Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bir Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

Biz insan meme hormon eylem incelemek için yeni bir ex vivo modeli geliştirdik. Bu doku mimarisi, hücreler arası etkileşimleri ve parakrin sinyal korumak cerrahi göğüs doku numunesinin izole doku mikro dayanmaktadır.

Abstract

İnsan meme hormon eylem çalışması yeterli model sistemler eksikliği engel olmuştur. İn vitro kültüre, primer meme epitelyum hücreleri hormon reseptörü ifade kaybetme eğilimindedir. Yaygın olarak kullanılan hormon reseptörü pozitif meme kanseri hücre kuşakları in vivo duruma uygunluğu sınırlıdır. Burada, insan meme hormon etkisini incelemek için bir eks vivo modeli açıklar. Böyle azaltma tekniği mevcut ameliyat teknikleri veya mammectomies gibi cerrahi ıskarta malzeme Taze insan meme doku örnekleri mekanik ve enzimatik kanalları ve lobülleri ve çoklu stromal hücre tipleri içeren doku parçaları elde etmek için sindirilir. Büyüme faktörleri olmaksızın bazal ortamda tutulur Bu doku mikro bunların hücreler arası temas doku normal yapı, ve birkaç gün boyunca duyarlı hormon kalır. Bu maddeler hali hazırda, RNA ve protein çıkarma, histolojik analiz için işleme veya orta dondurma saklanır. Floresanaktif hücre ayrıştırma (FACS) belirli bir hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için de kullanılabilir. Bu protokol son derece karmaşık, çeşitli insan örnekleri ile öteleme çalışmalar için basit, standart bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Meme kanserinde mutasyon manzara hakkında bilgiler hızla artmaktadır. Daha az dikkat meme kanseri gelişimini etkileyen sistemik faktörler ödenmiştir. Üreme hormonları maruz kalma hastalığın ilerlemesine 1-3 üzerinde büyük bir etkisi vardır. Ancak, üreme hormonları, insan meme çarpmadan hangi mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Genetiği fare modelleri ile çalışmak onlar birkaç mansap efektörlerinin 4 ile hücre içsel ve parakrin sinyal içerdiğini ortaya koymuştur.

İnsan meme hormon eylem hakkında sınırlı bilgi yeterli modellerin eksikliği büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR), sinyal mekanizmaları ilişkin pek çok çalışma, MCF-7 ve T47D hormon reseptör pozitif göğüs kanseri hücre çizgileri ile gerçekleştirilmiştir. Bunlar alrea vardı ilerlemiş meme kanserli hastaların plevral efüzyon elde edildidy birden tedavileri 5 aldı. İnsan meme gibi basit laboratuar çalışmalarındaki modellerde bulgular biyolojik önemi, bu in vitro modellerde tespit şüpheli ve hedef genleridir olan hayvan modellerinde 6'da tanımlanan hedef genlerin farklıdır. Birincil insan meme epitel hücreleri, in vitro olarak kültürlenir onlar hormon reseptör ekspresyonu ve bu nedenle hormon yanıt 7,8 kaybetmek eğilimindedir. Bu sorun, Matrigel kullanarak karmaşık 3D yaklaşımlarla circumventd edilebilir. Bu şekilde, C. Clarke ve arkadaşları, hormon reseptörü ifade muhafaza ve projesteron uyarması 9 bir çoğalma tepkisi gösterdi göğüs epitelyal hücrelerinin kurulma başarmıştır. Bununla birlikte, in vivo progesteron reseptörü hedef genlerin önemli iki Wnt-4 ve RANKL bu sistem 9 progesteron stimülasyonu üzerine azalmadı. Bu yaklaşım, son olarak nitro ile daha fazla alınmıştır 10 sağlandı. Bir uyarı, matrigel toplu bağımlı faaliyetleri vardır kalır pahalı ve sadece küçük hücre sayıları için apt bir deneysel tasarım gerektirir.

In vivo ER ve PR sinyalizasyon büyük ölçüde parakrin etkileşimleri 11 aracılık bulgusuna dayanarak, biz hücrelerarası etkileşimleri muhafaza edilmesi gerektiğini savundu. Dokular olarak kaybolur bir başka önemli faktör, in vitro kültür için tek bir hücre için hücre dışı matriks ile epitelyal hücrelerinin etkileşimlerdir ayrışmış edilir; ancak bu epitel farklılaşması için çok önemli olan ve bozulma tümör oluşumu 12 önemlidir. Bu düşünceyle, biz taze cerrahi ıskarta malzeme 13 meme dokusu mikro izole etmek için bir yöntem kurdu. İç luminal ve dış myoepitheli sahip bir iki tabakalı epitelyum oluşan meme parankimi,ark hücreleri, adipoz dokudan kesilmiş, mekanik ve enzimatik ayrışma tabi tutulur. Yıkama ve santrifüj sonra, süt kanallarının parçaları birçok stromal hücreler ile yakın ilişkileri korumak olduğunu elde edilir. Bu doku mikro duyarlı hormon kalır. Model klinik örneklerden 13 valide edildi. Bu haliyle, bu işlem, bir biyolojik ve klinik olarak anlamlı bir bağlamda meme hormon etkisini incelemek için yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Genel değerlendirmeler: Zaman Ahead, bir etik protokolü kurmak, hastalar için anketler hazırlar, ve klinik personelinin eğitim görmek. Indirgeme mamoplasti cerrahi malzeme kullanmadan önce, yetkileri tedarik ve hasta rıza sağlamak. Doku bulaşıcı olması ve buna göre ele alınması gerekiyor olabilir. Deneysel Kanser Araştırma Enstitüsü İsviçre - Bu protokol ISREC etik komitesi tarafından onaylandı.

1. Doku Kurtarma, İşleme ve Biyo-bankacılık

Biyo-bankacılık için en uygun örnek kalitesini sağlamak için, birkaç adım laboratuarına taşımak için önce hastanede yapılır.

Hastanede:

  1. Gerekirse, indirgeme mamoplasti cerrahi ve kan örneklerinden, steril koşullar altında insan göğüs dokuları elde edilir. Doku malign lezyonların varlığını ekarte etmek için örnek olacak patolog tarafından incelenmesi gerekir.
  2. Meme t yerleştirinsteril bir gemide başlık altında vermek ve makas, cerrahi neşter ve zaten buhar sterilizatör sterilize edilir forseps hazırlamak. Bunu açmak için bir neşter kullanılarak meme dokusunun farklı sitelerde derin kesim olun. Insan meme dokusunda sarı yağ dokusunda gömülü kanalları ve lobülleri, oluşan beyaz teller için bakmak.
    NOT: Sarı yağ dokusu beyaz parankimal oranı kadınlarda farklılık; tipik genç kadınlar daha epitel doku var.
  3. Daha sonra makas ile adipoz dokudan hafifçe onları ayırmak, beyaz malzeme parçaları seçin ve forseps ile onları tutun. Kan damarlarını almaktan kaçının.
  4. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.2 doku durulayın adet kanı çıkarmak için kullanılır. Ve% 1 An (5000 birim / ml penisilin ve 5000 ug / ml streptomisin içeren)% 2 penisilin / streptomisin ile fenol kırmızısı olmaksızın F12 ortamı (Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı F12) ihtiva eden 250 ml'lik bir plastik şişe doku aktarıntibiotic / amfoterisin B (10,000 birim / mL penisilin, streptomisin 10,000 ug / ml amfoterisin B ve 25 ug / ml olmak üzere). Laboratuara taşınması için ortamda depolanmalıdır dokular.
  5. Soğuk (kuru buz) izopentanın ile cryovials bunları dondurmak RNA ve protein çıkarma ve flaş için 5 mm çaplı - 3 adet hazırlayın. Laboratuara taşınması için kuru buz kutusuna aktarabilirsiniz.
  6. Kalıba 5 mm ve optimum kesme Sıcaklığı (Ekim), bir tabaka ile örtün ve daha sonra soğuk izopentan ile dolu kutunun düz bir alt kalıp yer - 3 parçalarını koyun. Tam donma sonra kuru buz kutusuna kalıp aktarmak.
  7. Formaldehit içinde paraformaldehid 5 mm çapında (PFA)% 4 ve 5 parça (FA), daha sonra RT histolojik analiz PBS içinde% 4 - 3 5 adet düzeltin. Bazı antikorlar, daha bir ya da iki diğer çalışmak üzere iki farklı sabitleyici tavsiye edilir.

Laboratuvarda:

  1. Yapmakindirgeme mammoplasty ilgili tüm bilgileri cument, cerrahi ve örnekler olup olmadığını tarih sağ meme karşı soldan türetilmiştir.
  2. -80 ° C'de dondurulmuş numuneler ve tespitin 2 saat sonra histolojik kasetlerine sabit dokuları aktarın. Daha sonra 4 ° C'de O / N depolama için, etanol, PBS içinde veya% 70 ya da koyun. Ertesi gün, parafin gömme için histoloji tesislerine histoloji kasetleri aktarmak.

2. Doku sindirimi ve Hormon Uyarım

  1. P2 hücre kültürü odasında bir laminer akış kabine doku örnekleri içeren şişeleri aktarın. Steril doğrama tahtası (29 x 19 cm) doku parçaları yerleştirin. Forseps ile malzemeyi tutun ve neşter ile meme parankimi (beyaz kısmı) kalan yağ ve damarları kazımak. 10 cm kültür çanak PBS beyaz malzemeyi yerleştirin.
  2. Tüm parçalar yağlı malzemenin çıkartılması ve atılması sonra onları güvenlik kuralına görelaboratuvar s, arka doğrama tahtası üzerinde epitel doku içeren beyaz parçalar yerleştirin. Karşıt neşter kullanılarak doku kesmek ve en fazla 2 mm çaplı parçalara doğrayın.
  3. Yeterli büyüklükte tüplerin içine kıyılmış malzemeyi yerleştirin: 1, 2.5 ve 10 ml kadar 5, 15 ya da 50 ml'lik tüplere, sırasıyla. Tipik olarak 5 ml'lik bir tüp verimi yeterli parafin gömülmesi ve hormon uyarımlar için malzeme ve flöresanla aktive edilen hücre bir 15 ml tüp verimi yeterli malzemenin sıralama (FACS). Daha büyük tüp alikotları dondurulması için kullanılır.
  4. % 1 penisilin / streptomisin / amfoterisin B (fenol kırmızısı olmadan DMEM / F12) ortama aşağıdakilerden oluşan sindirim ana karışımı hazırlamak ve (Clostridium histolyticum'dan Clostridiopeptidase A) bir kolajenaz. Sindirim saatlerine göre kollajenaz doz.
    1. 12, 24, ve kuluçkalama 36 saat için, 1.5 mg / ml, 1.0 mg / ml ve 0.5 mg nihai kolajenaz konsantrasyonu, kullanımı / ml olarak tespit edildi. 4 kez sindirim ana karışımı ekleyinsindirilmiş malzemenin hacmi yeterli ajitasyon ve havalandırma sağlamak için.
      NOT: deneysel tasarım ve hormon stimülasyon süresine bağlı olarak, sırasında veya enzimatik sindirim adım ve mikro kurtarma sonra ya hormonlar ekleyin.
  5. Numune ve kontrol aracı test etmek için, istenen konsantrasyonda hormon (lar) ekleyin. 17 β-estradiyol ve promegeston (R5020) ile stimülasyonu için 20 nM nihai konsantrasyon kullanılır.
    Not: R5020 ortamda doğal progesteron daha kararlı olan bir sentetik progesteron reseptör agonistidir.
    1. 37 ° C ve 40 rpm O / N bir inkübatör içinde silindir mikser yerleştirin tüpleri. Mikserde örnekleri yerleştirmeden önce, tüm maddi santrifüj tüplerine boyunca dağıtır sağlamak için onları çok iyi tekrar süspansiyon.
  6. Sindirim az 12 saat hormon stimülasyon kez en az 12 saat (O / N), alır gibi, (mikroyapıların kurtarma sonra hormonları eklemek deAdım 3 altında kuyruklu). Eğer mikro tekrar süspansiyon ve ultra-düşük bağlanma plakaları üzerinde süspansiyon yer olarak hormonları ekleyin. Doku mikro yaklaşık% 70, canlılığını muhafaza büyüme faktörü içermeyen ortam içinde 7 gün boyunca ultra-düşük bağlanma plakaları üzerinde tutulabilir.
  7. RNA ve protein analizi için, santrifüj tüplerine 5 dakika ve flaş dondurma için 400 xg'de santrifüj doku mikro toplamak.

Doku Microstructures 3. Kurtarma

  1. 5 dakika boyunca 400 xg'de tüp (ler) santrifüj. Santrifüj tüpünün üst yağ aspire ve 5 dakika süreyle 1,250 x g de yeni bir santrifüj tüpüne ve santrifüj, fibroblastlar içinde zenginleştirilmiş olan geri kalan sulu süpernatan, süpernatanlarının aktarın.
    NOT: Meme dokusu mikroyapıları sonraki tüm adımlar için, çok yapışkan olduğundan tüp hafifçe çalkalayarak pelletini. Pipetleme nedeniyle malzeme kaybetme riski tavsiye edilmez. Mikro ve PBS,% 2 Fetal Buzağı Serumu (FCS), sulu süpernatan elde edilen fibroblastlar zenginleştirilmiş pelet yeniden süspanse. Daha sonra 5 dakika boyunca 1.250 xg'de hem tüpleri dönmeye ve daha sonra süpernatantlar atın.
  2. 3 pelet tekrar süspansiyon - 5 ml kırmızı hücre kan parçalama tamponu ve temiz tüplere aktarabilirsiniz. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe.
  3. PBS,% 2 FCS 2x hacmi ilave edin ve 5 dakika boyunca 1250 x g'de santrifüj. 5 dakika boyunca 1,250 x g hızında PBS,% 2 FCS ve santrifüj ile pelet yıkayın. Iki kez bu adımı tekrarlayın.

Akım Sitometrisi 4. Örnekler

  1. Pelet% 0.25 oranında tripsin 2 ml ve hücreleri ayırmak için 1.000 ul Pipetman ile 2 dakika süreyle çok hafifçe aşağı yukarı pipetleme karıştırın ve - 1 ekleyin.
  2. 9 ml PBS,% 2 FCS eklenerek tripsin aktivitesi inhibe. 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve 10 ml PBS,% 2 FCS içinde pelletini.
  3. T yerleştirilen 40 mikron hücre süzgecinden üzerine hücre süspansiyonu aktarın50 ml'lik bir santrifüj tüpünün op tek hücrelerin hazırlanması için. Hücre süspansiyonu bir kaç mikrolitre filtrenin üstünde kalırsa, bir pipet ile süzgeçten diğer taraftan onları aspire onları filtreden geçerek yardım ve filtre mikroyapılarının ekleyebilirsiniz.
  4. Daha sonra, ayrı bir bağışıklık hücreleri, anti-CD45, bir kokteyl ile mikro gelen fibroblastlar ve endotel hücreleri, anti-FAP ve anti-CD31 antikorları ve sırasıyla 10 lümen ve bazal hücrelerin ayrılması için bir pan-epitel işaretleyici EpCAM ve CD10 göre, FACS ile sıralamak .

Histoloji 5. Örnekler

  1. Yukarıda tarif edildiği gibi, mekanik olarak ve enzimatik olarak sindirilen materyali yıkandıktan sonra, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 4 PFA içinde 1 ml 1.5 mi, başlangıç ​​maddesi granül düzeltin.
  2. 5 dakika boyunca 1.250 xg'de Santrifüj ve 1 ile yıkayın - iki kez 2 ml PBS.
  3. 10 dakika için 16,000 x g'de santrifüjleyin. Bu süre boyunca, (Tris-Asetat-EDTA agaroz% 1 çok amaçlı hazırlanmasıTAE) tampon ve solüsyon kaynama noktasına gelene kadar mikrodalga fırında ısıtın çözüm.
    1. Mikrodalga fırından çözüm çıkarın ve çözüm karıştırın ve kalan agaroz parçacıkları tekrar süspansiyon yavaşça şişeyi girdap. 50 ° C'ye soğutun, agaroz çözeltisi ve bir parafin baz kalıp içinde 1 ml akış 31 x 23 x 13.5 mm çapında.
  4. Süpernatant atılır ve katılaşan bir tabakanın üstünde yer pelet - düz bir uca sahip olan bir spatula kullanılarak agaroz (1 ila 3 mm) kadardı. Agaroz ek bir katman (40 ° C) ile hepsini kapsayacak.
  5. Agaroz katılaşır sonra, genellikle 5 dakika içinde, parafin gömme için histoloji kasetleri içine agaroz blokları koydu. Agaroz örnekleri kalem küçük harflerle yazılmış azalma mamoplasti numarası, deneysel koşul ve tarihi hakkında tüm bilgiler kaset beyaz ofis kağıdı yerleştirin birlikte; Bu yazı sonraki tüm tedavi adımlarını dayanıklıdır.
  6. Kasetler koyPBS O / N ya da 4 ° C'de hafta sonu boyunca depolama için% 70 etanol içinde. Biz iki depolama çözümleri arasında herhangi bir fark fark değil. Sonra parafin gömme için histoloji tesislerine histoloji kasetleri aktarmak.

6. Dondurma Mikroyapılar (Gelecek Kültürleme)

  1. % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile FCS içeren orta ve cryovials 1 ml'lik numuneler dondurulması yeniden süspanse doku mikro. Elde edilen cryovials sayısı azaltma mammoplasty elde edilen birincil malzeme miktarına bağlıdır.
  2. -12 ° C sıcaklık ile azalan, 6 ° C / dakika oranı ile C ila -7 sıcaklığının düşürülmesi, 5 dakika 4 ° C 'de yaşayan aşağıdaki program ile bir kontrollü hız dondurucu kullanılarak doku mikro içeren cryovials Freeze 6 ° C / dk, 10 dk konut hızı, 6 ° C / dakika oranı ile -40 ° C sıcaklık azaldıkça -80 ° C sıcaklıkta azalmaktadır6 ° C / dakika hızı. Sonra ° C derin dondurucuda -80 kadar cryovials aktarmak.
  3. Ertesi gün, uzun depolama için sıvı azot tankına ° C -80 cryovials aktarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Östrojen ve progesteron rolünü incelemek ve daha iyi insan meme moleküler işlevlerini anlamak için, onların bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra azalma tekniği mevcut ameliyat teknikleri (Şekil 1) uygulanan hastalarda taze insan meme doku örneklerinin toplamak. Biz de hastaların tıbbi ve üreme geçmişi, hem de ameliyat sırasında serum progesteron seviyelerini belirlemek için kan örneği almak. Taze azaltma tekniği mevcut ameliyat teknikleri doku mekanik ve enzimatik ayrışmış. Elde edilen doku, mikro kökenli (Şekil 2A), meme dokusu için karakteristik oluklar ve lobülleri sahiptir. Agaroz ve miyoepitelial işaretleyici ΔNp63 (Şekil 2B), boyanmış parafine gömülmüş doku mikro immünohistokimyasal analizi, mikro, normal meme dokusu morfolojik özellikleri değil, aynı zamanda cel moleküler profili sadece koruduğunu ortaya koymaktadırl popülasyonları.

Hormon yanıtı değerlendirmek için, doku mikro yapılar sentetik progesteron reseptör agonisti promegeston (R5020) veya etanol kontrolü ile ya tedavi edildi. Hormon reseptörü için zenginleştirmek için pozitif luminal hücre akış sitometri epitel (EpCAM) ve miyoepitelyal işaretleyici göre yapıldı anti CD31, anti-FAP ve bir kokteyl ile endotel, fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri için tükenmesi sonrasında (CALLA Şekil 3A) anti CD45 antikorları yer alır. R5020 doku mikro maruz gelen EpCAM + ve QRT-PCR analizi, CD10- hücre lümen hücre zenginleştirilmiş popülasyonunda progesteron hedef genin, Wnt-4 (Şekil 3B) düzenlenmesini ortaya çıktı.

Şekil 1,
Taze disseke azalma mamoplasti numunenin Şekil 1. Meme dokusu örneği. Fotoğraf. Oklar işaretBeyaz meme parankimi ihtiva doku teller, yani, süt kanalları ve terminal duktal lobüler birimlere. Bol sarı yağ dokusu içinde gömülü. Yağ renk hastalar arasında tutarlı etmez birlikte, yağ dokusu oranı, hacim olarak, meme dokusu, genel olarak en büyük kısmı, değişir. Ölçek çubuğu:. 5 mm , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Doku mikroyapılar. (A), mikro yapıların parlak saha görüntü mekanik ayrıştırma ve enzimatik sindirimden sonra 48 saat süre ile düşük bir bağlanma plaka üzerinde kültürlenmiştir. Ölçek çizgisi: 40 um (B), 3 gün sonra, agaroz ve parafine gömülü doku mikro üzerinde histolojik kesitin mikrografiği.kültür. bölüm miyoepitelyal işaretleyici ΔNp63 için immünohistokimyasal boyama tabi ve hematoksilen ile zıt edildi. Ok uçları, iç, luminal hücreler işaret, oklar ΔNp63 pozitif miyoepitelial hücrelere işaret. Ölçek çubuğu:. 40 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Akış sitometri ayrılmasını ve doku mikroyapıların RNA analizi sıralama. Akış sitometrisi ile R5020 ya da etanol ile işlemden geçirildi, doku mikro farklı hücre popülasyonlarının, (A) ayrılması. Doku mikro ayrılmış ve bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, ve anti-CD45, anti-FAP, ve anti-CD31 antikorları bir kokteyli ile endotel hücreleri için immüno edildi. Hücreler Antibo ile etiketlenmişlümen hücre popülasyonu (yeşil) ve miyoepitelial hücrelerde için ortak akut lenfoblastik lösemi Antijen (CD10 / CALLA) (Klon SS2 / 36) zenginleştirmek için Epitel Hücre Adezyon Molekülü (EpCAM) (klon HEA-125) karşı ölür. Bir temsilci dağılım leke gösterilmiştir. (B) Çubuk grafik 24 saat etanol veya R5050 ile uyarılan doku mikroyapılarının (yeşil nokta bulutu, panel A) luminal populasyonda göreceli Wnt-4 mRNA ifade seviyelerini gösteren. Progesteron, hedef genin göreli mRNA ekspresyon düzeyleri, Wnt-4 hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz (HPRT) mRNA düzeylerine göre normalleştirilmiş. Gösterilen veriler kopyalardaki ± SD ortalamasını temsil etmektedir. Daha önce tarif edildiği gibi 14 RNA izolasyonu ve QRT-PCR ile gerçekleştirilmiştir. Astar dizileri: Wnt-4: İleri 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' ve ters 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT: ileri 5 <em> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' ve ters 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada anlatılan ex vivo kültür normalde insan kadın meme bulunan diğer hücre tipleri ile birlikte sağlam kanalları ve lobülleri içeren meme dokusu mikro sağlar. Genellikle azaltma tekniği mevcut ameliyat teknikleri elde edilen insan göğüs dokusunun işlenmesi sırasında, yağ dokusu, stromal matrisin mekanik ve enzimatik sindirme ve kırmızı kan hücrelerinin lizizine çıkarılması süt kanalı parçaları ve terminal duktal lobüler birimleri zenginleştirir. Sağ süresince doğru konsantrasyonda yumuşak enzimatik sindirimiyle, doku mikro bozulmamış kalmasını sağlamak için birden çok hücre tipleri korumak ve büyük ölçüde hücre dışı matrisler korumak için esastır. Dikkat da hızla kez hasta kaldırıldı doku işleme dikkat edilmelidir. Hasta örnekleri önemli ölçüde farklı olması, mekanik ve enzimatik sindirim uzun olması gerekebilir ve / veya doku kolajen içeriği, özellikle yüksek olduğunda ilave enzim ilave edilmesi gerekmektedir.

Mikroyapılar kadar 6 gün için% 90 canlı kalmasına rağmen, modelin uzun süreli hormon uyarılara için sınırlamalar vardır. Farklı hücre tipleri, farklı yarı-ömürleri gibi, hücresel kompozisyon zamanla değişmesi muhtemeldir. Doku mikro infiltrasyonlu immün hücrelere korumak da doku vücudun dolaşım çıkarılır çıkarılmaz şu doldurulan değildir. Örneklerin çok sayıda nedeniyle arası hasta varyasyon analiz edilmesi gerekiyor Dahası, cerrahi örneklerini sağlayan klinik ortakları ile sağlam bir boru hattı gereklidir. Doku mikroyapıları daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. Ancak, ne ölçüde donma ve çözülme farklı hücre tipleri için muhtemelen farklı olarak hücre canlılığı, etkiler ve bu hormon yanıtı değiştirebilir nasıl ne, karakterize edilmemiştir. Elde edilecek doku mikroyapıların miktarı tahmin etmek zor olan herhangi mammoplasty gibi deneyler Planlama zor olabilir.

ex vivo model insan meme fizyolojik hormon eylem incelemek için ilk modelini sunar. Primer meme epitel hücreleri için gelişmiş 3D kültür sistemleri geliştirilmiş olmasına rağmen, bu ex vivo sistem doku mimarisi ve birkaç gün içinde hücresel karmaşıklığı korur. Bunun bir sonucu olarak, hormon reseptörü pozitif hedef hücrelerine tepki sadece analiz edilebilir, ancak alt baş diğer hücre tiplerinde parakrin sinyal olayları incelemek için uygun hale gelir. mikro deney süresi boyunca bir büyüme faktörü içermeyen ortam içinde tutulmaktadır. Bu nedenle, sinyal iletim hiçbir karıştırıcı dışsal aktivasyon vardır. Gibi, meme dokusu mikroyapıları daha yakından insan meme biyolojik karmaşıklığını yansıtan bir ortamda soruları imkanı sunuyoruz.

Ex vivo sistem br yanıtını değerlendirmek için kullanılabilirDoğal ve sentetik hormonlar doğu. Bu meme kanseri insidansı artan ışığında çok önemlidir. Bundan başka, ilaçlar, küçük moleküller, peptitler, büyüme faktörleri ve sitokinlerin uygulanabilir ve hücre proliferasyonu, apoptoz ve sinyalleşme üzerindeki etkileri incelenmelidir.

Mevcut ayrıntılı açıklaması, diğer araştırmacılar tarafından bu yöntemin kullanımını kolaylaştırmak ve laboratuvarlar arası varyasyonu en aza indirmek içindir. Bu yaklaşım, hasta numunesi üzerinde dayanır gibi, bu sonuçlar farklı laboratuvarlarda 15 arası hasta değişkenliği daha iyi takdir mümkün olur arasında karşılaştırılabilir başlayabilirsiniz böylece standart bir yöntem kullanılması büyük önem taşımaktadır. Yazarlar geribildirim için teşekkür ederiz ve bu protokolün revize sürümleri iyileştirmeler entegre mutlu olacaktır. İnsan örnekleri ile çalışması çok zor ve yazarlar ilginç biyolojik örneklerin daha öteleme araştırmaları teşvik etmek istiyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar mamoplasti fotoğrafı sağlamak için Lozan Üniversitesi Hastanesi M. Fişini teşekkür, M. Wirth ve Deneysel Kanser Araştırma Enstitüsü İsviçre, Araştırma Moleküler Onkoloji Yeterlilik Ulusal Merkezi, Yaşam Bilimleri Okulu, Ecole Polytechnique Fédérale de A. Ayyanan eleştirel yorumlar için Manchester Üniversitesi teknik yardım için Lozan ve R. Clarke. Bu sonuçlara önde gelen araştırma herhangi bir hibe anlaşması kapsamında SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817 ve Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Taahhüt destek aldı. Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) ve tür katkı İlaç Sanayi ve Dernekleri şirketlerin 'Avrupa Federasyonu mali katkısı oluşan kaynaklar olan 115.188. Yenilikçi İlaçlar Girişimi Web adresi http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).

Tags

Tıp Sayı 95 Hormon sinyal meme kanseri küçültme mamoplasti meme dokusu mikro yapılar, östrojen progesteron meme epitel hücreleri doku sindirim parakrin sinyal mikroçevresinin doku mimarisi

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter