Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi har udviklet en ny ex vivo-model til at studere hormon indsats i human bryst. Den er baseret på væv mikrostrukturer isoleret fra kirurgisk bryst vævsprøver, som bevarer væv arkitektur, intercellulære interaktioner, og parakrin signalering.

Abstract

Studiet af hormonvirkning i humane bryst- er blevet hæmmet af manglende passende modelsystemer. Ved in vitro kultur, primære mammaepitelceller tendens til at miste hormon receptor ekspression. Udbredte hormon receptor positiv brystkræft cellelinier er af begrænset relevans for in vivo situation. Her beskriver vi en ex vivo model til at studere hormon indsats i human bryst. Friske humane bryst vævsprøver fra kirurgisk udsmid materiale såsom mammoplasties eller mammectomies reduktion er mekanisk og enzymatisk fordøjet at opnå vævsfragmenter indeholder kanaler og lobules og flere stromale celletyper. Disse væv mikrostrukturer holdes i basalt medium uden vækstfaktorer bevare deres intercellulære kontakter, vævet arkitektur, og forblive hormon lydhør i flere dage. De er let behandles til RNA og protein ekstraktion, histologisk analyse eller opbevares i frysemedium. Fluorescenscellesortering (FACS) kan anvendes til at berige for specifikke cellepopulationer. Denne protokol giver en ligefrem, standard metode til translationelle studier med meget komplekse, varierede humane prøver.

Introduction

Oplysninger om den mutational landskab i brystkræft er stigende på hurtigt tempo. Mindre opmærksomhed er blevet betalt til systemiske faktorer, der påvirker brystkræft udvikling. Udsættelse for reproduktive hormoner har stor indflydelse på sygdomsudvikling 1-3. Alligevel er de mekanismer, som reproduktive hormoner kolliderer med menneskelige bryst dårligt forstået. Arbejde med gensplejsede musemodeller har vist, at de involverer celle iboende og parakrin signalering gennem flere nedstrømseffektorer 4.

Den begrænsede viden om hormon handling i den menneskelige bryst skyldes i høj grad mangel på hensigtsmæssige modeller. Meste arbejde om mekanismerne af østrogen-receptor (ER) og progesteron-receptor (PR) signalering er blevet udført med hormonreceptor positive brystkræft cellelinier, såsom MCF-7 og T47D. Disse blev afledt af pleuraekssudat fra patienter med fremskreden brystcancer, som havde already fik flere behandlinger 5. Den biologiske relevans af resultaterne i sådanne enkle in vitro modeller af den menneskelige bryst er tvivlsomme og målgener identificeret i disse in vitro modeller er forskellige fra målgener, der er identificeret i dyremodeller 6. Når primære humane bryst epiteliale celler dyrkes in vitro de tendens til at miste hormon receptor-ekspression og dermed hormon respons 7,8. Dette problem kan circumventd af avancerede 3D-metoder, der anvender matrigel. På denne måde lykkedes C. Clarke og kolleger oprettelse bryst epiteliale celler, opretholdt hormon receptor-ekspression og viste en proliferativ reaktion på progesteron stimulation 9. Men to vigtige in vivo progesteron receptor målgener, Wnt-4 og RANKL, blev ikke induceret ved progesteron stimulation i dette system 9. Denne fremgangsmåde blev for nylig taget på videre med in vitro 10. En advarsel er, at matrigel har aktiviteter, der er batch-afhængig, er dyre, og kræver et eksperimentelt design, der er velegnet til små celle kun tal.

Baseret på den konstatering, at in vivo-ER og PR-signalering er i høj grad medieret af parakrine interaktioner 11, fremførte vi, at der skal opretholdes intercellulære interaktioner. En anden vigtig faktor, der er tabt som væv dissocieret til enkelte celler til in vitro kultur vekselvirkninger epitelceller med den ekstracellulære matrix; endnu disse er kritiske for epitel differentiering og deres forstyrrelser er vigtig i tumorgenese 12. Med dette i tankerne, vi etableret en metode til at isolere bryst væv mikrostrukturer fra frisk kirurgisk udsmid materiale 13. Bryst parenkym Den består af en to-lags epitel med indvendig luminale og ydre myoepitheliAL-celler, dissekeres væk fra fedtvæv og udsættes for mekanisk og enzymatisk dissociation. Efter vask og centrifugering, er fragmenter af mælkekanaler opnået som bevarer nære interaktioner med mange stromaceller. Disse væv mikrostrukturer forblive hormon lydhør. Modellen blev valideret i kliniske prøver 13. Som sådan kan den nuværende procedure med til at studere hormonvirkning i brystet i en biologisk og klinisk relevant sammenhæng.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Generelle betragtninger: i god tid, der er nedsat en etisk protokol, forberede spørgeskemaer til patienter, og se til at uddanne de kliniske personale. Før du bruger materiale fra reduktion mammoplasty kirurgi, fremskaffe tilladelser, og sikre patientens samtykke. Væv kan være smittefarlige og skal behandles i overensstemmelse hermed. Denne protokol blev godkendt af den etiske komité i ISREC - Swiss Institute for Experimental Cancer Research.

1. Tissue Recovery, forarbejdning og Bio-banking

For at sikre optimal kvalitet prøve for bio-banking, er en række skridt udføres på hospitalet før transporten til laboratoriet.

På hospitalet:

  1. Opnå humane brystvæv under sterile forhold fra reduktion mammoplasty kirurgi og blodprøver, hvis det kræves. Væv skal undersøges af patolog, som vil prøve at udelukke tilstedeværelse af maligne læsioner.
  2. Placer bryst tudstede under kølerhjelmen på en steril bord og forberede saks, kirurgisk skalpel og pincet, som allerede steriliseret med damp sterilisator. Gør dybt snit på forskellige steder i brystvæv under anvendelse af en skalpel for at åbne den. I væv human bryst kigge efter hvide tråde, der består af kanaler og lobules, der er indlejret i gult fedtvæv.
    BEMÆRK: Forholdet mellem den hvide parenkymal til den gule fedtvæv afviger blandt kvinder; typisk yngre kvinder har mere epitelvæv.
  3. Pick stykker hvidt materiale, og hold dem med pincet, så adskille dem forsigtigt fra fedtvæv med en saks. Undgå at tage blodkar.
  4. Skyl vævsstykker i phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,2 til fjernelse af blod. Overfør væv til 250 ml plastflasker med F12-medium (Dulbeccos Modified Eagle Medium F12) uden phenolrødt med 2% penicillin / streptomycin (herunder 5.000 enheder / ml penicillin og 5.000 g / ml streptomycin) og 1% af entibiotic / amphotericin B (herunder 10.000 enheder / ml penicillin, 10.000 pg / ml streptomycin og 25 ug / ml amphotericin B). Opbevar væv i medium for transporten til laboratoriet.
  5. Forbered stykker på 3 - 5 mm diameter til RNA og protein ekstraktion og flash fryse dem i kryoglas med koldt (tøris) isopentan. Overføre dem til tøris kasse til transport til laboratoriet.
  6. Læg stykker på 3 - 5 mm i mug og dække det med et lag af Optimal Cutting Temperatur (OLT) og derefter placere formen på den flade bund kasse fyldt med koldt isopentan. Efter fuldstændig indefrysning overføre formen til den tøris kassen.
  7. Fix 5 stykker af 3 - 5 mm i diameter i paraformaldehyd (PFA) 4% og en anden 5 stykker i formaldehyd (FA) 4% i PBS ved stuetemperatur histologisk analyse senere. To forskellige fikseringsmidler anbefales som nogle antistoffer virker bedre med den ene eller den anden af ​​de to.

I laboratoriet:

  1. Gørecument alle oplysninger om reduktion mammoplasty, er datoen for kirurgi, og om prøverne stammer fra venstre versus højre bryst.
  2. Placer de frosne prøver ved -80 ° C og overføre de faste væv til histologi kassetter efter 2 timer af fiksering. Derefter sætte dem enten i PBS eller 70% ethanol, for O / N opbevaring ved 4 ° C. Den næste dag, overføre histologiske kassetter til histologi faciliteter paraffinindlejring.

2. vævsfordøjelse og Hormonstimulation

  1. Overfør flasker, der indeholder de vævsprøver til en laminar strømning i en P2 cellekultur værelse. Placer væv stykker på steril skærebræt (29 x 19 cm). Hold materialet med pincet og skrabe de resterende fedt og skibe væk fra brystet parenkym (hvide del) med skalpel. Placer hvidt materiale i PBS i en 10 cm dyrkningsskål.
  2. Efter at have fjernet det fedtholdige materiale fra alle stykker og bortskaffe dem i henhold til sikkerheden reglens af laboratoriet, skal du placere de hvide dele, som indeholder de epitelvæv tilbage på skærebræt. Brug modsatrettede skalpeller skære vævet og hak det i stykker på op til 2 mm diameter.
  3. Placer hakket materiale i rør af passende størrelse: op til 1, 2,5 og 10 ml i en 5, 15 eller 50 ml rør, hhv. Typisk en 5 ml rør udbytter nok materiale til paraffin indstøbning og hormonstimulationer, og et 15 ml rør udbytter nok materiale til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Større rør anvendes til frysning portioner.
  4. Forbered fordøjelsen mester mix bestående af medium (DMEM / F12 uden phenolrødt) med 1% penicillin / streptomycin / amphotericin B og collagenase A (Clostridiopeptidase A fra Clostridium histolyticum). Dosis collagenase ifølge fordøjelse gange.
    1. Til 12, 24 og 36 timers inkubation bruge slutkoncentration af collagenase af 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml og 0,5 mg / ml. Tilføj fordøjelse masterblanding op til 4 gange ivolumen af ​​det fordøjede materiale for at sikre tilstrækkelig omrøring og beluftning.
      BEMÆRK: Afhængigt af den eksperimentelle design og varigheden af ​​hormonstimulation, tilføje hormoner enten under eller efter den enzymatiske fordøjelse trin og mikrostruktur opsving.
  5. Tilføj hormon (r) ved ønskede koncentration til at teste prøver og køretøjet til kontrol. For stimulering med 17-β-estradiol og promegeston (R5020) anvender en endelig koncentration på 20 nM.
    BEMÆRK: R5020 er et syntetisk progesteron receptor agonist, som er mere stabil end naturligt progesteron i medium.
    1. Rørene anbringes på rulleblander inde i en inkubator ved 37 ° C og 40 rpm O / N. Før prøverne på mixeren, resuspenderes dem meget godt for at sikre, at alt materiale fordeler langs centrifugerør.
  6. Som fordøjelsen tager mindst 12 timer (O / N), for hormonstimulation på mindre end 12 timer, skal du tilføje de hormoner efter helbredelse af mikrostrukturer (detailed under trin 3). Tilføj de hormoner, som du opblande mikrostrukturer og placer suspensionen på ultralave vedhæftede plader. Tissue mikrostrukturer kan holdes på ultralave vedhæftede plader til op til 7 dage i vækst-faktor-frit medium bevare omkring 70% levedygtighed.
  7. For RNA og protein analyse, indsamle væv mikrostrukturer ved centrifugering ved 400 xg i 5 minutter og flash fastfrysning centrifugerør.

3. Inddrivelse af væv Mikrostrukturer

  1. Centrifugeres røret (s) ved 400 xg i 5 min. Aspirer fedt fra toppen af ​​centrifugerøret og overføre supernatanten af ​​den resterende vandige supernatant, som er beriget i fibroblaster, til et nyt centrifugerør og centrifugeres ved 1.250 xg i 5 min.
    BEMÆRK: Da brystvæv mikrostrukturer er meget klistret, for alle efterfølgende trin pellet resuspenderes ved forsigtigt omrøring af røret. Pipettering anbefales ikke på grund af risikoen for at miste materiale. Resuspender pellets beriget med mikrostrukturer og i fibroblaster afledt fra vandig supernatant i PBS, 2% føtalt kalveserum (FCS). Efterfølgende dreje begge rør ved 1.250 xg i 5 minutter og derefter kassere supernatanterne.
  2. Resuspender pillerne i 3-5 ml røde blodlegemer i blodet lysisbuffer og overføre dem til at rense rør. Inkuber dem i 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Tilføj 2x volumen af ​​PBS, 2% FCS og centrifugere dem på 1.250 xg i 5 min. Vask pellets med PBS, 2% FCS og centrifugeres ved 1.250 xg i 5 min. Gentag dette trin to gange.

4. Prøver til flowcytometri

  1. Tilføj 1 - 2 ml trypsin 0,25% til pelleten, og bland ved at pipettere op og ned meget forsigtigt i 2 minutter med en 1.000 pi Pipetman at dissociere celler.
  2. Inhibit trypsin-aktivitet ved tilsætning af 9 ml PBS, 2% FCS. Centrifuger ved 450 xg i 5 min, og pellet resuspenderes i 10 ml PBS, 2% FCS.
  3. Overfør cellesuspensionen på en 40 um cellefilter placeret på top af en 50 ml centrifugerør til fremstilling enkeltceller. Hvis et par mikroliter cellesuspension forblive på toppen af ​​filteret, hjælpe dem passere gennem filteret ved sugning dem fra den anden side af si med en pipette og tilføje dem til de filtrerede mikrostrukturer.
  4. Separate immunceller, fibroblaster og endotelceller fra mikrostrukturer med en cocktail af anti-CD45, anti-FAP og anti-CD31 antistoffer og derefter sortere dem med FACS baseret på pan-epiteliale markør EpCAM og CD10 til at adskille luminale og basale celler henholdsvis 10 .

5. Prøver til histologi

  1. Efter vask af mekanisk og enzymatisk fordøjet materiale som beskrevet ovenfor, fastsætte pellets fra 1,5 ml udgangsmateriale i 1 ml 4% PFA i PBS ved stuetemperatur i 30 min.
  2. Centrifuger ved 1.250 x g i 5 minutter og vask med 1 - 2 ml PBS to gange.
  3. Centrifuger ved 16.000 xg i 10 min. I løbet af denne tid, forberede 1% multi-purpose agarose i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer og opvarme opløsningen i mikrobølgeovnen, indtil opløsningen kommer i kog.
    1. Fjern opløsningen fra mikrobølgeovnen, og kolben bland forsigtigt for at blande opløsningen og resuspender eventuelle resterende agarose partikler. Cool agaroseopløsning til 50 ° C og hæld 1 ml i en paraffinbasisolie støbeform størrelse 31 × 23 × 13,5 mm.
  4. Supernatanten fjernes, og placere pellets oven på den størknede lag (1 - 3 mm) af agarose anvendelse af en spatel med en flad ende. Dække dem alle med et ekstra lag af agarose (40 ° C).
  5. Efter agarose størkner, normalt inden for 5 min, satte agarose blokke i histologiske kassetter til paraffin indstøbning. Sammen med agarose prøverne placerer en hvid kontor papir i kassetten med alle oplysninger om reduktion mammoplasty nummer, eksperimentel tilstand, og dato skrevet med små bogstaver i blyant; dette skrives tåler alle efterfølgende behandlingstrin.
  6. Sæt kassetterne iPBS O / N, eller i 70% ethanol til opbevaring i weekenden, ved 4 ° C. Vi har ikke bemærket nogen forskel mellem de to opbevaringsløsninger. Derefter overføre histologiske kassetter til histologi faciliteter paraffinindlejring.

6. Frysning Mikrostrukturer (Future Kulturcenter)

  1. Resuspender væv mikrostrukturer i frysning medium bestående af FCS med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) og fryse 1 ml alikvoter i kryoglas. Antallet af opnåede kryoglas afhænger af mængden af ​​primært materiale fra reduktion mammoplasty.
  2. Frys kryoglas indeholdende væv mikrostrukturer ved hjælp af en styret hastighed fryser med følgende program: 5 min bolig ved 4 ° C, faldende temperatur til -7 ° C med en hastighed på 6 ° C / min, sænkning af temperaturen til -12 ° C med hastighed på 6 ° C / min, 10 min bolig, sænkning af temperaturen til -40 ° C med en hastighed på 6 ° C / min, faldende i temperatur til -80 ° C medhastighed på 6 ° C / min. Derefter overføre kryoglas til -80 ° C fryser.
  3. Næste dag, overføre kryoglas fra -80 ° C til flydende nitrogen tank til lang tids opbevaring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undersøge den rolle, østrogener og progesteron og for bedre at forstå deres molekylære funktioner i den menneskelige bryst, vi indsamler friske humane bryst vævsprøver fra patienter, der gennemgår reduktion mammoplasties (figur 1) efter at have opnået deres informerede samtykke. Vi har også opnå patienters og reproduktiv historie samt en blodprøve for at bestemme serum progesteron niveauer på tidspunktet for kirurgi. Væv fra friske reduktion mammoplasties er mekanisk og enzymatisk dissocieret. De resulterende væv mikrostrukturer har kanaler og lobules karakteristiske for brystvæv af oprindelse (figur 2A). Immunohistokemisk analyse af agarose og paraffinindlejrede væv mikrostrukturer farvet for myoepithelial markør ΔNp63 (figur 2B) afslører, at mikrostrukturer bevarer ikke kun de morfologiske karakteristika normalt brystvæv, men også den molekylære profil cell befolkninger.

For at vurdere hormon respons blev væv mikrostrukturer behandlet med enten syntetisk progesteron receptor agonist promegeston (R5020) eller ethanol kontrol. For at berige for hormonreceptorpositiv luminale celler flowcytometri blev udført baseret på epitel (EpCAM) og myoepithelial markør (CALLA; figur 3A) efter depletering for endotel, fibroblaster og immunceller med en cocktail af anti CD31, anti-FAP og anti- CD45 antistoffer. QRT-PCR-analyse af EpCAM +, CD10- celler viste opregulering af progesteron målgenet Wnt-4 (figur 3B) i den luminale celle beriget population fra R5020 eksponerede væv mikrostrukturer.

Figur 1
Figur 1. brystvæv prøve. Fotografi af frisk dissekeret reduktion mammoplasty prøve. Pile pegertil hvide væv tråde, der indeholder brystet parenkym, dvs, mælk kanaler og terminale duktale luftrør enheder. Indlejret i rigelige gul fedtvæv. Mens farven på fedt gør, er i overensstemmelse mellem patienter, andelen af ​​fedtvæv, normalt den største del af brystvæv mængdemæssigt, varierer. Scale bar:. 5 mm Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Tissue mikrostrukturer. (A) Bright felt billede af mikrostrukturer dyrket på et lavt fastgørelsesplade i 48 timer efter mekanisk dissociering og enzymatisk fordøjelse. Scale bar: 40 pm (B) Micrograph af et histologisk snit på væv mikrostrukturer indlejret i agarose og paraffin efter 3 dage i.kultur. Afsnittet blev underkastet immunhistokemisk farvning for myoepithelial markør ΔNp63 og modfarvet med hematoxylin. Pilespidser peger på de indre luminale celler, pilene peger på ΔNp63 positive myoepitelcellerne. Scale bar:. 40 pm Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Flowcytometri sortering separation og RNA-analyse af væv mikrostrukturer. (A) adskillelse af de forskellige cellepopulationer fra væv mikrostruktur behandlet med R5020 eller ethanol ved flowcytometri. Tissue mikrostrukturer blev dissocieret og immundepleteret for immunceller, fibroblaster og endotelceller med en cocktail af anti-CD45, anti-FAP, og anti-CD31 antistoffer. Celler blev mærket med Antibodør mod epitelcelleadhæsionsmolekyle (EpCAM) (klon HEA-125) for at berige for den luminale cellepopulation (grøn) og fælles akut lymfoblastisk leukæmi-antigen (CD10 / CALLA) for myoepitelcellerne (klon SS2 / 36). En repræsentativ scatter blot vises. (B) Bar graf, der viser relative Wnt-4 mRNA-ekspression niveauer i den luminale delpopulation fra væv mikrostrukturer (grøn prik sky, panel A) induceret med ethanol eller R5050 i 24 timer. Relative mRNA ekspressionsniveauer af progesteron målgenet, Wnt-4 normaliseret mod mRNA-niveauer af hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (HPRT). De viste data repræsenterer middelværdien ± SD af tredobbelte. RNA-isolering og QRT-PCR blev udført som beskrevet tidligere 14. Primersekvenser: Wnt-4: frem 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' og reverse 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT: fremad 5 <em> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' og omvendt 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den ex vivo kultur beskrevet her tilvejebringer brystvæv mikrostrukturer indeholdende intakte kanaler og lobules, sammen med andre celletyper, der normalt findes i den humane kvindelige bryst. I behandlingen af ​​brystvæv menneske normalt fra reduktion mammoplasties, fjernelse af fedtvæv, mekanisk og enzymatisk fordøjelse af stromale matrix, og lyse af røde blodlegemer beriger for mælk ventilationskanal fragmenter og terminale duktale luftrør enheder. Gentle enzymatisk nedbrydning på det rigtige koncentration, for den rigtige varighed er afgørende for at sikre, at væv mikrostrukturer forbliver intakt, fastholde flere celletyper og stort set bevare deres ekstracellulære matricer. Man bør også være opmærksom på behandlingen af ​​vævet hurtigt når fjernes fra patienten. Patientprøver varierer betydeligt og mekanisk og enzymatisk fordøjelse kan være nødvendigt at blive forlænget, og / eller ekstra enzym skal tilføjes, når vævet er særlig høj i kollagen indhold.

Selvom mikrostrukturer forbliver 90% levedygtige i op til 6 dage, modellen har begrænsningerne for langsigtede hormonstimulationer. Da forskellige celletyper har forskellige halveringstider, den cellulære sammensætning er sandsynligvis ændre sig over tid. Mens væv mikrostrukturer bevare infiltrerende immunceller, er disse ikke genopfyldes som væv fjernes fra kroppen kredsløb. Desuden er en solid pipeline med de kliniske partnere, som leverer de kirurgiske prøver kræves som skal analyseres på grund af inter variation patient stort antal prøver. Tissue mikrostrukturer kan fryses til senere brug. Men i hvilket omfang nedfrysning og optøning påvirker cellelevedygtighed, eventuelt differentielt for forskellige celletyper, og hvordan dette kan ændre hormon reaktion, er ikke blevet karakteriseret. Planlægning af eksperimenter kan være svært som for enhver mammoplasty mængden af ​​væv mikrostrukturer, der vil blive opnået er svært at forudse.

ex vivo model den første model til at studere fysiologisk hormon indsats i human bryst. Mens avancerede 3D ​​dyrkningssystemer til primær bryst epiteliale celler er blevet udviklet, denne ex vivo systemet bevarer vævet arkitektur og dets cellulære kompleksitet over flere dage. Som et resultat heraf kan ikke kun respons i hormonreceptor positive målceller analyseres men de begivenheder nedstrøms for parakrin signalering i andre celletyper bliver modtagelig for at studere. De mikrostrukturer holdes i vækstfaktor-frit medium i hele varigheden af ​​eksperimenterne. Derfor er der ingen confounding ydre aktivering af signaleringskaskader. Som sådan brystvæv mikrostrukturer tilbyde muligheden for at behandle spørgsmål i en indstilling, der afspejler i højere grad de biologiske kompleksiteten i menneskets bryst.

Den ex vivo kan anvendes til at vurdere respons brøst for naturlige og syntetiske hormoner. Dette er meget vigtigt i lyset af en stigende forekomst af brystkræft. Endvidere kan lægemidler, små molekyler, peptider, vækstfaktorer og cytokiner anvendes, og deres indvirkning på celleproliferation, apoptose og signalering blive undersøgt.

Den nuværende detaljerede beskrivelse er beregnet til at lette anvendelsen af ​​denne metode med andre forskere og til at hjælpe med at minimere inter laboratorium variation. Da denne metode er afhængig af patientprøver, er det af største vigtighed, at en standardiseret metode bruges, så resultaterne kan begynde at sammenligne mellem forskellige laboratorier 15 og en bedre forståelse af inter patient variabilitet bliver mulig. Forfatterne værdsætter feedback og vil være glade for at integrere forbedringer i reviderede udgaver af denne protokol. Arbejdet med humane prøver er meget udfordrende, og forfatterne håber at stimulere mere translationel forskning med interessante biologiske prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker M. Fiche af University Hospital of Lausanne for at give mammoplasty fotografi, M. Wirth og A. Ayyanan af Swiss Institute for Experimental Cancer Research, Det Nationale Center for Kompetence i forskning Molecular Oncology, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne til faglig bistand og R. Clarke fra University of Manchester til kritiske bemærkninger. Den forskning, der fører til disse resultater har fået støtte fra SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, og initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende i henhold tilskudsaftale nej. 115.188, ressourcer der består af finansielle bidrag fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) og European Federation of Pharmaceutical Industries og foreninger virksomheder «i naturalier bidrag. Webadressen på initiativet om innovative lægemidler er http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).

Tags

Medicine Hormone signalering brystcancer reduktion mammoplasty brystvæv mikrostrukturer, østrogen progesteron mammae epitelceller vævsfordøjelse parakrin signalering mikromiljø vævsarkitekturen

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model til Uddannelse hormonvirkning i Human Breast
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter