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Summary
우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하기위한 새로운 생체 모델을 개발했다. 이 조직 구조, 세포 간 상호 작용 및 분비 신호를 보존 수술 유방 조직 표본으로부터 분리 미세 조직에 기초한다.
Abstract
인간의 유방암에서 호르몬 작용의 연구는 적절한 모델 시스템의 부족에 의해 방해되었다. 체외 배양시, 일차 유방 상피 세포는 호르몬 수용체 발현을 잃어버린다. 널리 사용되는 호르몬 수용체 양성 유방암 세포주는 생체 내 상황에 한정 관련이있다. 여기서 우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하는 생체 모델을 설명합니다. 이러한 환원 mammoplasties mammectomies 같은 수술 또는 폐기 물질로부터 신선한 인간 유방 조직 표본 기계적 및 효소 적 덕트 및 소엽 복수 간질 세포 유형을 함유 조직편을 수득 소화된다. 성장 인자없이 기본 배지에서 유지 이러한 미세 조직은 세포 간 접촉, 조직 구조를 보존하고, 며칠 동안 반응 호르몬 남아있다. 그들은 쉽게 RNA 및 단백질 추출, 조직 학적 분석을 위해 처리 또는 중간 동결에 저장됩니다. 형광활성화 된 세포 분류 (FACS)는 특정 세포 집단을 위해 농축하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜은 매우 복잡, 다양한 인간의 표본과 번역 연구에 대한 간단한 표준 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
유방암 돌연변이 프리 대한 정보는 빠른 속도로 증가하고있다. 덜주의 유방암 개발 영향 전신 요인에 지불되고있다. 생식 호르몬에 노출되면 질병의 진행 1-3에 큰 영향을 미친다. 그러나, 생식 호르몬은 인간의 가슴에 충돌하는 메커니즘을 제대로 이해하고있다. 유전자 조작 마우스 모델에 대한 작업은 여러 다운 스트림 이펙터 (4)를 통해 세포 고유 및 분비 신호를 포함하는 것으로 밝혀졌다.
인간의 유방암에서 호르몬 작용에 대한 제한된 지식은 적절한 모델의 부족에 주로 기인한다. 에스트로겐 수용체 (ER) 및 프로게스테론 수용체 (PR)의 시그널링 메커니즘에 대한 대부분의 작업은 MCF-7 및 T47D와 같은 호르몬 수용체 양성 유방암 세포주, 수행되었다. 이러한 alrea했다 고급 유방암 환자에서 흉막 삼출에서 파생 된DY 여러 치료 (5)을 받았다. 인간의 유방의 단순한 체외 모델에서 연구 결과의 생물학적 관련성이 체외 모델에서 확인 된 의심과 대상 유전자 인 아르 동물 모델 (6)에서 식별 표적 유전자 다릅니다. 일차 인간 유방 상피 세포가 시험 관내에서 배양 할 때 그 호르몬 수용체 발현 따라서 호르몬 응답 7,8 잃어버린다. 이 문제는 리겔을 사용하여 정교한 3D 방식으로 circumventd 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, C. 클라크와 동료 호르몬 수용체 발현을 유지 프로게스테론 자극 9 증식 반응을 보였다 유방 상피 세포를 확립에 성공했다. 그러나, 생체 프로게스테론 수용체 표적 유전자의 두 개의 중요한,이 Wnt-4 및 RANKL이 시스템 9 프로게스테론 자극에 유도되지 않았다. 이러한 접근 방식은 최근 시험관을 더욱 찍은 10을 달성했다. 주의해야 할 점은, 리겔이 배치 의존하는 활동을 가지고 유지 비용이, 단지 작은 세포 수에 대한 쉬운 실험 설계를 요구한다.
생체 ER 및 PR 시그널링에서 주로 분비 작용 11에 의해 매개된다는 발견을 기초로, 우리는 세포 간 상호 작용이 유지 될 필요가 있다고 주장했다. 조직 손실되는 또 다른 중요한 요소는 체외 배양 한 세포 외 매트릭스와 상피 세포의 상호 작용이 해리; 아직 이러한 상피 분화에 중요한 자신의 중단은 종양 12에서 중요하다. 이를 염두에두고, 우리는 신선한 외과 폐기 물질 (13)로부터 유방 조직 미세 구조를 분리하는 방법을 확립. 내부 내강 및 외부 myoepitheli과 2 층 상피로 이루어진 유방 실질,알 세포는 지방 조직에서 절개하여 효소 및 기계적 해리를 실시한다. 세척 및 원심 분리 후, 우유 덕트의 조각이 많은 기질 세포와의 긴밀한 상호 작용을 유지하는 것을 얻을 수있다. 이러한 조직의 미세 구조는 반응 호르몬 남아있다. 이 모델은 임상 검체 (13)에서 확인되었다. 이와 같이 본 절차는 생물학적 및 임상 적 상황에서 유방 호르몬 작용을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
일반적인 고려 사항 : 시간의 앞서, 윤리 프로토콜을 설정은, 환자에 대한 설문 조사를 준비하고 임상 인력을 훈련하는 방법을 참조하십시오. 감소 mammoplasty 수술의 자료를 사용하기 전에 권한을 조달하고, 환자의 동의를 확인합니다. 조직은 전염성 따라 처리 될 필요가있다. 실험 암 연구 스위스 연구소 -이 프로토콜은 ISREC의 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 조직 복구, 처리 및 바이오 뱅킹
바이오 뱅킹을위한 최적의 샘플의 품질을 향상시키기 위해, 다수의 단계는 실험실로 운반하기 전에 병원에서 실시된다.
병원에서 :
- 필요한 경우, 감소 mammoplasty 수술과 혈액 샘플에서 무균 조건 하에서 인간의 유방 조직을 얻습니다. 조직은 악성 병변의 존재를 배제하는 샘플 것 병리학 자에 의해 검토 될 필요가있다.
- 유방 t 배치멸균 보드에 후드를 발행하고 가위, 수술 메스 이미 증기 멸균기로 멸균 집게를 준비합니다. 엽니 다 메스를 사용하여 유방 조직의 다른 사이트에 깊은 상처를 확인합니다. 인간의 유방 조직에서 노란색 지방 조직에 포함 된 덕트 및 소엽, 구성 흰색 가닥을 찾습니다.
참고 : 노란색 지방 조직에 흰색 실질의 비율은 여성에서 다르다; 일반적으로 젊은 여성은 더 상피 조직이있다. - 다음 가위로 지방 조직에서 부드럽게 구분, 흰색 소재의 조각을 들고 집게로 개최. 혈관을 복용하지 마십시오.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2에서 조직의 린스 조각 혈액을 제거합니다. 및 1 % (5,000 유닛 / ㎖ 페니실린 및 5,000g / ㎖ 스트렙토 마이신을 포함 함) 2 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 페놀 레드없이 F12 배지 (둘 베코 변형 이글 배지 F12)을 함유하는 250 ㎖의 플라스틱 병에 조직을 이동시켜tibiotic / 암포 테리 신 B는 (10,000 단위 / ml의 페니실린, 스트렙토 마이신 10,000 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B 및 25 ㎍ / ㎖를 포함). 실험실에 전송을위한 매체에 보관 조직.
- 감기 (드라이 아이스) 이소 펜탄과 크리오 바이알 (cryovial)에서 그들을 동결 RNA와 단백질 추출 및 플래시 5 mm 직경 - 3 개를 준비합니다. 실험실로 운송을 위해 드라이 아이스 상자로 전송합니다.
- 금형에 5 mm이고 최적의 절단 온도 OCT ()의 층으로 그것을 커버하고 차가운 이소 펜탄 가득 상자의 평평한 바닥에 금형을 배치 - 3 조각을 넣어. 완전한 동결 후 드라이 아이스 박스 몰드 옮긴다.
- 포름 알데히드에 파라 포름 알데히드에 5 mm 직경 (PFA) 4 %와 다른 5 개 (FA) 나중에 RT 조직 학적 분석에서 PBS에서 4 % - 3의 5 개를 수정합니다. 일부 항체 더 나은 하나 또는 두 가지의 서로 작업하는 두 개의 서로 다른 고정 제를 권장합니다.
실험실에서 :
- 수행감소 mammoplasty에 대한 모든 정보를 cument, 수술 및 샘플 여부 날짜는 오른쪽 가슴에 비해 왼쪽에서 파생됩니다.
- -80 ° C에서 냉동 샘플을 놓고 고정의 2 시간 후 조직 학적 카세트에 고정 조직을 전송합니다. 그런 다음 4 ℃에서 O / N 저장을 위해, 에탄올 PBS 또는 70 % 중 하나를 넣어. 다음 날, 파라핀 삽입에 대한 조직학 시설 조직학 카세트를 전송할 수 있습니다.
2. 조직 소화 호르몬 자극
- P2 세포 배양 공간에 층류 캐비닛에 조직 샘플을 함유하는 병을 전송. 살균 도마 (29 X 19cm)에 조직 조각을 놓습니다. 집게로 재료를 잡고 멀리 메스와 유방 실질 (흰 부분)에 남아있는 지방과 혈관을 긁어. 10cm 배양 접시에 PBS에 흰색 물질을 놓습니다.
- 모든 조각으로부터 지방 물질을 제거하고 폐기 후에는 안전 규칙에 따라실험실들, 다시 도마에 상피 조직을 포함하는 흰색 부분을 배치합니다. 대향 메스를 사용하여 조직을 절단하고 최대 직경 2 ㎜의 조각으로 들어온다.
- 적절한 크기의 튜브에 다진 재료를 놓고 : 1, 2.5 및 10 ml의 최대를 5, 15 또는 50 ㎖ 튜브에 각각. 일반적으로 5 ML 튜브 수익률 충분히 파라핀 매립 및 호르몬 자극에 대한 재료 및 형광 활성 셀에 대한 15 ML 튜브 수익률 충분한 재료 정렬 (FACS). 큰 튜브 분량 씩 냉동에 사용됩니다.
- 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 신 B와 (페놀 레드없이 DMEM / F12) 매체로 구성된 소화 마스터 믹스를 준비하고 (클로스 트리 디움 histolyticum에서 Clostridiopeptidase A)을게나. 소화 시간에 따라 콜라겐 복용량.
- 12, 24, 36 및 인큐베이션 시간 동안, 1.5 ㎎ / ㎖, 1.0 ㎎ / ㎖ 및 0.5 mg을 최종 농도의 콜라게나 제를 사용 / ml로 각각. 4 번에 소화 마스터 믹스를 추가소화 물질의 부피는 적절한 교반 및 폭기을 보장합니다.
참고 : 실험 설계 및 호르몬 자극의 지속 시간에 따라,시 또는 효소 분해 단계 및 미세 복구 이후에 호르몬을 추가합니다.
- 12, 24, 36 및 인큐베이션 시간 동안, 1.5 ㎎ / ㎖, 1.0 ㎎ / ㎖ 및 0.5 mg을 최종 농도의 콜라게나 제를 사용 / ml로 각각. 4 번에 소화 마스터 믹스를 추가소화 물질의 부피는 적절한 교반 및 폭기을 보장합니다.
- 샘플 및 제어 차량을 테스트하는 것이 바람직 호르몬 농도 (들)를 추가한다. 17-β 에스트라 디올 및 promegestone (R5020)과 자극 20nm의 최종 농도를 사용한다.
주 : R5020 매체 천연 황체 호르몬보다 더 안정한 합성 프로게스테론 수용체 작용제이다.- 37 ° C, 40 RPM의 O / N에서 인큐베이터 내부의 롤러 믹서에 장소 튜브. 믹서에 샘플을 배치하기 전에, 모든 물질은 원심 분리기 튜브 함께 배포하도록 잘을 재현 탁.
- 소화 미만에서 12 시간의 자극 호르몬 회 적어도 12 시간 (O / N)를 취 같이, (미세 복구 후 호르몬을 추가 드3 단계에서 꼬리). 당신이 미세을 재현 탁하고 매우 낮은 부착 판에 서스펜션을 배치 할 호르몬을 추가합니다. 조직의 미세 구조는 약 70 %의 생존 능력을 보존 성장 인자가없는 배지에서 최대 7 일 동안 초저 부착 판에 유지 될 수있다.
- RNA 및 단백질 분석을 위해 원심 분리기 튜브에서 5 분 플래시 동결에 대한 400 XG에서 원심 분리하여 조직의 미세 구조를 수집합니다.
조직 미세 3. 복구
- 5 분 동안 400 XG에 튜브 (들)를 원심 분리기. 원심 관의 상부에서 지방 대기음 5 분 동안 1,250 XG에 새로운 원심 분리 튜브에서 원심 분리로, 섬유 아세포에 풍부한 수성 상등액 나머지의 상등액을 전송.
참고 : 유방 조직의 미세 이후의 모든 단계에 대한 매우 끈적으로 부드럽게 튜브를 교반하여 펠렛을 재현 탁. 피펫은 물질적 손실의 위험에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 미세 및 PBS, 2 % 소 태아 혈청 (FCS) 수성 상등액 유래의 섬유 아세포를 펠릿 농후 재현 탁. 그 후 5 분 동안 1,250 XG에서 모두 튜브를 회전 한 후 상층 액을 버린다. - 3 펠릿을 재현 탁 - 5 ㎖의 혈액을 적혈구 용해 완충액을 깨끗한 튜브로 전송. 실온에서 5 분 동안 그들을 품어.
- PBS, 2 % FCS의 2 배 용량을 추가하고 5 분 동안 1,250 XG에이를 원심 분리. 5 분 동안 1,250 XG에서 PBS, 2 % FCS와 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. 두 번이 단계를 반복합니다.
유동 세포 계측법 4. 샘플
- 펠렛 0.25 % 트립신 2 ml의 세포를 해리 1,000 μL의 pipetman으로 2 분 동안 매우 부드럽게 아래로 피펫 팅하여 혼합 - 1을 추가합니다.
- 9 ml의 PBS, 2 % FCS를 첨가함으로써 트립신의 활성을 억제한다. 5 분 450 XG에 원심 분리기 10 ml의 PBS, 2 % FCS에서 펠렛을 재현 탁.
- t에 배치 40 μm의 셀 스트레이너 상에 세포 현탁액을 전송50 ㎖ 원심 분리 튜브의 이익은 단일 셀을 제조 하였다. 세포 현탁액의 몇 마이크로 리터 필터의 상부에 남아 있으면, 피펫으로 스트레이너의 다른 측으로부터 흡입하여이를 그들 필터를 통과하고 그 미세 여과에 추가.
- 다음 별도의 면역 세포, 항 CD45의 칵테일 마이크로에서 섬유 아 세포와 내피 세포, 안티 FAP 및 항 CD31 항체는 각각 10 내강과 기저 세포를 분리하는 팬 상피 마커는 EpCAM과 CD10에 따라, FACS로를 정렬 .
조직학 5. 샘플
- 상술 한 바와 같이 기계적 및 효소 적 분해 물질을 세척 한 후, 실온에서 30 분 동안 PBS에서 4 % PFA 1 ㎖를 1.5 ㎖의 초기 물질로부터 펠릿을 고정한다.
- 5 분 1,250 XG에 원심 분리기 1로 세척 - 두 번 2 ml의 PBS.
- 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. 이 시간 동안 (트리스 - 아세테이트 - EDTA 아가로 오스 1 % 다목적을 준비이 TAE) 버퍼 용액을 비등 할 때까지 마이크로 웨이브 오븐에서 용액을 가열한다.
- 전자 레인지에서 솔루션을 제거하고 솔루션을 혼합하고 나머지 아가로 오스 입자를 재현 탁 부드럽게 플라스크를 소용돌이 친다. 50 ° C로 냉각 아가로 오스 솔루션 및 파라핀베이스 금형 1 ml에 부어 31 × 23 × 13.5 mm 크기.
- 뜨는을 취소하고 고화 층의 상단에있는 알약을 배치 - 평평한 끝이 주걱을 사용하여 아가로 오스 (1 ~ 3 mm)이다. 아가로 오스의 추가 계층 (40 ° C에서)를 모두 커버.
- 아가로 오스 굳은 후, 일반적으로 5 분 이내에, 파라핀 매립에 대한 조직학 카세트에 아가로 오스 블록을 넣어. 아가로 오스 샘플 연필에 작은 글씨로 쓰여진 감소 mammoplasty 번호, 실험 조건 및 날짜에 대한 모든 정보와 카세트에 흰색 사무실 용지를 배치와 함께; 이 글을 쓰는 시점 이후의 모든 처리 단계를 견딥니다.
- 에 카세트를 넣어PBS O / N, 4 ° C에서 주말에 저장을 위해 70 % 에탄올,에. 우리는 두 개의 스토리지 솔루션의 차이를 발견하지 않았습니다. 그런 다음 파라핀 삽입에 대한 조직학 시설에 조직학 카세트를 전송할 수 있습니다.
6. 냉동 미세 (미래 배양)
- 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)로 이루어진 배지 FCS 및 크리오 바이알 (cryovial)에 1 ml의 분취 액을 동결 동결 조직에서 재현 탁 미세. 얻어진 크리오 바이알 (cryovial)의 수는 감소 mammoplasty로부터 얻어진 기본 물질의 양에 의존한다.
- -12 ℃로 온도를 감소, 12 ° C / 분의 속도 C ° -7 강온 5 분, 4 ° C에서 주거 다음 프로그램으로 조절 된 속도 냉동기를 이용하여 조직 미세 구조를 포함 크리오 바이알 (cryovial) 동결 6 ° C / 분, 10 분 주거의 속도, 6 ° C / 분의 속도로 -40 ℃로 온도를 감소와 -80 ° C에 온도 감소6 °의 C / 분의 속도. 그런 다음 C 냉동고 -80 °에 크리오 바이알 (cryovial)를 전송합니다.
- 다음 날, 긴 저장을 위해 액체 질소 탱크에 -80 ° C에서 크리오 바이알 (cryovial)을 전송합니다.
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Representative Results
에스트로겐과 프로게스테론의 역할을 연구하기 위해 더 나은 인간의 가슴에 자신의 분자 기능을 이해하기 위해, 우리는 그들의 동의를 얻은 후 감소 mammoplasties (그림 1)을받은 환자에서 신선한 인간의 유방 조직 표본을 수집합니다. 또한 환자의 의료 이력 및 생식뿐만 아니라 수술시의 혈청 프로게스테론 수준을 결정하기 위해 혈액 샘플을 얻었다. 신선한 감소 mammoplasties에서 조직 기계적 및 효소 분해된다. 그 결과 조직의 미세 구조는 원점 (그림 2A)의 유방 조직의 특성 덕트 및 소엽 있습니다. 아가로 오스와 근 상피 마커 ΔNp63 (그림 2B) 스테인드 파라핀 조직의 미세 구조의 면역 조직 화학적 분석은 미세 정상적인 유방 조직의 형태 학적 특성뿐만 아니라 CEL의 분자 프로파일뿐만 아니라 유지하는 것이 공개L 인구.
호르몬 반응을 평가하기 위해, 조직은 미세 합성 프로게스테론 수용체 작용제 promegestone (R5020) 또는 에탄올 제어를 처리 하였다. 호르몬 수용체에 대한 풍부 긍정적 인 내강 세포 유동 세포 계측법 상피 (는 EpCAM)과 근 상피 마커에 기초하여 수행되었다 항 CD31, 안티 FAP와의 칵테일 내피 세포, 섬유 모세포 및 면역 세포 고갈 후 (CALLA 그림 3A) 항 CD45 항체. R5020은 미세 조직을 노출로부터는 EpCAM +의 QRT-PCR 분석은 CD10- 세포는 세포 내강 농후 인구 프로게스테론의 Wnt 표적 유전자 -4- (도 3b)을 조절하는 것을 나타났다.
갓 해부 감소 mammoplasty 샘플 그림 1. 유방 조직 표본. 사진. 화살표가 가리키는흰색 유방 실질 조직을 포함하는 조직 가닥, 즉, 우유 덕트 및 터미널 유관 소엽 단위. 풍부한 노란색 지방 조직 내에서 임베디드. 지방의 색이 환자 사이의 일치 않지만, 지방 조직의 비율, 볼륨 측면에서 유방 조직의 일반적으로 가장 큰 부분은 달라집니다. 스케일 바 :. 5mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 조직의 미세 구조. (A) 미세 야상 기계적 해리 효소 소화 후 48 시간 동안 낮은 접시에 부착 배양 하였다. 스케일 바 : 40 μm의 (B) 삼일에 후 아가로 오스와 파라핀 조직의 미세 구조에 조직 학적 섹션의 현미경 사진.문화. 이 절은 근 상피 마커 ΔNp63에 대한 면역 조직 화학 염색을 실시하고 헤 마톡 실린으로 대조했다. 화살촉은 내부, 내강 세포를 가리 키, 화살표는 ΔNp63 긍정적 인 근 상피 세포를 가리 킵니다. 스케일 바 :. 40 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 유동 세포 계측법 분리 및 조직의 미세 구조의 RNA 분석을 정렬. 유동 세포 계측법에 의해 R5020 또는 에탄올로 처리하는 마이크로 조직에서 다른 세포 집단의 (A)의 분리. 조직의 미세 구조는 해리와 면역 세포, 섬유 아세포, 및 항 CD45, 안티 FAP, 및 항 CD31 항체의 칵테일 내피 세포에 대한 immunodepleted했다. 세포 antibo으로 표시 하였다내강 세포 인구 (녹색) 및 근 상피 세포의 일반적인 급성 림프 구성 백혈병 항원 (CD10 / CALLA) (복제 SS2 / 36)에 대해 풍부하게 상피 세포 접착 분자 (는 EpCAM) (복제 HEA-125)에 죽는다. 대표적인 분산 오점이 표시됩니다. (B) 막대 그래프는 24 시간 동안 에탄올 또는 R5050로 유도 조직의 미세 구조 (녹색 점 구름, 패널 A)에서 내강 하위 집단에서 상대의 Wnt-4 mRNA 발현 수준을 표시합니다. 프로게스테론 표적 유전자의 mRNA의 상대적 발현 량은,도 4의 Wnt-하이포크 산틴 - 구아닌 포스 포리 (HPRT)의 mRNA 수준에 대해 표준화. 데이터가 표시 삼중의 SD ± 평균을 나타냅니다. 앞서 설명한 바와 같이 14 RNA 분리 및 QRT-PCR을 실시 하였다. 프라이머 시퀀스 :이 Wnt-4 : 앞으로 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3'및 역방향 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT : 앞으로 5 <EM> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3'및 역방향 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 생체 외 배양은 일반적으로 인간의 여성 유방 검색된 다른 세포 유형과 함께 그대로 덕트 및 소엽을 함유 유방 조직의 미세 구조를 제공한다. 일반적 환원 mammoplasties로부터 얻어진 인간 유방 조직의 처리에서는, 지방 조직, 간질 행렬의 기계적 및 효소 적 분해, 및 적혈구의 용해 제거 유관 단편과 단말 유관 소엽 단위 풍부. 우측 기간 동안 오른쪽 농도 부드러운 효소 소화, 미세 조직이 그대로 유지되도록 복수 종류의 세포를 유지하고 주로 세포 외 기질을 유지하는 것이 필수적이다. 주의 빠르게 한 번 환자에서 분리 한 조직 처리에 지불해야한다. 환자 샘플은 크게 변화하고 기계적 및 소화 효소가 연장 될 필요가 있으며, 그리고 / 또는 조직 콜라겐 함량이 특히 높은 경우에는 여분의 효소를 첨가 할 필요가있다.
마이크로 구조체가 최대 6 일 동안 90 %의 생존을 유지하지만,이 모델은 장기 자극 호르몬에 대한 제한을 갖는다. 상이한 세포 유형은 상이한 반감기 같이, 셀룰러 조성물은 시간에 따라 변경 될 가능성이있다. 조직의 미세 구조가 면역 세포에 침투 유지하면서 조직이 신체의 순환에서 제거 될 때, 이러한 보충되지 않습니다. 많은 양의 샘플 때문에 환자 간 변동을 분석 할 필요 게다가, 외과 적 표본을 제공 임상 파트너와 고체 파이프 라인이 필요하다. 조직의 미세 구조는 나중에 사용하기 위해 냉동 할 수 있습니다. 그러나, 익스텐트 동결 융해가 다른 세포 유형에 대한 가능성 차등 세포 생존율에 영향을 미치는, 이것은 호르몬 응답을 변경할 수 있는지 것과, 특성화되지 않았다. 수득 될 조직의 미세 량을 예측하기 어려운 어떤 mammoplasty 관해서 실험 계획은 어려울 수있다.
생체 모델은 인간의 가슴에 생리적 호르몬 작용을 연구하는 첫 번째 모델을 제시한다. 차 유방 상피 세포에 대한 정교한 3D 문화 시스템이 개발되었지만,이 생체 시스템은 조직 구조와 며칠 동안 그 세포의 복잡성을 유지합니다. 결과적으로, 호르몬 수용체 양성 표적 세포에 대한 응답뿐만 분석 할 수 있지만 하류 다른 세포 유형에서의 측 분비 행사 공부 의무된다. 미세 구조물은 실험의 기간에 걸쳐 성장 인자 배지에서 유지된다. 따라서, 신호 계곡의 더 혼란 외부 활성화가 없습니다. 이와 같이, 유방 조직의 미세 구조는 더 밀접 인간 유방의 생물학적 복잡성을 반영 속에서 문제를 해결할 수있는 가능성을 제공한다.
생체 시스템은 BR의 반응을 평가할 수있다천연 및 합성 호르몬 동쪽. 이것은 유방암 증가 입사 빛이 매우 중요하다. 또, 약물, 소분자, 펩티드, 성장 인자, 사이토 카인을 적용 할 수 있고, 세포 증식, 세포 사멸 및 신호에 미치는 영향을 연구한다.
본 상세한 설명은 다른 연구자들에 의한이 방법의 사용을 용이하게하고 실험실 간 변동을 최소화하는 것을 의미한다. 이 방법은 환자의 샘플에 의존하는 바와 같이, 그 결과는 다른 기관 (15) 및 환자 간 변동성의 더 감사가 가능해진다간에 비교를 시작할 수 있도록 표준화 된 방법을 사용하는 것이 가장 중요하다. 저자는 의견을 보내 주셔서 감사하고이 프로토콜의 수정 된 버전에 개선을 통합 드릴 것입니다. 인간의 샘플 작업은 매우 도전이며, 저자는 흥미로운 생물학적 샘플을 더 중개 연구를 자극 할 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 mammoplasty 사진을 제공하는 로잔 대학 병원의 M. 피시 감사, M. 워스와 실험 암 연구 스위스 연구소, 연구 분자 종양학의 경쟁력 국립 센터, 생명 과학 대학, 에콜 폴리 테크닉 대학 Fédérale 드의 A. Ayyanan 중요한 의견 맨체스터 대학의 기술 지원을위한 로잔 R. 클라크. 이러한 결과로 이어지는 연구는없는 보조금 계약에 따라 SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531817, 그리고 혁신적인 의약품 이니셔티브 공동 된 기업의 지원을 받고있다. 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007년부터 2013년까지)과 현물의 제약 산업 및 연관 기업의 유럽 연맹의 재정적 기여로 구성되어 자원이있는 115,188. 혁신적인 의약품 이니셔티브의 웹 주소는 http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37 °C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37 °C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0 ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O'Malley, B.
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
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의학 문제 95 호르몬 신호 유방암 감소 mammoplasty 유방 조직의 미세 구조,Erratum
Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015.
Citeable Link.
A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:
Marie Shamseddin
instead of:
Marie Shamsheddin
