Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi har utviklet en ny ex-vivo modell for å studere hormon virkning i det menneskelige bryst. Den er basert på vev mikro isolert fra kirurgiske bryst vevsprøver som bevarer vevet arkitektur, inter interaksjoner, og parakrint signalering.

Abstract

Studiet av hormon virkning i det menneskelige bryst er blitt hindret av mangel på tilstrekkelige modellsystemer. Ved in vitro-kultur, primære bryst epitelceller tendens til å miste hormon-reseptor-ekspresjon. Mye brukt hormon reseptor positiv brystkreft cellelinjer er av begrenset relevans for in vivo situasjon. Her beskriver vi en ex vivo modell for å studere hormon handling i den menneskelige brystet. Friske menneskelige bryst vevsprøver fra kirurgisk kast materiale som reduksjon mammoplasties eller mammectomies er mekanisk og enzymatisk fordøyd å skaffe vevfragmenter inneholder kanaler og lobules og flere stromal celletyper. Disse vev mikro holdt i basal medium uten vekstfaktorer bevare sine inter kontakter, vevet arkitektur, og forbli hormon responsiv i flere dager. De blir lett bearbeidet for RNA og proteinutvinning, histologisk analyse eller lagres i frysemedium. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan brukes for å anrike for spesifikke cellepopulasjoner. Denne protokollen gir en grei, standard tilnærming for translasjonsforskning studier med svært komplekse, varierte menneskelige prøver.

Introduction

Informasjon om mutasjons landskapet i brystkreft er økende på hurtig tempo. Mindre oppmerksomhet har blitt betalt til systemiske faktorer som påvirker brystkreft utvikling. Eksponering for reproduktive hormoner har en stor innvirkning på sykdomsprogresjon 1-3. Likevel er de mekanismer som reproduktive hormoner har betydning for den menneskelige bryst dårlig forstått. Arbeid med genmanipulerte musemodeller har avdekket at de involverer celle egenverdi og parakrine signale gjennom flere nedstrøms effektorer 4.

Den begrensede kunnskap om hormon handling i menneske bryst skyldes i hovedsak mangel på adekvate modeller. Mest arbeid på mekanismene for østrogen reseptor (ER) og progesteron reseptor (PR) signalering har blitt utført med hormonreseptor positive brystkreftcellelinjer, slik som MCF-7 og T47D. Disse ble hentet fra plevravæske fra pasienter med avansert brystkreft som hadde already mottatt flere behandlinger fem. Den biologiske relevansen av funnene i slike enkle in vitro modeller av den menneskelige bryst er tvilsomme og mål gener identifisert i disse in vitro modeller er forskjellig fra mål gener som er identifisert i dyremodeller 6. Når primære humane bryst epitelceller dyrket in vitro har de en tendens til å miste hormon reseptor ekspresjon og derved hormonrespons 7,8. Dette problemet kan circumventd av avanserte 3D-tilnærminger som bruker matrigel. På denne måten, C. Clarke og kolleger klart å etablere bryst epitelceller som beholdt hormon reseptor ekspresjon og viste en proliferativ respons på stimulering progesteron 9. Likevel, to viktig in vivo progesteron reseptor målgener, Wnt-4 og RANKL, ble ikke indusert på progesteron stimulering i dette systemet 9. Denne tilnærmingen ble nylig tatt på videre med in vitro 10. En forbeholdet er fortsatt at matrigel har aktiviteter som er batch-avhengige, er dyrt, og krever en eksperimentell design som er egnet for små cellenummere.

Basert på erfaring av at in vivo ER og PR signale er i stor grad formidlet av paracrine interaksjoner 11, hevdet vi at inter interaksjoner må opprettholdes. En annen viktig faktor som er tapt som vev er dissosiert til enkeltceller for in vitro kultur er interaksjoner av epitelceller med den ekstracellulære matrise; men disse er kritiske for epitelial differensiering og deres avbrudd er viktig i 12 tumorigenesis. Med dette i bakhodet, har vi etablert en metode for å isolere bryst vev mikrostrukturer fra fersk kirurgisk kast materiale 13. Brystet parenchyma, som består av en to-lags epitel med indre og ytre luminal myoepithelial-celler, blir dissekert vekk fra fettvev og utsettes for mekanisk og enzymatisk dissosiasjon. Etter vasking og sentrifugering, er fragmenter av melkekanalene erholdt som beholder nære interaksjoner med mange stromale celler. Disse vev mikro forbli hormon responsiv. Modellen ble validert i kliniske prøver 13. Som sådan kan den foreliggende fremgangsmåte bidrar til å studere hormon virkning i bryst i en biologisk og klinisk relevant sammenheng.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Generelle betraktninger: I forkant av tid, sette opp en etikk-protokollen, forberede spørreskjemaer for pasienter, og se til trening av klinisk personell. Før bruk av materiale fra reduksjon mammoplasty kirurgi, skaffe tillatelser, og sikre pasientens samtykke. Vev kan være smittsomme og må håndteres deretter. Denne protokollen ble godkjent av etisk komité av ISREC - Swiss Institutt for eksperimentell kreftforskning.

1. Tissue utvinning, foredling og Bio-bank

For å sikre optimal prøvekvalitet for bio-bank, er en rekke tiltak gjennomført på før transport til laboratoriet sykehus.

På sykehuset:

  1. Skaff menneskelige brystvev under sterile forhold fra reduksjon mammoplasty kirurgi og blodprøver, hvis det er nødvendig. Vev trenger å bli undersøkt av patolog som vil prøve å utelukke tilstedeværelse av maligne lesjoner.
  2. Plasser bryst tutstede under panseret på en steril bord og forberede saks, kirurgisk skalpell og pinsetter som allerede er sterilisert med damp sterilisator. Gjør dypt kutt på ulike områder av brystvevet ved hjelp av en skalpell for å åpne den. I human brystvev se etter hvite tråder som består av kanaler og lobules, som er innebygd i gult fettvev.
    MERK: Forholdet mellom hvitt parenchymal til den gule fettvev er forskjellig blant kvinner; vanligvis yngre kvinner har mer epitelvev.
  3. Plukke biter av hvitt materiale og hold dem med tang, deretter skille dem forsiktig fra fettvev med saks. Unngå å ta blodårer.
  4. Skyll stykker av vev i fosfat-bufret saltvann (PBS) pH 7,2 for å fjerne blodet. Overfør vevet til 250 ml plastflasker inneholdende F12 medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium F12) uten fenolrødt med 2% penicillin / streptomycin (inkludert 5000 enheter / ml penicillin og 5000 g / ml streptomycin) og 1% entibiotic / amfotericin B (inkludert 10 000 enheter / ml penicillin, 10 000 pg / ml streptomycin, og 25 ug / ml amfotericin B). Butikk vev i medium for transport til laboratoriet.
  5. Forbered stykker på 3 - 5 mm diameter for RNA og protein utvinning og flash fryse dem i cryovials med kaldt (tørris) isopentan. Overføre dem til tørris boks for transport til laboratoriet.
  6. Sett biter av 3-5 mm inn i mold og dekke den med et lag av Optimal Cutting Temperature (OCT) og deretter plassere formen på den flate bunnen av boksen fylt med kaldt isopentan. Etter fullstendig frysing overføre støpeformen til tørris-boksen.
  7. Fix fem stykker på 3 - 5 mm diameter i Paraformaldehyde (PFA) 4% og ytterligere fem stykker i formaldehyd (FA) 4% i PBS ved RT histologisk analyse senere. To forskjellige fiksativ anbefales som noen antistoffer virker bedre med den ene eller den andre av de to.

I laboratoriet:

  1. GjøreD o ku ment all informasjon om reduksjonen mammoplasty, er dato for operasjonen og om prøvene stammer fra venstre versus høyre bryst.
  2. Plasser de frosne prøvene ved -80 ° C, og overfører de faste vev i histologiske kassetter etter 2 timers fiksering. Deretter sette dem enten i PBS eller 70% etanol, for O / N lagring ved 4 ° C. På neste dag, overføre histologi kassetter til histologi fasiliteter for parafin innebygging.

2. Tissue Fordøyelse og hormonstimulering

  1. Overfør flaskene inneholder vevsprøver til en laminær kabinett i en P2 cellekultur rom. Plassere vev brikker på sterile skjærefjøl (29 x 19 cm). Hold materialet med pinsett og skrape den gjenværende fett og fartøy bort fra brystet parenchyma (hvite delen) med skalpell. Plasser den hvite materialet i PBS i en 10 cm kultur parabolen.
  2. Etter fjerning av fatty materiale fra alle biter og kaster dem i henhold til sikkerhetsregels av laboratoriet, plasserer de hvite delene inneholder epitelvev tilbake på skjærefjøl. Ved hjelp av motstående skalp skjære vevet og hogge det til stykker av opp til 2 mm diameter.
  3. Plasser hakket materialet inn rør av tilstrekkelig størrelse: opptil 1, 2,5 og 10 ml til en 5, 15 eller 50 ml rør, henholdsvis. Vanligvis en 5 ml tube gir nok materiale for parafin embedment og hormonstimuleringer, og en 15 ml tube Rentene nok materiale for fluorescensaktivert Cell sortering (FACS). Større rør brukes til å fryse porsjoner.
  4. Forbered fordøyelsen mester blanding bestående av medium (DMEM / F12 uten fenol rød) med 1% penicillin / streptomycin / amfotericin B og kollagenase A (Clostridiopeptidase A fra Clostridium histolyticum). Dose kollagenase ifølge fordøyelsen ganger.
    1. I 12, 24 og 36 timer av inkubasjonen bruke endelig konsentrasjon av kollagenase på 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml og 0,5 mg / ml henholdsvis. Legg fordøyelsen mester blanding opp til fire ganger ivolum av spaltet materiale for å sikre tilstrekkelig omrøring og lufting.
      MERK: Avhengig av eksperimentell design og varigheten av hormonstimulering, legge hormoner enten under eller etter enzymatisk fordøyelse skritt og mikro utvinning.
  5. Legg hormon (er) ved ønsket konsentrasjon for å teste prøver og kjøretøyet til kontrollen. For stimulering med 17-β-østradiol, og promegeston (R5020) bruker en sluttkonsentrasjon på 20 nM.
    MERK: R5020 er et syntetisk progesteron reseptor agonist, som er mer stabile enn naturlig progesteron i medium.
    1. Plasser rørene på valsen blanderen inne i en inkubator ved 37 ° C og 40 opm O / N. Før du plasserer prøvene på mikseren, suspendere dem veldig godt for å sikre at alt materiale distribuerer langs sentrifugerør.
  6. Som fordøyelsen tar minst 12 timer (O / N), for hormonstimulering ganger på mindre enn 12 timer, legger hormonene etter utvinning av mikrostrukturer (detailed henhold til trinn 3). Legg hormoner som du resuspender mikrostrukturer og plasser suspensjon på ultra-lave festeplater. Tissue mikrostrukturer kan holdes på ultra-lave festeplater for opptil 7 dager i vekstfaktor-free medium bevare ca 70% levedyktighet.
  7. For RNA og proteinanalyse, samle vev mikrostrukturer ved sentrifugering ved 400 xg i 5 minutter og flash fryse i sentrifugerør.

3. Gjenoppretting av Tissue mikrostrukturer

  1. Sentrifuger røret (e) ved 400 xg i 5 min. Aspirere fettet fra toppen av sentrifugerøret og overføre supernatanten av den gjenværende vandige supernatant, som er anriket på fibroblaster, i et nytt sentrifugerør og sentrifuger ved 1250 xg i 5 min.
    MERK: Som brystvevet mikrostrukturer er veldig klissete, for alle påfølgende trinn resuspender pelleten ved forsiktig omrøring av røret. Pipettering anbefales ikke på grunn av risikoen for å miste materiale. Resuspender pellet anriket på mikrostrukturer og i fibroblaster avledet fra vandig supernatant i PBS, 2% føtalt kalveserum (FCS). Deretter spinne begge rør ved 1250 xg i 5 min og deretter forkaste supernatantene.
  2. Resuspender pellets i 3-5 ml rød celle blod lysisbuffer og overføre dem til å rense rørene. Inkubere dem i 5 minutter ved RT.
  3. Legg 2x volum PBS, 2% FCS og sentrifugere dem ved 1250 xg i 5 min. Vask pelleten med PBS, 2% FCS og sentrifuger ved 1250 xg i 5 min. Gjenta dette trinnet to ganger.

4. Prøver for flowcytometrisystemer

  1. Legg 1 - 2 ml trypsin-0,25% til pelleten, og blande det ved å pipettere opp og ned meget forsiktig i 2 minutter med en 1000 mL pipetman å dissosiere celler.
  2. Hindre trypsin-aktivitet ved tilsetning av 9 ml PBS, 2% FCS. Sentrifuger ved 450 xg i 5 minutter og resuspender pelleten i 10 ml PBS, 2% FCS.
  3. Overfør cellesuspensjonen til en 40 um cellefilter plassert på top fra et 50 ml sentrifugerør for å fremstille enkeltceller. Hvis noen få mikroliter av cellesuspensjonen forbli på toppen av filter, hjelpe dem til å passere gjennom filteret ved å suge dem fra den andre siden av silen med en pipette og legge dem til de filtrerte mikrostrukturer.
  4. Separate immunceller, fibroblaster og endotelceller fra mikrostrukturer med en cocktail av anti-CD45, anti-FAP og anti-CD31 antistoff og deretter sortere dem med FACS, basert på pan-epitelial markør EpCAM og CD10 å skille luminale og basal celler henholdsvis 10 .

5. Prøver for Histologi

  1. Etter vasking av mekanisk og enzymatisk spaltede materiale som beskrevet ovenfor, løser pellets fra 1,5 ml utgangsmaterialet i 1 ml 4% PFA i PBS ved romtemperatur i 30 minutter.
  2. Sentrifuger ved 1250 x g i 5 minutter og vaskes med 1 - 2 ml PBS to ganger.
  3. Sentrifuger ved 16000 x g i 10 min. I løpet av denne tiden klar 1% multi-purpose agarose i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer og varme løsningen i mikrobølgeovnen til løsningen kommer til å koke.
    1. Fjern løsningen fra mikrobølgeovnen og virvle kolben forsiktig for å blande løsningen og resuspender eventuelle gjenværende agarose partikler. Cool agarose løsning til 50 ° C og hell 1 ml i en parafin basen mold størrelse 31 × 23 × 13.5 mm.
  4. Kast supernatanten og plassere pellets på toppen av det størknede lag (1-3 mm) av agarose ved å bruke en spatel med en flat ende. Dekke dem med et ekstra lag av agarose (40 ° C).
  5. Etter agarose stivner, vanligvis innen 5 min, satte agarose blokker i histologi kassetter for parafin embedment. Sammen med agarose prøvene legger et hvitt kontor papir i kassetten med all informasjon om reduksjonen mammoplasty nummer, eksperimentell tilstand, og dato skrevet i små bokstaver i blyant; skrivende tåler alle påfølgende behandlingstrinn.
  6. Sett kassettene iPBS O / N, eller i 70% etanol for lagring over helgen, ved 4 ° C. Vi har ikke merket noen forskjell mellom de to lagringsløsninger. Deretter overføre histologi kassetter til histologi fasiliteter for parafin innebygging.

6. Frysemikrostrukturer (Future dyrking)

  1. Resuspender vev mikrostrukturer i frysemedium bestående av FCS med 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) og fryse 1 ml aliquoter i cryovials. Antallet oppnådde cryovials avhenger av mengden av primærmateriale erholdt fra reduksjon mammoplasty.
  2. Fryse cryovials inneholdende vev mikrostrukturer ved bruk av en kontrollert hastighet fryser med følgende program: 5 min bolig ved 4 ° C, reduseres temperaturen til -7 ° C med hastighet på 6 ° C / min, reduksjon av temperaturen til -12 ° C med hastighet på 6 ° C / min, 10 min bolig, redusere temperaturen til -40 ° C med hastighet på 6 ° C / min, reduseres i temperatur til -80 ° C medhastighet på 6 ° C / min. Deretter overføre cryovials til -80 ° C fryser.
  3. Neste dag, overføre cryovials fra -80 ° C til flytende nitrogen tank for lang lagring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å studere rollen av østrogen og progesteron og å bedre forstå deres molekylære funksjoner i menneske bryst, samler vi friske menneskelige bryst vevsprøver fra pasienter som gjennomgår reduksjon mammoplasties (figur 1) etter å ha innhentet deres samtykke. Vi får også pasientens medisinske historie og reproduktiv, samt en blodprøve for å bestemme serumprogesteronnivåene ved tidspunktet for kirurgi. Vev fra ferske reduksjon mammoplasties er mekanisk og enzymatisk dissosiert. De resulterende vev mikrostrukturer har kanaler og lobules karakteristiske av brystvevet opprinnelsesland (Figur 2A). Immunhistokjemisk analyse av agarose og parafininnstøpte vev mikro farget for korg markør ΔNp63 (figur 2B) viser at mikrostrukturer beholder ikke bare de morfologiske egenskapene til den normale brystvev, men også den molekylære profil av celpopulasjoner l.

For å vurdere hormonrespons, ble vev mikrostrukturer behandles enten med syntetisk progesteron reseptor agonist promegeston (R5020) eller etanol kontroll. Å berike for hormonreseptor positive luminale celler flowcytometri ble utført basert på epitel (EpCAM) og korg markør (CALLA, figur 3A) etter uttømming for endotelceller, fibroblaster og immunceller med en cocktail av anti CD31, anti-FAP og anti- CD45 antistoffer. QRT-PCR-analyse av EpCAM +, CD10- celler viste seg regulering av progesteron målgen Wnt-4 (figur 3B) i luminal celle anrikede populasjon fra R5020 eksponert vev mikrostrukturer.

Figur 1
Figur 1. Bryst vevsprøve. Foto av nystekte dissekert reduksjon mammoplasty prøven. Piler pekertil hvite vev tråder som inneholder brystet parenkym, dvs. melkekanalene og terminal duktale lobular enheter. Integrert i rikelig gul fettvev. Mens fargen på fettet ikke er konsistent mellom pasienter, andelen av fettvev, vanligvis den største delen av brystvevet i volum, varierer. Målestokk:. 5 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Tissue mikrostrukturer. (A) Bright felt bilde av mikrostrukturer dyrket på en lav festeplate i 48 timer etter mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse. Skala bar: 40 mikrometer (B) Micrograph av et histologisk seksjon på vev mikrostrukturer innebygd i agarose og parafin etter 3 dager i.kultur. Seksjonen ble utsatt for immunhistokjemisk farging for korg markør ΔNp63 og motfarget med hematoksylin. Pilspisser peker på de indre, luminale celler, piler peker ΔNp63 positive korgcellene. Målestokk:. 40 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Flowcytometri sortering separasjon og RNA-analyse av vev mikrostrukturer. (A) Separering av de forskjellige cellepopulasjoner fra vev behandlet med mikro R5020 eller etanol ved strømningscytometri. Tissue mikrostrukturer ble dissosiert og immunodepleted for immunceller, fibroblaster og endotelceller, med en blanding av anti-CD45, anti-FAP, og anti-CD31-antistoffer. Celler ble merket med Antibodør mot Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) (klon HEA-125) for å anrike for luminal cellepopulasjon (grønn) og Common akutt lymfoblastisk leukemi-antigen (CD10 / CALLA) for korg celler (klon SS2 / 36). En representant scatter blot er vist. (B) Bar graf som viser relative Wnt-fire mRNA uttrykk nivåer i luminal subpopulasjonen fra vev mikrostrukturer (grønn prikk sky, panel A) indusert med etanol eller R5050 i 24 timer. Relative mRNA-ekspresjonsnivåene av progesteron målgenet, Wnt-4 normalisert mot mRNA-nivåer av hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferase (HPRT). De viste data representerer gjennomsnitt ± SD av triplikater. RNA isolasjon og QRT-PCR ble utført som beskrevet tidligere 14. Primersekvenser: Wnt-4: forover 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' og reversere 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT: forover 5 <em> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' og omvendt 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ex vivo kultur beskrevet her gir brystvev mikrostrukturer som inneholder intakte kanaler og lobules, sammen med andre celletyper som normalt finnes i den menneskelige kvinnelige bryst. Ved behandling av den menneskelige brystvevet vanligvis oppnådd fra reduksjons mammoplasties, fjerning av fettvev, mekanisk og enzymatisk fordøyelse av stromal matriks og lysering av røde blodceller beriker for melkekanal fragmenter og terminal ductal lobular enheter. Lett enzymatisk fordøyelse til rett konsentrasjon, for retten varighet er avgjørende for å sikre at vev mikro forbli intakt, beholde flere celletyper og i stor grad bevare sine ekstracellulære matriser. Man bør også være betalt for å behandle vev raskt når fjernet fra pasienten. Pasientprøver variere betydelig og mekanisk og enzymatisk fordøyelse kan trenge å bli langvarig, og / eller ekstra enzym må legges når vevet er spesielt høy i kollagen innhold.

Selv om mikro forbli 90% levedyktig for opp til 6 dager, har modellen begrensningene for langsiktige hormonstimuleringer. Da forskjellige celletyper har forskjellige halveringstider, er den cellulære sammensetning sannsynligvis vil endre seg over tid. Mens vevet mikro bevare infiltrerende immunceller, er disse ikke opp igjen som vev fjernes fra sirkulasjonen i kroppen. Videre er en fast rørledning med de kliniske partnere som gir de kirurgiske prøver kreves som et stort antall prøver skal analyseres på grunn av inter pasientvariasjon. Tissue mikrostrukturer kan fryses for senere bruk. Men i hvilken grad frysing og tining påvirke celle levedyktighet, muligens forskjellig for ulike celletyper, og hvordan dette kan endre hormonrespons, har ikke vært preget. Planlegging av eksperimenter kan være vanskelig som for enhver mammoplasty mengden av vev mikrostrukturer som skal oppnås er det vanskelig å forutse.

ex vivo modell den første modellen til å studere fysiologiske hormon handling i den menneskelige brystet. Mens avanserte 3D-kultur systemer for primær bryst epitelceller har blitt utviklet, bevarer dette ex vivo system vevet arkitektur og dens cellulære kompleksitet over flere dager. Som et resultat, kan ikke bare reaksjon i de hormon-reseptor-positive målceller skal analyseres, men de hendelser nedstrøms for parakrin signalisering i andre celletyper blir mottagelig for å studere. De mikrostrukturer er holdt i vekstfaktor-fritt medium gjennom hele varigheten av forsøkene. Derfor er det ingen confounding ytre aktivering av signalkaskader. Som sådan, brystvevet mikro tilbyr muligheten til å ta opp spørsmål i en innstilling som gjenspeiler nærmere de biologiske kompleksiteten i den menneskelige brystet.

Den ex vivo-system kan brukes til å evaluere responsen til brøst til naturlige og syntetiske hormoner. Dette er svært viktig i lys av en økende forekomst av brystcancer. Videre kan medikamenter, små molekyler, peptider, vekstfaktorer og cytokiner som skal benyttes og deres effekter på celleproliferasjon, apoptose og signalering skal studeres.

Den foreliggende detaljerte beskrivelse er ment å lette bruken av denne metoden av andre forskere, og for å bidra til å minimalisere interlaboratorie variasjon. Ettersom denne metode er avhengig av pasientprøver, er det av største betydning at en standardisert metode blir brukt, slik at resultatene kan begynne å bli sammenlignet mellom ulike laboratorier 15 og en bedre forståelse av inter pasient variabilitet blir mulig. Forfatterne setter pris på tilbakemeldinger og vil gjerne integrere forbedringer i reviderte versjoner av denne protokollen. Arbeidet med humane prøver er svært utfordrende og forfatterne håper å stimulere til mer translasjonsforskning med interessante biologiske prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker M. Fiche av Universitetssykehuset i Lausanne for å gi mammoplasty fotografi, M. Wirth og A. Ayyanan av sveitsiske Institutt for eksperimentell kreftforskning, nasjonalt kompetansesenter i forskning Molecular Oncology, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne for teknisk assistanse og R. Clarke fra University of Manchester for kritiske kommentarer. Forskningen fører til disse resultatene har fått støtte fra SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531817, og den Innovative Medicines Initiative fellesforetaket i henhold til tilskuddsavtalen no. 115 188, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) og European Federation of Pharmaceutical Industries og Foreninger selskapenes tingsinnskudd. Webadressen of Innovative Medicines Initiative er http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).

Tags

Medisin Hormone signalering brystkreft reduksjon mammoplasty bryst vev mikrostrukturer, østrogen progesteron mammary epitelceller vevsfordøyelse parakrin signalering mikromiljøet,

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell for å studere Hormone Handling i Human Breast
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter