفو السابقين نموذج لدراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري. لأنه يقوم على المجهرية الأنسجة المعزولة من عينات الأنسجة الثدي الجراحية التي تحافظ العمارة الأنسجة، والتفاعلات بين الخلايا، ونظير الصماوي الإشارات.

Abstract

وقد أعاق دراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري من خلال عدم وجود نظم نموذج كافية. على الثقافة في المختبر، والخلايا الظهارية الثديية الأولية تميل الى فقدان مستقبلات الهرمونات التعبير. على نطاق واسع مستقبلات الهرمونات خطوط خلايا سرطان الثدي إيجابي المستخدمة هي ذات أهمية محدودة إلى الوضع في الجسم الحي. هنا، نحن تصف نموذجا فيفو السابقين لدراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري. وميكانيكيا وإنزيمي هضمها الطازجة عينات أنسجة الثدي الإنسان من المواد تجاهل الجراحية مثل mammoplasties تخفيض أو mammectomies للحصول على شظايا الأنسجة التي تحتوي على قنوات وفصيصات وأنواع الخلايا اللحمية متعددة. هذه المجهرية الأنسجة يوضع في المتوسط ​​القاعدية دون عوامل النمو الحفاظ على اتصالاتهم بين الخلايا، والهندسة المعمارية الأنسجة، وتبقى هرمون استجابة لعدة أيام. يتم معالجتها بسهولة أنها لRNA واستخراج البروتين، والتحليل النسيجي أو تخزينها في تجميد المتوسطة. مضانتنشيط الفرز الخلية (FACS) يمكن استخدامها في تخصيب للسكان خلية معينة. يوفر هذا البروتوكول نهج واضحة، ومعيار للدراسات متعدية مع معقدة للغاية، العينات البشرية المتنوعة.

Introduction

معلومات حول المشهد التحولي في سرطان الثدي يتزايد بوتيرة سريعة. وقد تم إيلاء اهتمام أقل لعوامل النظامية التي تؤثر على تطور سرطان الثدي. التعرض للهرمونات التناسلية له تأثير كبير على تطور المرض 1-3. ومع ذلك، وغير مفهومة الآليات التي الهرمونات الإنجابية تؤثر على الثدي البشري. وقد كشف العمل مع نماذج الماوس المعدلة وراثيا التي تنطوي على الخلية إشارات الجوهرية ونظير الصماوي من خلال العديد من المستجيبات المصب 4.

معرفة محدودة عن عمل الهرمون في الثدي البشري تعزى إلى حد كبير إلى عدم وجود نماذج كافية. وقد تم تنفيذ معظم العمل على آليات مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) ومستقبلات هرمون البروجسترون (PR) إشارات مع خطوط الخلايا مستقبلات هرمون إيجابية سرطان الثدي، مثل MCF-7 و T47D. وقد استمدت هذه من الانصباب الجنبي من المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي المتقدم الذي كان الريدتلقى دى معالجات متعددة 5. أهمية البيولوجية للنتائج في مثل هذه في المختبر نماذج بسيطة من الثدي البشري هي الجينات مشكوك فيها والمستهدفة المحددة في هذه النماذج في المختبر هي تختلف عن الجينات المستهدفة التي يتم تحديدها في النماذج الحيوانية 6. عندما الخلايا الظهارية الأساسي الثدي البشري يتم تربيتها في المختبر أنها تميل الى فقدان التعبير مستقبلات الهرمونات وبالتالي استجابة هرمون 7،8. يمكن circumventd هذه المشكلة عن طريق النهج 3D المتطورة باستخدام matrigel. وبهذه الطريقة، نجح C. كلارك وزملاؤه في إنشاء خلايا الثدي الظهارية التي حافظت مستقبلات الهرمونات التعبير وأظهرت استجابة التكاثري لهرمون البروجسترون التحفيز 9. ومع ذلك، واثنين من المهم في الجسم الحي مستقبلات هرمون البروجسترون الجينات المستهدفة، WNT-4 وRANKL، لم يسببها على التحفيز البروجسترون في هذا النظام 9. وقد اتخذ هذا النهج مؤخرا حول زيادة مع في المختبر 10. ويبقى التحذير من أن matrigel له الأنشطة التي تعتمد على دفعة، باهظة الثمن، ويتطلب تصميم التجريبية التي هي عرضة للأرقام زنزانة صغيرة فقط.

وبناء على هذا الاكتشاف أنه في ER الجسم الحي والعلاقات العامة والإشارات بوساطة إلى حد كبير من التفاعلات نظير الصماوي 11، قلنا أن التفاعلات بين الخلايا تحتاج إلى الحفاظ عليها. وفصلها عامل مهم آخر أن تندثر مع أنسجة الخلايا وحيدة للثقافة في المختبر هي تفاعلات الخلايا الظهارية مع المصفوفة خارج الخلية. بعد هذه حاسمة للتمايز الظهارية وتعطيل لها مهم في تكون الأورام 12. مع هذا في الاعتبار، أنشأنا طريقة لعزل المجهرية أنسجة الثدي من المواد الطازجة تجاهل الجراحية 13. لحمة الثدي، ويتألف من ظهارة الطبقات اثنين مع اللمعية الداخلية وmyoepitheli الخارجيخلايا القاعدة ويتم تشريح بعيدا عن الأنسجة الدهنية وتعرض لتفارق الميكانيكية والأنزيمية. بعد غسل والطرد المركزي، ويتم الحصول على أجزاء من قنوات الحليب التي تحتفظ تفاعلات وثيقة مع العديد من الخلايا اللحمية. تبقى هذه المجهرية الأنسجة هرمون استجابة. تم التحقق من صحة النموذج في العينات السريرية 13. على هذا النحو، يمكن أن الإجراء الحالي يساعد على دراسة عمل الهرمونات في الثدي في سياق بيولوجيا وذات الصلة سريريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اعتبارات عامة: في وقت مبكر، إنشاء بروتوكول الأخلاق، وإعداد الاستبيانات للمرضى، ونرى لتدريب الموظفين السريري. قبل استخدام مواد من جراحة تصغير او تكبير الخفض، شراء التراخيص، وضمان موافقة المريض. قد تكون الأنسجة المعدية ويحتاج ليتم التعامل معها وفقا لذلك. وقد وافق هذا البروتوكول من قبل لجنة أخلاقية من ISREC - المعهد السويسري لبحوث السرطان التجريبية.

1. الأنسجة الاسترداد، تجهيز والحيوية المصرفية

لضمان أفضل جودة عينة لالمصرفية الحيوي، وتنفذ عددا من الخطوات للخروج في المستشفى قبل نقل إلى المختبر.

في المستشفى:

  1. الحصول على أنسجة الثدي الإنسان تحت ظروف معقمة من عينات جراحة تصغير او تكبير خفض والدم، وإذا لزم الأمر. تحتاج الأنسجة لفحصها من قبل الطبيب الشرعي الذي سوف أخذ عينات لاستبعاد وجود الآفات الخبيثة.
  2. ضع ر الثديتصدر تحت غطاء محرك السيارة على لوحة العقيمة وإعداد مقص، مشرط جراحي وملقط التي يتم تعقيمها التعقيم بالفعل مع البخار. جعل قطع عميق في مواقع مختلفة من الأنسجة الثديية باستخدام مشرط لفتحه. في نسيج الثدي الإنسان والبحث عن خيوط بيضاء تتكون من قنوات وفصيصات، والتي هي جزء لا يتجزأ في الأنسجة الدهنية الصفراء.
    ملاحظة: نسبة متني البيضاء إلى الأنسجة الدهنية الصفراء تختلف بين النساء. عادة النساء الأصغر سنا لديهم الأنسجة الظهارية أكثر.
  3. اختيار قطع من مادة بيضاء وعقد لهم مع ملقط، ثم تفصل بينهما بلطف من الأنسجة الدهنية مع مقص. تجنب اتخاذ الأوعية الدموية.
  4. قطع شطف من الأنسجة في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.2 لإزالة الدم. نقل الأنسجة لزجاجات البلاستيك 250 مل تحتوي على F12 المتوسطة (متوسطة F12 Dulbecco لتعديل النسر) دون الفينول الأحمر مع 2٪ البنسلين / الستربتومايسين (بما في ذلك 5،000 وحدة / مل البنسلين و 5،000 غرام / مل الستربتومايسين) و 1٪ لtibiotic / الأمفوتريسين B (بما في ذلك 10،000 وحدة / مل البنسلين، 10،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين، و 25 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B). متجر الأنسجة في المتوسط ​​لنقلها إلى المختبر.
  5. إعداد قطعة من 3-5 مم لRNA والبروتين استخراج وفلاش تجميدها في cryovials مع البرد (الثلج الجاف) isopentane. نقلها إلى صندوق الثلج الجاف لنقلها إلى المختبر.
  6. وضع قطعة من 3-5 ملم في العفن وتغطية ذلك مع طبقة من قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) ثم وضع القالب في أسفل شقة مربع مليئة isopentane الباردة. بعد تجميد كامل نقل القالب إلى مربع الثلج الجاف.
  7. إصلاح 5 قطع من 3-5 مم في بارافورمالدهيد (PFA) 4٪ و 5 قطع أخرى في الفورمالديهايد (FA) 4٪ في برنامج تلفزيوني في RT التحليل النسيجي في وقت لاحق. ينصح اثنين من مثبتات مختلفة كما تعمل بعض الأجسام المضادة بشكل أفضل مع واحدة أو أخرى من الاثنين.

في المختبر:

  1. فعلcument جميع المعلومات عن تصغير او تكبير الخفض، وتستمد تاريخ الجراحة وإذا كانت العينات من اليسار مقابل اليمين الثدي.
  2. وضع العينات المجمدة في -80 ° C ونقل الأنسجة الثابتة إلى أشرطة الأنسجة بعد 2 ساعة من التثبيت. ثم وضعها إما في برنامج تلفزيوني أو الإيثانول 70٪، لO / N تخزين عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، ونقل أشرطة الأنسجة إلى مرافق الأنسجة لالبارافين التضمين.

2. الأنسجة الهضم وتحفيز هرمون

  1. نقل الزجاجات التي تحتوي على عينات الأنسجة لمجلس الوزراء تدفق الصفحي في غرفة زراعة الخلايا P2. ضع قطعة نسيج على متن تقطيع معقمة (29 × 19 سم). امسك المواد مع ملقط وتتخلص من الدهون المتبقية والسفن بعيدا عن لحمة الثدي (الجزء الأبيض) مع مشرط. وضع مادة بيضاء في برنامج تلفزيوني في طبق ثقافة 10 سم.
  2. بعد إزالة المواد الدهنية من كل قطعة والتخلص منها وفقا لسيادة السلامةالصورة من المختبر، ووضع أجزاء البيضاء التي تحتوي على الأنسجة الظهارية مرة أخرى على لوحة التقطيع. باستخدام المشارط معارضة قطع الأنسجة وختم عليها إلى قطعة من لتصل إلى 2 مم.
  3. وضع المواد المفروم في أنابيب من حجم كاف: يصل إلى 1، 2.5 و 10 مل إلى 5 أو 15 أو 50 مل أنابيب، على التوالي. عادة 5 مل عوائد أنبوب ما يكفي من المواد لالغرز البارافين وهرمون التحفيز، و15 مل عوائد أنبوب ما يكفي من المواد لالإسفار خلية المنشط للفرز (FACS). وتستخدم أنابيب أكبر لتجميد مأخوذة.
  4. تحضير مزيج الرئيسي الهضم تتكون من المتوسطة (DMEM / F12 دون أحمر الفينول) مع البنسلين 1٪ / الستربتومايسين / الأمفوتريسين B وكولاجيناز ألف (A كلوستريديوبيبتيداز من مطثية حالة للنسج). جرعة كولاجيناز وفقا لمرات الهضم.
    1. لمدة 12، 24، و 36 ساعة من الحضانة، واستخدام تركيز النهائي من كولاجيناز من 1.5 ملغ / مل، 1.0 ملغ / مل و 0.5 ملغ / مل على التوالي. إضافة مزيج الرئيسي الهضم تصل إلى 4 مرات منحجم المواد هضمها لضمان التحريض وتهوية كافية.
      ملاحظة: اعتمادا على التصميم التجريبي ومدة التحفيز الهرمون، إضافة الهرمونات إما أثناء أو بعد خطوة عملية الهضم والمجهرية الأنزيمية الانتعاش.
  5. إضافة هرمون (ق) في التركيز المطلوب لاختبار العينات والسيارة إلى عنصر التحكم. لالتحفيز مع 17-β استراديول، وpromegestone (R5020) استخدام تركيز النهائي من 20 نانومتر.
    ملاحظة: R5020 هو الاصطناعية ناهض مستقبلات هرمون البروجسترون، وهو أكثر استقرارا من البروجسترون الطبيعي في المتوسط.
    1. مكان الأنابيب في الخلاط الأسطوانة داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية و 40 دورة في الدقيقة O / N. قبل وضع العينات في الخلاط، و resuspend لهم بشكل جيد للغاية للتأكد من أن جميع المواد وتوزع على طول أنابيب الطرد المركزي.
  6. كما يأخذ الهضم لا يقل عن 12 ساعة (O / N)، للمرة تحفيز هرمون أقل من 12 ساعة، إضافة الهرمونات بعد الشفاء من المجهرية (ديالذيل تحت الخطوة 3). إضافة الهرمونات كما كنت resuspend والمجهرية ووضع تعليق على لوحات مرفق منخفضة للغاية. يمكن أن تظل المجهرية الأنسجة على لوحات مرفق منخفضة للغاية لمدة تصل إلى 7 أيام في النمو خالية من عامل المتوسطة الحفاظ على حوالي 70٪ قدرتها على البقاء.
  7. لRNA والبروتين التحليل، وجمع المجهرية الأنسجة بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق وفلاش تجميد في أنابيب الطرد المركزي.

3. استرداد المجهرية الأنسجة

  1. أجهزة الطرد المركزي أنبوب (ق) في 400 x ج لمدة 5 دقائق. نضح الدهون من الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي ونقل طاف من طاف مائي المتبقية، والتي يتم تخصيبها في الخلايا الليفية، إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 1،250 x ج لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: كما في المجهرية نسيج الثدي هي لزجة جدا، لجميع الخطوات اللاحقة resuspend الكرية التي كتبها تهييج بلطف الأنبوب. لا ينصح pipetting ليرجع ذلك إلى خطر فقدان المواد. Resuspend وكريات المخصب في المجهرية والخلايا الليفية المستمدة من طاف مائي في برنامج تلفزيوني، 2٪ الجنين مصل العجل (FCS). وفي وقت لاحق تدور على حد سواء في أنابيب 1،250 x ج لمدة 5 دقائق ثم تجاهل supernatants.
  2. Resuspend والكريات في 3-5 مل الأحمر العازلة تحلل الدم خلية ونقلها لتنظيف الأنابيب. احتضان لهم لمدة 5 دقائق على RT.
  3. إضافة حجم 2X من برنامج تلفزيوني، 2٪ FCS وأجهزة الطرد المركزي لهم في 1،250 x ج لمدة 5 دقائق. غسل الكريات مع PBS، 2٪ FCS والطرد المركزي في 1،250 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين.

4. عينات لالتدفق الخلوي

  1. إضافة 1 - 2 مل التربسين 0.25٪ لبيليه ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا بلطف شديد لمدة 2 دقيقة مع pipetman 1،000 ميكرولتر لفصل الخلايا.
  2. تمنع النشاط التربسين بإضافة 9 مل PBS، 2٪ FCS. الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه في 10 مل PBS، 2٪ FCS.
  3. نقل تعليق الخلية على مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وضعت على رالمرجع من أنبوب الطرد المركزي 50 مل لإعداد الخلايا واحد. إذا بقيت بضع ميكرولتر من تعليق خلية على رأس مرشح، ومساعدتهم تمر عبر فلتر بواسطة الشفط إليها من الجانب الآخر من مصفاة مع الماصة وإضافتها إلى المجهرية التي تمت تصفيتها.
  4. الخلايا المناعية منفصلة، ​​الخلايا الليفية والخلايا البطانية من المجهرية مع كوكتيل من مكافحة CD45، ومكافحة FAP ومكافحة CD31 الأجسام المضادة ومن ثم فرزها مع FACS، استنادا إلى عموم الظهارية EpCAM علامة وCD10 لفصل الخلايا اللمعية والقاعدية على التوالي 10 .

5. عينات الأنسجة ل

  1. بعد غسل المواد هضمها ميكانيكيا وإنزيمي كما هو موضح أعلاه، إصلاح الكريات من 1.5 مل المواد الأولية في 1 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني في RT لمدة 30 دقيقة.
  2. الطرد المركزي في 1،250 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل مع 1 - 2 مل PBS مرتين.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 10 دقيقة. خلال هذا الوقت، وإعداد 1٪ متعددة الأغراض الاغاروز في تريس، خلات-EDTA (TAE) العازلة والحرارة الحل في المايكرويف حتى يأتي الحل ليغلي.
    1. إزالة الحل من فرن الميكروويف ودوامة القارورة بلطف لمزج الحل و resuspend أي جزيئات الاغاروز المتبقية. الحل الاغاروز بارد إلى 50 درجة مئوية، وتصب 1 مل في قالب قاعدة البارافين الحجم 31 × 23 × 13.5 ملم.
  4. تجاهل طاف ووضع الكريات على الجزء العلوي من طبقة طدت (1 - 3 مم) من الاغاروز باستخدام ملعقة مع نهاية مسطحة. تغطية كل منهم مع طبقة إضافية من الاغاروز (40 ° C).
  5. بعد agarose يتصلب، عادة في غضون 5 دقائق، وطرح الكتل الاغاروز في أشرطة الأنسجة لالبارافين الغرز. جنبا إلى جنب مع عينات الاغاروز تضع ورقة بيضاء في مكتب الكاسيت مع جميع المعلومات حول عدد تصغير او تكبير الخفض، حالة تجريبية، وتاريخ مكتوبة بحروف صغيرة في قلم رصاص. كتابة هذه السطور يقاوم جميع الخطوات معالجة لاحقة.
  6. وضع أشرطة فيPBS O / N، أو في 70٪ من الإيثانول لتخزين خلال عطلة نهاية الأسبوع، في 4 درجات مئوية. ونحن لم يلاحظ أي فرق بين حلول التخزين اثنين. ثم نقل أشرطة الأنسجة إلى مرافق الأنسجة لالبارافين التضمين.

6. المجهرية التجميد (المستقبل التثقيف)

  1. في resuspend المجهرية الأنسجة في تجميد المتوسطة التي تتكون من FCS مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، وتجميد 1 مل مأخوذة في cryovials. يعتمد عدد cryovials الحصول على كمية من المواد الأولية التي تم الحصول عليها من تصغير او تكبير الخفض.
  2. تجميد cryovials تحتوي على المجهرية الأنسجة باستخدام المجمد معدل تسيطر عليها مع البرنامج التالي: 5 دقائق مسكن في 4 درجات مئوية، وخفض درجة الحرارة إلى -7 ° C مع معدل 6 ° C / دقيقة، وخفض درجة الحرارة إلى -12 ° C مع معدل 6 ° C / دقيقة، 10 دقيقة مسكن، وخفض درجة الحرارة إلى -40 درجة مئوية مع نسبة 6 ° C / دقيقة، وخفض في درجة الحرارة إلى -80 درجة مئوية معمعدل 6 ° C / دقيقة. ثم نقل إلى cryovials -80 ° C الفريزر.
  3. اليوم التالي، ونقل cryovials من -80 ° C إلى خزان النيتروجين السائل لتخزين الطويل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدراسة دور هرمون الاستروجين والبروجستيرون وفهم أفضل الوظائف الجزيئية في الثدي البشري، نقوم بجمع عينات أنسجة الثدي البشرية الطازجة من المرضى الذين يخضعون mammoplasties التخفيض (الشكل 1) بعد الحصول على موافقتها المستنيرة. ونحن أيضا الحصول على التاريخ المرضى الطبية والتناسلي، وكذلك عينة من الدم لتحديد مستويات البروجسترون مصل في وقت الجراحة. وميكانيكيا وفصلها إنزيمي الأنسجة من mammoplasties تخفيض الطازجة. المجهرية الأنسجة الناتجة لها قنوات وفصيصات المميزة للأنسجة الثدي من أصل (الشكل 2A). تحليل المناعى من الاغاروز والمجهرية الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين ملطخة للعلامة ΔNp63 ظهاري عضلي (الشكل 2B) تكشف عن أن المجهرية تحتفظ ليس فقط الخصائص المورفولوجية للأنسجة الثدي العادية ولكن أيضا الشخصى الجزيئي للسلالسكان لتر.

لتقييم استجابة الهرمون، وعولج المجهرية الأنسجة إما مع البروجسترون الاصطناعية مستقبلات ناهض promegestone (R5020) أو السيطرة الايثانول. لإثراء لمستقبلات الهرمونات الخلايا اللمعية إيجابية التدفق الخلوي أجريت على أساس الظهارية (EpCAM) وعلامة عضلية ظهارية (كالا، الشكل 3A) بعد استنزاف لالبطانية، الخلايا الليفية والخلايا المناعية مع كوكتيل من مكافحة CD31، ومكافحة FAP ومكافحة الأجسام المضادة CD45. تحليل QRT-PCR من EpCAM +، أظهرت خلايا CD10- تصل تنظيم البروجسترون الهدف الجين WNT-4 (الشكل 3B) في الخلية اللمعية السكان المخصب من R5020 يتعرض المجهرية الأنسجة.

الشكل (1)
الشكل 1. عينة أنسجة الثدي. الصورة الحد من تشريح حديثا عينة تصغير او تكبير. وتشير السهاملخيوط بيضاء الأنسجة التي تحتوي على لحمة الثدي، أي قنوات الحليب وحدات مفصص الأقنية الطرفية. جزءا لا يتجزأ من داخل وفيرة الأنسجة الدهنية الصفراء. في حين أن اللون من الدهون لا يتسق بين المرضى، فإن نسبة الأنسجة الدهنية، وعادة أكبر جزء من نسيج الثدي من حيث الحجم، ويختلف. شريط مقياس: 5 ملم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. المجهرية الأنسجة. (A) صورة حقل مشرق للالمجهرية تربيتها على طبق من مرفق منخفضة لمدة 48 ساعة بعد التفكك الميكانيكية والهضم الأنزيمي. شريط مقياس: 40 ميكرون (B) صورة مجهرية من قسم النسيجي على المجهرية الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الاغاروز والبارافين بعد 3 أيام في.الثقافة. تعرض القسم لتلطيخ المناعى للعلامة ΔNp63 ظهاري عضلي و counterstained مع الهيماتوكسيلين. وتشير النصال إلى الخلايا اللمعية الداخلية، والسهام تشير إلى خلايا عضلية ظهارية ΔNp63 إيجابية. شريط مقياس: 40 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تدفق فرز الخلوي الانفصال وتحليل الحمض النووي الريبي المجهرية الأنسجة. (A) الفصل بين السكان خلية مختلفة من الأنسجة المجهرية تعامل مع R5020 أو الإيثانول عن طريق التدفق الخلوي. تم فصلها المجهرية الأنسجة وimmunodepleted عن الخلايا المناعية، الخلايا الليفية، والخلايا البطانية مع كوكتيل من مكافحة CD45، ومكافحة FAP، وأضداد CD31. وصفت الخلايا مع antiboيموت ضد الظهارية خلية التصاق جزيء (EpCAM) (استنساخ HEA-125) إلى إثراء للسكان خلية اللمعية (الخضراء) والمشتركة الحاد الليمفاوي اللوكيميا مستضد (CD10 / CALLA) للخلايا عضلية ظهارية (استنساخ SS2 / 36). ويرد مبعثر وصمة عار التمثيلية. (B) بار الرسم البياني يظهر النسبية WNT-4 مستويات التعبير مرنا في حيوانية اللمعية من الأنسجة المجهرية (خضراء نقطة سحابة، لوحة A) التي يسببها مع الإيثانول أو R5050 لمدة 24 ساعة. مستويات مرنا التعبير النسبية لهرمون البروجسترون الجين المستهدف، WNT-4 تطبيع ضد مستويات مرنا من-هيبوزانتين جوانين ناقلة الفسفوريبوزيل (HPRT). تمثل البيانات الواردة يعني ± SD من يثلث. وأجريت العزلة RNA وQRT-PCR كما هو موضح سابقا 14. تسلسل التمهيدي: WNT-4: إلى الأمام 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3 "وعكس 5" - ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3 "، HPRT: إلى الأمام 5 <م> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3 "وعكس 5" - CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ثقافة فيفو السابقين الموصوفة هنا يوفر المجهرية أنسجة الثدي تحتوي على قنوات وفصيصات سليمة، جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا الأخرى التي توجد عادة في الإناث الثدي البشري. في تجهيز نسيج الثدي الإنسان عادة ما يتم الحصول عليها من mammoplasties الحد، وإزالة الأنسجة الدهنية، والهضم الميكانيكي والأنزيمي من المصفوفة اللحمية، وتحلل خلايا الدم الحمراء يثري للحليب شظايا لاصق وحدات مفصص الأقنية الطرفية. الهضم الأنزيمي لطيف في تركيز الحق، لمدة الصحيحة ضروري لضمان أن المجهرية الأنسجة لا تزال سليمة، في الحفاظ على أنواع خلايا متعددة والمحافظة إلى حد كبير مصفوفات من خارج الخلية. كما ينبغي إيلاء اهتمام لمعالجة الأنسجة بسرعة إزالة مرة واحدة من المريض. عينات من المرضى تختلف إلى حد كبير، وربما تحتاج الهضم الميكانيكي والأنزيمية أن يكون لفترات طويلة، و / أو يحتاج الانزيم اضافية لتضاف عندما الأنسجة عالية خاصة في المحتوى الكولاجين.

وعلى الرغم من المجهرية لا تزال 90٪ قابلة للحياة لمدة تصل إلى 6 أيام، ونموذج للقيود عن التحفيز الهرمون على المدى الطويل. كما أنواع مختلفة من الخلايا لديها مختلفة حياة نصف، من المرجح أن تتغير مع مرور الوقت تكوين الخلوية. في حين أن الأنسجة المجهرية الحفاظ على اختراق الخلايا المناعية، لم يتم تجديد هذه كما يتم إزالة الأنسجة من التداول في الجسم. وعلاوة على ذلك، لا بد من خط أنابيب الصلب مع الشركاء السريري الذين يقدمون العينات الجراحية كما تحتاج أعداد كبيرة من عينات لتحليلها بسبب الاختلاف المريض أمور. المجهرية الأنسجة يمكن تجميد لاستخدامها لاحقا. ومع ذلك، ما مدى تجميد والذوبان تؤثر على بقاء الخلية، وربما بشكل مختلف لأنواع مختلفة من الخلايا، وكيف أن هذا قد يغير استجابة هرمون، لم يتميز. التخطيط من التجارب يمكن أن يكون صعبا بالنسبة للأي تصغير او تكبير حجم المجهرية الأنسجة التي سيتم الحصول عليها من الصعب أن نتوقع.

"jove_content"> على حد علمنا، يقدم النموذج الحالي خارج الحي النموذج الأول لدراسة عمل الهرمونات فيزيولوجي في الثدي البشري. في حين تم تطوير نظم الاستزراع 3D المتطورة للخلايا الظهارية الثدي الأولي، فإن هذا النظام خارج الحي يحافظ على بنية الأنسجة وتعقيد الخلوي على مدى عدة أيام. ونتيجة لذلك، يمكن تحليل ليس فقط الاستجابة في مستقبلات الهرمونات الخلايا المستهدفة ايجابية ولكن الأحداث المصب من الإشارات نظير الصماوي في أنواع الخلايا الأخرى تصبح قابلة للدراسة. يتم الاحتفاظ المجهرية في النمو خالية من عامل المتوسطة طوال فترة التجارب. وبالتالي، لا يوجد تفعيل خارجي الخلط من أجهزة الطرد المركزي الإشارة. على هذا النحو، والمجهرية أنسجة الثدي توفر إمكانية لمعالجة مسائل في الإعداد الذي يعكس بشكل وثيق تعقيدات بيولوجية من الثدي البشري.

النظام المجراة سابقا يمكن استخدامها لتقييم استجابة من غرفة واحدةالشرق للهرمونات الطبيعية والاصطناعية. وهذا أمر مهم للغاية في ظل وجود تزايد حالات سرطان الثدي. وعلاوة على ذلك، والمخدرات، والجزيئات الصغيرة، والببتيدات، عوامل النمو، والسيتوكينات يمكن تطبيقها ودراستها آثارها على تكاثر الخلايا، والخلايا الإشارات.

والمقصود الوصف التفصيلي الحالي لتسهيل استخدام هذه الطريقة من قبل محققين آخرين وللمساعدة على تقليل التباين مختبر أمور. كما يعتمد هذا النهج على عينات من المرضى، فإنه من الأهمية بمكان أن طريقة موحدة يستخدم ذلك أن النتائج يمكن أن تبدأ في أن تقارن بين المختبرات المختلفة 15 و تقدير أفضل لتقلب المريض أمور يصبح ممكنا. المؤلفين نقدر ردود فعل وسوف نكون سعداء لدمج التحسينات في النسخ المنقحة من هذا البروتوكول. العمل مع العينات البشرية هو صعبة للغاية، ونأمل المؤلفين لتحفيز المزيد من البحوث متعدية مع العينات البيولوجية مثيرة للاهتمام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

الكتاب أشكر M. فيشه من مستشفى جامعة لوزان لتوفير صورة تصغير او تكبير M. يرث وA. Ayyanan من المعهد السويسري لبحوث السرطان التجريبية، المركز الوطني للبحوث في اختصاص علم الأورام الجزيئية، كلية علوم الحياة، مدرسة الفنون التطبيقية الاتحادية لدي لوزان للحصول على المساعدة الفنية وR. كلارك من جامعة مانشستر للحصول على تعليقات حرجة. تلقت الأبحاث الرائدة لهذه النتائج بدعم من SNF3100A0-112090، Oncosuisse 531817، ومبتكرة الأدوية المبادرة المشتركة تعهد بموجب اتفاقية منحة لا. 115188، موارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7 / 2007-2013) والاتحاد الأوروبي للصناعات الدوائية وجمعيات الشركات في المساهمة العينية. عنوان ويب من مبادرة الأدوية المبتكرة هو http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).

Tags

الطب، العدد 95، هرمون الإشارات، وسرطان الثدي تصغير او تكبير الخفض، المجهرية أنسجة الثدي،

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter