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Summary
私たちは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するための新規のex vivoモデルを開発した。これは、組織構造、細胞間相互作用、およびパラクリンシグナル伝達を維持する外科乳房組織標本から単離された組織の微細構造に基づいている。
Abstract
ヒト乳癌におけるホルモン作用の研究は、適切なモデル系の欠如によって妨げられてきた。 インビトロ培養の際に、一次乳房上皮細胞は、ホルモン受容体の発現を失う傾向がある。広く使用され、ホルモン受容体陽性乳癌細胞株は、in vivoの状況に限定関連のものである。ここでは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するためのex vivoモデルを記述。このような還元mammoplastiesまたはmammectomiesなどの外科廃棄材料からの新鮮なヒト乳房組織標本は、機械的および酵素的に管と小葉及び複数間質細胞タイプを含む組織断片を得るために消化される。これらの組織の微細構造は、それらの間の接触を維持する成長因子を含まない基礎培地中で組織構造を保持し、数日間のホルモン応答性のままである。それらは容易にRNAおよびタンパク質抽出、組織学的分析のために処理または凍結培地中に保存されている。蛍光活性化セルソーティング（FACS）は、特定の細胞集団を濃縮するために使用することができる。このプロトコルは、非常に複雑、多様なヒト検体との翻訳研究のための簡単な、標準的なアプローチを提供します。
Introduction
乳癌における突然変異景観に関する情報は、急速に増加している。以下の注意は、乳癌の発達に影響を与える全身性因子が注目されている。生殖ホルモンへの曝露は、疾患の進行1-3に大きな影響を与えます。しかし、生殖ホルモンはヒト乳房に衝突するメカニズムはよく理解されていない。遺伝子操作したマウスモデルとの仕事は、彼らがいくつかの下流エフェクター4を介して細胞内因性および傍分泌に関与することを明らかにした。
ヒト乳癌におけるホルモン作用についての限られた知識は、適切なモデルの欠如に主に起因している。エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）のシグナル伝達のメカニズムのほとんどの作業は、MCF-7およびT47Dなどのホルモン受容体陽性乳癌細胞株を用いて行われた。これらはalreaいた進行乳癌患者からの胸膜滲出液由来したDYは、複数の治療法5を受け取った。ヒト乳房のような単純なin vitroモデルにおける知見の生物学的関連性は、これらのin vitroモデルで識別さ疑わしいとターゲット遺伝子である動物モデル6で識別された標的遺伝子とは異なります。初代ヒト乳房上皮細胞は、インビトロで培養される場合、それらは、ホルモン受容体の発現、したがって、ホルモン応答7,8を失う傾向がある。この問題は、マトリゲルを使用して洗練された3Dアプローチによってcircumventdすることができます。このように、C·クラークらは、ホルモン受容体の発現を維持し、プロゲステロン刺激9に対する増殖応答を示した乳房上皮細胞を樹立することに成功した。しかし、 生体内プロゲステロン受容体標的遺伝子において重要な二つのWnt-4、RANKL、このシステム9プロゲステロン刺激により誘導されなかった。このアプローチは、最近、 インビトロでさらに上に撮影された10を達成した。注意点は、マトリゲルはバッチに依存している活動があることに変わりは高価であり、わずかな細胞数のためになりやすい実験計画を要求する。
インビボでの ERおよびPRシグナル伝達に主としてパラクリン相互作用11によって媒介されるという知見に基づいて、我々は、細胞間相互作用が維持される必要があると主張した。組織は、インビトロ培養のために単一細胞に解離されると失われたもう一つの重要な要因は、細胞外マトリックスと上皮細胞との相互作用である。まだこれらは、上皮分化のために重要であり、その破壊は、腫瘍形成において重要である12。これを念頭において、私たちは新鮮な外科廃棄材13から乳房組織の微細構造を分離する方法を確立した。インナー腔側と外側myoepitheliで二層上皮からなる乳房実質、らの細胞は、脂肪組織から離れて切開し、機械的および酵素的解離に供される。洗浄および遠心分離後、乳管の断片は、多くの間質細胞との密接な相互作用を維持することが求められる。これらの組織の微細構造は、ホルモン応答残る。モデルは、臨床検体13に検証されました。このように、本手順では、生物学的および臨床的に関連する文脈において乳癌におけるホルモン作用を研究するために助けることができる。
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Protocol
一般的な考慮事項：前もって、倫理プロトコルを設定するには、患者のためのアンケートを作成し、臨床的な人材の育成に参照してください。削減乳房形成手術から材料を使用する前に、権限を調達し、患者の同意を確保する。組織は、感染し、それに応じて処理する必要があります。実験的癌研究スイス研究所 - このプロトコルはISRECの倫理委員会によって承認された。
1.組織の回復、加工、バイオバンキング
バイオバンキングのための最適なサンプルの品質を確保するために、ステップの数は、実験室に輸送する前に病院で行われる。
病院で：
- 必要であれば、縮小乳房形成術および血液試料から無菌条件下で、ヒト乳房組織を得る。組織は、悪性病変の存在を除外するサンプリングする病理学者によって検査される必要がある。
- 胸tを置きます無菌のボード上のボンネットの下に発行し、はさみ、外科用メス、すでに蒸気滅菌器で滅菌されたピンセットを準備します。それを開くためにメスを用いて乳房組織の異なる部位で深いカットを行います。黄色の脂肪組織中に埋め込まれている管および小葉からなる白色ストランド、ヒトの乳房組織の外観である。
注：黄色の脂肪組織に白の実質の比率は、女性の間で異なっている。一般的に若い女性がより多くの上皮組織を持っている。 - その後はさみで脂肪組織から優しくそれらを分離、白い材料片を選び、鉗子でそれらを保持する。血管を取ることは避けてください。
- 血液を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.2で組織片をリンスする。と1％のAN（5000単位/ mlのペニシリンおよび5000グラム/ mlのストレプトマイシンを含む）2％ペニシリン/ストレプトマイシンとフェノールレッドを含まないF12培地（ダルベッコ改変イーグル培地F12）を含む250ミリリットルのペットボトルに組織を転送tibiotic /アンホテリシンBは、（10,000単位/ mlのペニシリン、ストレプトマイシン10,000 / mlの、およびアムホテリシンB25μg/ mlを含む）。研究室への輸送のための媒体で保管して組織。
- 冷たい（ドライアイス）イソペンタンでクライオバイアルでそれらを凍結するRNAとタンパク質の抽出およびフラッシュ用の直径5mm - 3の部分を準備します。研究室への輸送のためにドライアイスボックスに転送する。
- 金型には5mmと最適切削温度（OCT）の層でそれをカバーして、冷たいイソペンタンで満たされた箱の平らな底に金型を配置 - 3のピースを置く。完全な凍結後にドライアイスボックスに金型を転送する。
- ホルムアルデヒド中でパラホルムアルデヒドで直径5mm（PFA）4％と、他の5個（FA）後でRT組織学的分析では、PBS中4％ - 3の5作品を修正する。いくつかの抗体は、より良い1つまたは2つの相互に働くように、2つの異なる固定剤を推奨します。
研究室では：
- やる、削減乳房形成に関するすべての情報をcument手術日とサンプルが右乳房対左から派生しているかどうか。
- -80℃で凍結サンプルを配置し、固定の2時間後に組織学カセットに固定した組織を移す。その後、4℃でO / N保存のために、PBS中70％エタノールのいずれかに置く。翌日、パラフィン包埋のため組織学施設に組織学カセットを転送する。
2.組織消化とホルモン刺激
- P2の細胞培養室で層流キャビネットに組織サンプルを含むボトルに移す。無菌のまな板（29×19 cm）の上の組織片を置きます。鉗子で材料を保持し、メスで離れて乳房実質（白い部分）から残りの脂肪と血管をこすり。 10cmの培養皿にPBSに白色物質を配置します。
- すべての部分からの脂肪物質を除去し、安全性の規則に従って、それらを配置した後研究室のSは、バックチョッピングボード上の上皮組織を含む白色パーツを配置。対向するメスを使用して、組織を切断し、最大直径2mmの断片に切る。
- 適切なサイズのチューブにみじん切り素材を配置：1、2.5及び10ミリリットルまでを5、15または50ミリリットルチューブに、それぞれ。典型的には、5 mlチューブ利回り十分なパラフィン埋め込みやホルモンの刺激のための材料、および蛍光活性化細胞のための15ミリリットルチューブ利回り十分な材料選別（FACS）。より大きなチューブは分量を凍結するために使用されている。
- 1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンBおよびコラゲナーゼA（ ヒストリチクス菌からClostridiopeptidase A）と培地からなる消化マスターミックス（フェノールレッドなしのDMEM / F12）を準備します。消化時間に応じてコラゲナーゼ線量。
- 12、24、インキュベーションの36時間、1.5 mg / mlで、1.0 mg / mlのおよび0.5mg / mlのそれぞれのコラゲナーゼの最終濃度を使用する。の4倍に消化マスターミックスを加える消化された材料の量は、十分な攪拌と通気を確保する。
注：実験計画とホルモン刺激の継続期間に応じて、中または酵素消化工程および微細構造回復後のいずれかのホルモンを追加します。
- 12、24、インキュベーションの36時間、1.5 mg / mlで、1.0 mg / mlのおよび0.5mg / mlのそれぞれのコラゲナーゼの最終濃度を使用する。の4倍に消化マスターミックスを加える消化された材料の量は、十分な攪拌と通気を確保する。
- サンプルおよびコントロールの車両をテストするために所望の濃度でホルモン（複数可）を追加する。 17-βエストラジオール、及びプロメゲストン（R5020）による刺激のために20nmの最終濃度を使用しています。
NOTE：R5020培地中の天然プロゲステロンよりも安定である合成プロゲステロン受容体アゴニストである。- 37℃のインキュベーターと40 rpmでO / N内部のローラーミキサー上に置きチューブ。ミキサーでサンプルを配置する前に、すべての物質が遠心管に沿って分散していることを確実にするために非常によく再懸濁します。
- 消化は12未満の時間のホルモン刺激の回で少なくとも12時間（O / N）をとるように、（微細構造の回復の後にホルモンを追加するデステップ3の下につかれた）。あなたは微細構造を再懸濁し、超低付着プレートにサスペンションを置くようにホルモンを追加します。組織の微細構造は、約70％の生存率を維持する成長因子を含まない培地中で7日間までの超低付着プレートに保つことができる。
- RNAおよびタンパク質分析のために、遠心分離管中で5分間フラッシュ凍結、400×gで遠心分離することによって、組織の微細構造を集める。
組織微細構造の3回復
- 5分間400×gでチューブ（単数または複数）を遠心する。遠心管の上部から脂肪を吸引し、5分間1250×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に、線維芽細胞が濃縮され、残った水性上清、上清を移す。
注：以降のすべてのステップが軽くチューブを攪拌することによってペレットを再懸濁するために乳房組織の微細構造は、非常に粘着性であるので。ピペッティングは、材料を失うリスクにはお勧めしません。 微細構造およびPBS、2％ウシ胎児血清（FCS）、水性上清由来の線維芽細胞に富むペレットを再懸濁する。その後5分間1250×gで両方の管を回転した後、上清を捨てる。 - 3にペレットを再懸濁 - 5mlの赤血球血液溶解緩衝液チューブを洗浄するためにそれらを転送する。室温で5分間のためにそれらをインキュベートします。
- PBS、2％FCSの2倍のボリュームを追加し、5分間1250×gで、それらを遠心する。 5分間1250×gでPBS、2％FCSおよび遠心機でペレットを洗ってください。二回、この手順を繰り返します。
フローサイトメトリー用4.サンプル
- ペレットに0.25％トリプシン2ミリリットル、細胞を解離するために千μlのピペットマンで2分間非常に優しく上下にピペッティングすることによって、それをミックスして - 1を追加します。
- 9ミリリットルPBS、2％FCSを添加することにより、トリプシン活性を阻害する。 5分間450×gで遠心分離し、10mlのPBS、2％FCS中でペレットを再懸濁。
- トンに置か40μmのセルストレーナー上に細胞懸濁液を転送単一の細胞を調製するための50mlの遠心分離管のオペアンプ。細胞懸濁液を数マイクロリットルのフィルターの上部に残っている場合、それらは、ピペットでストレーナの反対側からそれらを吸引することにより、フィルタを通過し、濾過した微細構造に追加助ける。
- その後、別個の免疫細胞、抗CD45のカクテルを微細構造からの線維芽細胞および内皮細胞、抗FAPおよび抗CD31抗体とは、それぞれ、10管腔、基底細胞を分離するための汎上皮マーカーのEpCAMおよびCD10に基づいて、FACSで並べ替える。
組織学のために5.サンプル
- 上記のように機械的および酵素的に消化された物質を洗浄した後、室温で30分間PBS中の4％PFAを1mlの1.5ミリリットル初期材料からペレットを固定する。
- 5分間1250×gで遠心分離し、および1で洗浄する - 二回2mlのPBS。
- 10分間16000×gで遠心分離する。この間、トリス - 酢酸-EDTA（1％多目的アガロースを準備TAE）の緩衝液溶液が沸騰になるまで電子レンジで溶液を加熱する。
- 電子レンジから溶液を除去し、溶液を混合し、残りのアガロース粒子を再懸濁させ軽くフラスコを旋回。 50℃に冷却し、アガロース溶液及びパラフィンベースモールド1mlのを注ぐ31×23×13.5ミリメートルの大きさ。
- 上清を捨て、固化層の上にペレットを配置 - フラットエンドとのへらを用いてアガロースの（1〜3ミリ）。アガロースの追加層（40℃）でそれらすべてをカバーしています。
- アガロースが固化した後、通常は5分以内で、パラフィン埋め込みのための組織学カセットにアガロースブロックを配置。サンプルは、鉛筆の小さな文字で書かれた削減乳房形成数、実験条件、および日付に関するすべての情報をカセットに白い事務用紙を置き、アガロースとともに。この書き込みは、以降のすべての処理工程に耐える。
- にカセットを入れてPBS O / N、または4℃で週末の保存のために70％エタノール中。我々は2つのストレージ·ソリューションとの間に何の違いも気づいていない。そして、パラフィン包埋のために組織学施設に組織学カセットを転送する。
6.凍結微細構造（今後の培養）
- 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）にFCSからなるとクライオバイアル内の1mLのアリコートを凍結する凍結培地中に再懸濁し、組織の微細構造。得られたクライオバイアルの数が削減乳房形成から得られた一次材料の量に依存します。
- 以下のプログラムを用いて制御された速度の冷凍庫を使用して、組織の微細構造を含むクライオバイアルを凍結：5分でC -12℃に温度を下げ、6℃/分の速度で-7℃の温度を下げ、4℃で住居6℃/分、10分住居の速度、6℃/分の速度で-40℃まで温度を下げて-80℃に温度を下げる6℃/分の速度。その後、Cの冷凍庫-80℃に凍結バイアルを転送します。
- 翌日、長期保存のために液体窒素タンクに-80℃からクライオバイアルを移す。
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Representative Results
エストロゲンとプロゲステロンの役割を研究するために、より良いヒト乳癌におけるそれらの分子の機能を理解するために、我々は彼らのインフォームドコンセントを得た後に、還元mammoplasties（ 図1）を受けた患者から新鮮なヒト乳房組織標本を収集します。また、手術時の血清プロゲステロンのレベルを決定するために、患者の医学的および出産歴、ならびに血液サンプルを得た。新鮮な削減mammoplastiesからの組織を機械的および酵素的に解離する。得られる組織の微細構造は、原点（ 図2A）の乳房組織の特性管および小葉を持つ。筋上皮マーカーΔNp63（ 図2B）について染色したアガロースおよびパラフィン包埋組織の微細構造の免疫組織化学的分析は、微細構造は、正常な乳房組織の形態学的特徴だけでなく、セルの分子プロフィールだけでなく、保持することを明らかにしたL集団。
ホルモン応答を評価するために、組織の微細構造は、合成プロゲステロン受容体アゴニストプロメゲストン（R5020）またはエタノール対照のいずれかで処理した。ホルモン受容体を濃縮するためにポジティブ腔細胞フローサイトメトリー上皮（のEpCAM）と筋上皮マーカーに基づいて実施された;抗CD31、抗FAPとのカクテル内皮、線維芽細胞および免疫細胞のための枯渇後（CALLA 図3A）抗CD45抗体。 R5020は、組織の微細構造を露出してからのEpCAM +の定量RT-PCR分析は、CD10-細胞が管腔細胞富化集団におけるプロゲステロン標的遺伝子のWnt-4（ 図3B）のアップレギュレーションを示した。
たての解剖削減乳房形成サンプル図1.乳房組織標本。写真。矢印ポイント乳房実質、 すなわち、乳管と端末乳管小葉単位を含有する白組織ストランドへ。豊富な黄色の脂肪組織内に埋め込まれた。脂肪の色は患者間で一貫していないが、脂肪組織の割合は、体積換算で乳房組織の一般的に大部分は、変化する。スケールバー：5ミリメートル、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.組織の微細構造。 （A）微細構造の明視野像は、機械的解離し、酵素消化後の48時間、低付着性プレートに培養した。スケールバー：40μmのアガロース、パラフィンに包埋された組織の微細構造上の組織切片の（B）の顕微鏡写真で3日後文化。セクションでは、筋上皮マーカーΔNp63ための免疫組織化学染色を施し、ヘマトキシリンで対比した。矢印の頭が内側、管腔細胞を指し、矢印はΔNp63ポジティブ筋上皮細胞を指す。スケールバー：40μmのこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3のフローサイトメトリー分離および組織微細構造のRNA分析をソート。 （A）フローサイトメトリーR5020またはエタノールで処理した組織の微細構造とは異なる細胞集団の分離。組織の微細構造は解離し、免疫細胞、線維芽細胞、および抗CD45、抗FAP、および抗CD31抗体のカクテルと内皮細胞のために免疫除去した。細胞をantiboで標識した管腔細胞集団（緑）、筋上皮細胞の一般的な急性リンパ芽球性白血病抗原（CD10 / CALLA）（クローンSS2 / 36）を濃縮するために上皮細胞接着分子（EpCAMを）（クローンHEA-125）に対して死ぬ。代表的な散布ブロットを示す。（B）棒グラフは、24時間、エタノールまたはR5050を用いて誘導された組織の微細構造（緑色ドットクラウド、パネルA）から管腔亜集団の相対的なWnt-4の mRNA発現レベルを示す。ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）のmRNAレベルに対して正規化プロゲステロン標的遺伝子は、Wnt-4の相対的なmRNA発現レベル。示したデータは、三重の平均±SDを表す。先に説明したように14 RNA単離および定量RT-PCRを行った。プライマー配列： のWnt-4：フォワード5 ' - GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3'及びリバース5 ' - ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3'、HPRT：フォワード5 <EM> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3'およびリバース5 ' - CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するのex vivo培養は、通常、ヒト女性の胸肉で見つかった他の細胞型と一緒に、完全な管および小葉を含む乳房 組織の微細構造を提供しています。ヒト乳房組織の処理では、通常の還元mammoplasties、脂肪組織の除去、間質マトリックスの機械的および酵素的消化から得られ、そして赤血球の溶解は、乳管フラグメントおよび端子乳管小葉単位富化。右の存続期間のための右の濃度で穏やかに酵素消化は、組織微細構造はそのまま残ることを保証する複数の細胞型を保持し、大部分はそれらの細胞外マトリックスを維持することが不可欠である。注意はまたすぐに一度、患者から除去された組織を処理するに支払われるべきである。患者サンプルは、実質的に変化し、機械的および酵素的消化を長くする必要があるかもしれない、および/または組織は、コラーゲン含有量が特に高いときに余分な酵素を添加する必要がある。
微細構造は、最大6日間の90％生存したままであるが、このモデルは、長期的なホルモン刺激のために限界がある。異なる細胞タイプは、異なる半減期を有するように、細胞組成物は、時間とともに変化する可能性がある。組織の微細構造が免疫細胞浸潤保持しながら、組織は、体の循環から除去されると、これらは補充されない。多数のサンプルがあるため、患者間の変動を分析する必要があるように、また、手術標本を提供する臨床パートナーと固体パイプラインが必要である。組織の微細構造は、後で使用するために凍結することができる。しかし、どの程度凍結融解は、異なる細胞型のために差次おそらく、細胞生存率に影響し、これはどのようにホルモン応答を変化させることができるし、特徴付けられていない。得られる組織の微細構造の量を予測することは困難である任意の乳房形成の場合と同様の実験を計画することは困難であることができる。
のex vivoモデルは、ヒト乳癌における生理的なホルモン作用を研究するための最初のモデルを提示します。原発性乳房上皮細胞のための洗練された3次元培養系が開発されてきたが、このエキソビボシステムは、数日間にわたる組織構造およびその細胞の複雑さを維持する。結果として、ホルモン受容体陽性標的細胞における応答だけでなく分析することができるが、他の細胞型における下流パラクリンシグナリング事象が研究されやすいとなる。微細構造は、実験の期間中、成長因子を含まない培地中で維持される。したがって、シグナル伝達カスケードのない交絡外因性活性化はありません。このように、乳房組織の微細構造は、より密接にヒト乳癌の生物学の複雑さを反映した設定で問題に対処する可能性を提供する。
エキソビボシステムは、brの応答を評価するために使用できる天然および合成ホルモンに東。これは、乳癌の発生率の増加の観点から非常に重要である。また、薬物、小分子、ペプチド、成長因子、およびサイトカインを適用することができ、細胞増殖、アポトーシスおよびシグナル伝達に対する効果を研究する。
本詳細な説明は、他の研究者によって、この方法の使用を容易にする間、実験室の変動を最小限に抑えることを意味する。この方法は患者のサンプルに依存しているように、結果が異なる研究室15間の患者の変動のより良い理解は、可能となる間で比較することを始めることができるように、標準化された方法を使用することが最も重要である。著者は、フィードバックを感謝し、このプロトコルの改訂版に改良を統合させていただきます。ヒトサンプルとの仕事は非常に困難であると著者は、興味深い生物学的サンプルでより多くのトランスレーショナルリサーチを刺激するように願っています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
著者は、乳房形成の写真を提供するためのローザンヌ大学病院のM.マイクロフィッシュ、M.ワース·実験癌研究のためのスイスの研究所のA. Ayyanan、研究分子腫瘍、生命科学の学校、エコール連邦工科·デ·コンピテンスのナショナルセンターに感謝批判的なコメントのためにマンチェスター大学の技術支援のためのローザンヌとR·クラーク。これらの結果につながる研究なしグラント契約の下でSNF3100A0-112090、Oncosuisse 531817、および革新的な医薬品イニシアティブ共同事業の支援を受けている。 115188、現物出資における製薬産業と協会の企業の欧州連合の第7次フレームワークプログラム（FP7 / 2007年から2013年）と欧州連合からの財政貢献」で構成されているの資源。革新的な医薬品イニシアティブのWebアドレスですhttp://www.imi.europa.eu/ 。</ pの>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37 °C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37 °C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0 ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
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Tags
医学、95号、ホルモンシグナル伝達、乳癌、乳房縮小形成術、乳房組織の微細構造Erratum
Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015.
Citeable Link.
A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:
Marie Shamseddin
instead of:
Marie Shamsheddin
