Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi har utvecklat ett nytt ex vivo modell för att studera hormonverkan i människobröst. Den är baserad på vävnadsmikro isolerade från kirurgiska bröstvävnadsprover som bevarar vävnadsarkitektur, intercellulära interaktioner, och parakrin signalering.

Abstract

Studien av hormonet åtgärder på människans bröst har försvårats av bristen på lämpliga modellsystem. Vid in vitro-kultur, primära bröstepitelceller tenderar att förlora hormonreceptoruttryck. Allmänt använda hormonreceptorpositiv bröstcancer cellinjer är begränsad relevans för in vivo situationen. Här beskriver vi en ex vivo-modell för att studera hormonverkan i människobröst. Färska humana bröstvävnadsprover från kirurgiska kasserat material såsom reduktions mammoplasties eller mammectomies är mekaniskt och enzymatiskt rötas för att erhålla vävnadsfragment som innehåller kanaler och lobules och flera typer stromal cell. Dessa vävnadsmikro hålls i basal medium utan tillväxtfaktorer bevara sina intercellulära kontakter, vävnaden arkitekturen, och förblir hormon lyhörd i flera dagar. De är lätt behandlas för RNA och protein extraktion, histologisk analys eller lagras i frysmedium. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan användas för att anrika specifika cellpopulationer. Protokollet ger en enkel, vanlig metod för translation studier med mycket komplexa, varierade humana prover.

Introduction

Information om mutations landskapet i bröstcancer ökar i snabb takt. Mindre uppmärksamhet har ägnats åt system faktorer som påverkar bröstcancerutveckling. Exponering för reproduktiva hormoner har en stor inverkan på sjukdomsförloppet 1-3. Ändå är de mekanismer genom vilka reproduktiva hormoner påverkar den mänskliga bröst dåligt kända. Arbeta med genetiskt modifierade musmodeller har avslöjat att de innebär cell inneboende och parakrint signalering genom flera nedströms effekten 4.

Den begränsade kunskapen om hormon åtgärder på människans bröst är till stor del hänförlig till en brist på lämpliga modeller. De flesta arbetar på de mekanismer för östrogenreceptor (ER) och progesteronreceptorn (PR) signalering har utförts med hormonreceptorpositiv bröstcancer cellinjer, såsom MCF-7 och T47D. Dessa härleddes från pleurala utgjutningar från patienter med avancerad bröstcancer som hade already fått flera behandlingar 5. Den biologiska relevansen av resultaten i sådana enkla in vitro-modeller av människobröst är tvivelaktiga och målgener identifierats i dessa in vitro-modeller är skiljer sig från målgener som identifieras i djurmodeller 6. När primära humana bröst epitelceller odlas in vitro tenderar de att förlora hormonreceptoruttryck och därmed hormonsvar 7,8. Detta problem kan circumventd med sofistikerade 3D tillvägagångssätt med matrigel. På detta sätt, C. Clarke och kollegor lyckats etablera bröstepitelceller som underhålls hormonreceptorexpression och som visade ett proliferativt svar på progesteron stimulering 9. Ändå två viktiga in vivo progesteronreceptor målgener, Wnt-4 och RANKL, inte inducerades vid progesteron stimulering i detta system 9. Detta tillvägagångssätt har nyligen tagit på ytterligare med in vitro 10. En varning kvarstår att matrigel har aktiviteter som är satsberoende, är dyrt, och kräver en experimentell design som är apt för små cell endast siffror.

Utifrån konstaterandet att in vivo ER och PR-signalering till stor del medieras av parakrina interaktioner 11, hävdade vi att intercellulära interaktioner måste upprätthållas. En annan viktig faktor som går förlorad som vävnader dissocieras till enskilda celler för in vitro-kultur är växelverkan av de epitelceller med den extracellulära matrisen; men dessa är avgörande för epitelial differentiering och deras störningar är viktig i tumörbildning 12. Med detta i åtanke har vi etablerat en metod för att isolera bröstvävnadsmikro från färsk kirurgisk kasserat material 13. Bröstet parenkym, som består av en två-skiktad epitel med inner luminal och yttre myoepithelial-celler, dissekeras bort från fettvävnad och utsattes för mekanisk och enzymatisk dissociation. Efter tvättning och centrifugering, är fragment av mjölkgångarna erhålls som behåller nära samspel med många stromaceller. Dessa vävnadsmikro förblir hormon lyhörd. Modellen validerades i kliniska prover 13. Som sådan, kan detta förfarande bidra till att studera hormon åtgärder i bröstet i en biologiskt och kliniskt relevant sammanhang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Allmänna överväganden: Inför tid, inrätta en etisk protokoll, förbereda frågeformulär för patienter, och se till att utbilda de kliniska personalen. Innan du använder material från minskning mammoplasty kirurgi, upphandla tillstånd, och se till patientens medgivande. Vävnad kan vara smittförande och måste hanteras därefter. Detta protokoll godkändes av den etiska kommitté ISREC - schweiziska institutet för experimentell cancerforskning.

1. Vävnads Recovery, bearbetning och Bio-banking

För att säkerställa optimal provkvalitet för bio-banking, är ett antal steg som utförs på sjukhuset innan de transporteras till laboratoriet.

På sjukhuset:

  1. Skaffa humana bröstvävnad under sterila förhållanden från reduktion mammoplasty kirurgi och blodprov, om det behövs. Tissue måste undersökas av patolog som kommer att prova att utesluta förekomsten av maligna lesioner.
  2. Placera bröst tutfärda under huven på en steril ombord och förbereda sax, kirurgisk skalpell och pincett som redan är steriliserade med ånga autoklav. Gör djupa snitt på olika platser i bröstvävnaden med hjälp av en skalpell för att öppna den. I human bröstvävnad leta efter vita trådar som består av kanaler och lobules, som är inbäddade i gult fettvävnad.
    OBS: Förhållandet mellan den vita parenkymal till den gula fettvävnad skiljer bland kvinnor; vanligtvis yngre kvinnor har mer epitelvävnad.
  3. Plocka bitar av vitt material och hålla dem med pincett, sedan separera dem försiktigt från fettvävnad med en sax. Undvik att ta blodkärl.
  4. Skölj vävnadsbitar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2 för att avlägsna blod. Överför vävnaden till 250 ml plastflaskor som innehåller F12-medium (Dulbeccos modifierade Eagles medium F12) utan fenolrött med 2% penicillin / streptomycin (inklusive 5000 enheter / ml penicillin och 5000 g / ml streptomycin) och 1% entibiotic / amfotericin B (inklusive 10000 enheter / ml penicillin, 10000 pg / ml streptomycin och 25 ug / ml av amfotericin B). Förvara vävnader i medium för transport till laboratoriet.
  5. Förbered bitar av 3 - 5 mm diameter för RNA och protein extraktion och blixt frysa dem i cryovials med kallt (torris) isopentan. Överföra dem till torris box för transport till laboratoriet.
  6. Placera bitar av 3 - 5 mm i mögel och täck den med ett lager av Optimal Cutting Temperatur (OCT) och sedan placera formen på den plana botten av låda fylld med kallt isopentan. Efter fullständig frysning överföra formen till torrislåda.
  7. Fix 5 st av 3 - 5 mm diameter i paraformaldehyd (PFA) 4% och ytterligare 5 stycken i formaldehyd (FA) 4% i PBS vid RT histologisk analys senare. Två olika fixativ rekommenderas som vissa antikroppar fungerar bättre med den ena eller den andra av de två.

I laboratoriet:

  1. Göracument all information om minskningen mammoplasty, är dagen för kirurgi och huruvida proverna härrörande från vänster kontra höger bröst.
  2. Placera de frysta proverna vid -80 ° C och överföra de fasta vävnaderna i histologi kassetter efter 2 h av fixering. Sedan satte dem antingen i PBS eller 70% etanol, för O / N förvaring vid 4 ° C. Nästa dag, överföra histologiska kassetter till histologi anläggningar för paraffininbäddning.

2. Vävnads Matsmältning och hormonstimulering

  1. Överför flaskorna innehåller vävnadsprover till ett laminärt flöde skåp i en P2 cellodling rummet. Placera vävnads bitar på steril skärbräda (29 x 19 cm). Håll materialet med pincett och skrapa resterande fett och kärl från bröst parenkymet (vita delen) med skalpell. Placera den vita materialet i PBS i en 10 cm odlingsskål.
  2. Efter avlägsnande av fett material från alla bitar och avyttra dem i enlighet med säkerhetsregels av laboratoriet, placera de vita delarna innehåller epitelvävnader tillbaka på skärbrädan. Använda motsatta skalp skära vävnaden och hacka den i bitar på upp till 2 mm i diameter.
  3. Placera malet materialet till rör med lämplig storlek: upp till 1, 2,5 och 10 ml till en 5, 15 eller 50 ml rör, respektive. Typiskt en 5 ml tub avkastning tillräckligt material för paraffin inbyggnads och hormon stimuli, och ett 15 ml rör avkastningen tillräckligt material för Fluorescens Aktiverat cellsortering (FACS). Större rör används för att frysa portioner.
  4. Förbered matsmältningen masterblandning bestående av medium (DMEM / F12 utan fenolrött) med 1% penicillin / streptomycin / amfotericin B och kollagenas A (Clostridiopeptidase A från Clostridium histolyticum). Dos kollagenas enligt digestionstid.
    1. För 12, 24, och 36 h av inkubation, använder slutkoncentration av kollagenas av 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml och 0,5 mg / ml. Lägg matsmältningen Master Mix upp till 4 gånger ivolymen av det digere materialet för att säkerställa tillräcklig omröring och luftning.
      OBS: Beroende på experimentell design och varaktigheten av hormonstimulering, lägga hormoner antingen under eller efter enzymatisk spjälkning steget och mikro återhämtning.
  5. Lägg hormon (s) vid önskad koncentration för att testa prover och fordonet till kontrollen. För stimulering med 17-β-estradiol, och promegeston (R5020) använder en slutlig koncentration av 20 nM.
    OBS: R5020 är en syntetiskt progesteron-receptoragonist, vilket är mer stabil än naturligt progesteron i medium.
    1. Placera rören på rullblandare inuti en inkubator vid 37 ° C och 40 rpm O / N. Innan du placerar proverna på mixern, resuspendera dem mycket väl att se till att allt material distribuerar längs centrifugrör.
  6. Som matsmältningen tar minst 12 timmar (O / N), för hormonstimulering tider på mindre än 12 timmar, lägg hormonerna efter återvinning av mikro (detailed under steg 3). Lägg hormonerna som du resuspendera mikro och placera suspensionen på ultralåga fästplattor. Vävnadsmikrostrukturer kan hållas på ultralåg fastsättningsplattor för upp till 7 dagar i tillväxtfaktorfritt medium bevarar omkring 70% viabilitet.
  7. För RNA och proteinanalys, ta vävnadsmikrostrukturer genom centrifugering vid 400 xg under 5 min och blixt frysa i centrifugrör.

3. Återvinning av vävnadsmikrostrukturer

  1. Centrifugera röret (er) vid 400 xg under 5 minuter. Aspirera fettet från toppen av centrifugröret och överför supernatanten av den återstående vattenhaltiga supernatanten, som är anrikad i fibroblaster, i ett annat centrifugrör och centrifugera vid 1250 xg under 5 minuter.
    NOTERA: Som bröstvävnaden mikrostrukturer är mycket klibbiga, för alla efterföljande steg suspendera pelleten genom försiktig omskakning av röret. Pipettering rekommenderas inte på grund av risken att förlora material. Resuspendera pellets anrikade på mikrostrukturer och i fibroblaster härledda från vattenhaltig överliggande vätska i PBS, 2% fetalt kalvserum (FCS). Därefter snurra båda rören vid 1250 xg under 5 min och sedan kasta supernatanterna.
  2. Resuspendera pellets i 3 - 5 ml röda blodkroppar blodlyseringsbuffert och överföra dem till rena rör. Inkubera dem för 5 min vid RT.
  3. Lägg 2x volym PBS, 2% FCS och centrifugera dem vid 1250 xg under 5 minuter. Tvätta pellets med PBS, 2% FCS och centrifugera vid 1250 xg under 5 minuter. Upprepa detta steg två gånger.

4. Prover för flödescytometri

  1. Lägg 1-2 ml trypsin 0,25% till pelleten och blanda det genom att pipettera upp och ned mycket sakta i 2 min med en 1000 ul pipetman att dissociera cellerna.
  2. Inhibera trypsinaktivitet genom tillsats 9 ml PBS, 2% FCS. Centrifugera vid 450 xg under 5 min och återsuspendera pelleten i 10 ml PBS, 2% FCS.
  3. Överför cellsuspension på en 40 ìm cell sil placerad på top av en 50 ml centrifugrör för att framställa enstaka celler. Om några mikroliter cellsuspension kvar på toppen av filtret, hjälpa dem att passera genom filtret genom att aspirera dem från den andra sidan av sil med en pipett och lägga till dem i de filtrerade mikrostrukturer.
  4. Separata immunceller, fibroblaster och endotelceller från mikrostrukturer med en cocktail av anti-CD45, anti-FAP och anti-CD31-antikroppar och sedan sortera dem med FACS, baserad på pan-epitelial markör EpCAM och CD10 att separera luminala och basalceller respektive 10 .

5. Prover för histologi

  1. Efter tvättning av mekaniskt och enzymatiskt digere material som beskrivits ovan, fixa pellets från 1,5 ml ursprunglig material i en ml av 4% PFA i PBS vid RT i 30 min.
  2. Centrifugera vid 1250 xg under 5 minuter och tvätta med 1 - 2 ml PBS två gånger.
  3. Centrifugera vid 16000 xg under 10 min. Under denna tid, förbereda en% universal agaros i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert och värm lösningen i mikrovågsugnen tills lösningen kommer till en koka.
    1. Ta lösningen från mikrovågsugnen och snurra kolven försiktigt så att lösningen blandas och slamma eventuella kvar agarospartiklar. Kall agaroslösning till 50 ° C och häll 1 ml i en paraffinbas mögel dimensionerad 31 × 23 × 13,5 mm.
  4. Kasta bort supernatanten och placera pellets ovanpå det stelnade skiktet (1-3 mm) av agaros med användning av en spatel med en plan ände. Täck dem alla med ett extra lager av agaros (40 ° C).
  5. Efter agarosen stelnar, vanligtvis inom 5 minuter, satte agarosblock i histologi kassetter för paraffin ingjutning. Tillsammans med agarosen proverna lägger ett vitt kontorspapper i kassett med all information om minskningen mammoplasty numret, experimentell skick, och datum skriven med små bokstäver i blyerts; denna skrift tål alla efterföljande behandlingssteg.
  6. Sätt kassetterna iPBS O / N, eller i 70% etanol för förvaring över helgen, vid 4 ° C. Vi har inte märkt någon skillnad mellan de två lagringslösningar. Överföra Sedan histologi kassetter till histologi anläggningar för paraffininbäddning.

6. Frysmikrostrukturer (Future Odling)

  1. Resuspendera vävnadsmikrostrukturer i frysmedium bestående av FCS med 10% dimetylsulfoxid (DMSO) och frysa 1 ml portioner i cryovials. Antalet erhållna cryovials beror på mängden av primärmaterial som erhållits från reduktion mammoplasty.
  2. Frys kryokärl innehållande vävnadsmikrostrukturer med användning av en kontrollerad hastighet frys med följande program: 5 min bostad vid 4 ° C, minskning av temperaturen till -7 ° C med hastighet av 6 ° C / min, minskning av temperaturen till -12 ° C med hastighet av 6 ° C / min, 10 min bostad, minskning av temperaturen till -40 ° C med hastighet av 6 ° C / min, minskar i temperatur till -80 ° C medhastighet av 6 ° C / min. Överföra sedan cryovials till -80 ° C frys.
  3. Nästa dag, överföra cryovials från -80 ° C till flytande kväve tank för lång lagring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att studera betydelsen av östrogener och progesteron och att bättre förstå deras molekylära funktioner i människobröst, vi samlar färska humana bröstvävnadsprover från patienter som genomgår reduktions mammoplasties (Figur 1) efter att ha erhållit sitt informerade samtycke. Vi erhåller också patienternas medicinska och reproduktiv historia, såväl som ett blodprov för att bestämma serumprogesteronnivåer vid tidpunkten för operation. Vävnad från färska reduktions mammoplasties är mekaniskt och enzymatiskt dissocierade. Det erhållna tissuemikrostrukturerna har ledningar och lobules karakteristiska av bröstvävnaden ursprungs (Figur 2A). Immunhistokemisk analys av agaros och paraffininbäddade vävnadsmikrostrukturer som färgats för den myoepitelial markör ΔNp63 (figur 2B) visar att mikrostrukturer behåller inte bara de morfologiska egenskaperna hos den normala bröstvävnad utan även den molekylära profilen av cell populationer.

För att bedöma hormonsvar, var vävnadsmikro behandlades antingen med syntetiskt progesteron-receptoragonist promegeston (R5020) eller etanol kontroll. Att berika för hormonreceptor positiva luminala celler flödescytometri utfördes baserat på epitelial (EpCAM) och myoepitelial markör (CALLA; figur 3A) efter utarmning för endotelial, fibroblaster och immunceller med en cocktail av anti CD31, anti-FAP och anti- CD45-antikroppar. QRT-PCR-analys av EpCAM +, CD10- celler visade uppreglering av målgenen progesteron Wnt-4 (figur 3B) i den luminala cellen anrikad population från R5020 exponerade vävnadsmikrostrukturer.

Figur 1
Figur 1. Bröstvävnadsprov. Fotografera av nyligen dissekerade minskningen mammoplasty prov. Pilarna pekartill vita vävnads trådar som innehåller bröst parenkym, dvs, mjölkgångarna och terminal duktala lobulär enheter. Inbäddade i riklig gul fettvävnad. Medan färgen på fettet gör är förenligt mellan patienter, andelen fettvävnad, vanligtvis den största delen av bröstvävnad i fråga om volym, varierar. Skala bar:. 5 mm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Vävnadsmikrostrukturer. (A) Bright fält bilden av mikro odlas på en låg fästplatta för 48 timmar efter mekanisk dissociation och enzymatisk nedbrytning. Skalstreck: 40 ^ m (B) mikrograf av en histologisk sektion på vävnadsmikrostrukturer inbäddade i agaros och paraffin efter 3 dagar i.kultur. Avsnittet utsattes för immunhistokemisk färgning för myoepitelial markör ΔNp63 och counterstained med hematoxylin. Pilspetsar pekar på de inre, luminala celler, pilar pekar på ΔNp63 positiva myoepitelceller. Skala bar:. 40 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Flödescytometri sorterings separation och RNA-analys av vävnadsmikrostrukturer. (A) Separation av de olika cellpopulationer från vävnadsmikrostruktur som behandlats med R5020 eller etanol genom flödescytometri. Vävnadsmikrostrukturer dissocierades och immunodepleted för immunceller, fibroblaster, och endotelceller med en cocktail av anti-CD45, anti-FAP, och anti-CD31-antikroppar. Celler märktes med Antibodör mot Epithelial celladhesionsmolekyl (EpCAM) (klon HEA-125) för att berika för luminala cellpopulation (grön) och Common akut lymfatisk leukemi Antigen (CD10 / CALLA) för myoepitelceller (Clone SS2 / 36). En representativ scatter blot visas. (B) Stapeldiagram visar relativa Wnt-4 mRNA expressionsnivåer i luminala subpopulation från vävnadsmikrostrukturer (grön prick moln, panel A) inducerade med etanol eller R5050 för 24 timmar. Relativa mRNA expressionsnivåer av målgenen progesteron, Wnt-4 normaliserad mot mRNA-nivåer av hypoxantin-guaninfosforibosyltransferas (HPRT). Visade data representerar medelvärde ± SD av trippelprover. RNA-isolering och QRT-PCR utfördes som beskrivits tidigare 14. Primersekvenser: Wnt-4: framåt 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' och omvänd 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT: framåt 5 <em> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3 "och bakåt 5' - CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3 '. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den ex vivo kulturen beskrivs här ger bröstvävnad mikrostrukturer som innehåller intakta kanaler och lobules, tillsammans med andra celltyper som normalt finns i den mänskliga kvinnliga bröst. Vid bearbetningen av den humana bröstvävnad erhålls vanligen från reduktions mammoplasties, avlägsnande av fettvävnad, mekanisk och enzymatisk nedbrytning av den stromala matrisen och lys av röda blodkroppar berikar för mjölkkanal fragment och terminala duktala lobulära enheter. Gentle enzymatisk spjälkning vid rätt koncentration, för rätt länge är viktigt att säkerställa att vävnadsmikrostrukturer förblir intakt, behålla flera celltyper och till stor del bevara sina extracellulära matriser. Uppmärksamhet bör också ägnas åt att bearbeta vävnaden snabbt när avlägsnats från patienten. Patientprover varierar kraftigt och mekanisk och enzymatisk nedbrytning kan behöva förlängas, och / eller extra enzym behöver tillsättas när vävnaden är särskilt hög i kollageninnehåll.

Även mikro kvar 90% lönsamt för upp till 6 dagar, har modellen begränsningarna för långsiktiga hormon stimuli. Eftersom olika celltyper har olika halveringstider, kommer sannolikt att förändras över tiden den cellulära sammansättningen. Medan vävnadsmikro bevara infiltrerande immunceller, dessa inte fyllas eftersom vävnaden avlägsnas från kroppens cirkulation. Vidare är en solid pipeline med kliniska partners som tillhandahåller de kirurgiska exemplar krävs som ett stort antal prover behöver analyseras på grund av bland patientens variation. Vävnadsmikro kan frysas för senare användning. Men i vilken utsträckning nedfrysning och upptining påverkar cellernas livskraft, möjligen differentiellt för olika celltyper, och hur detta kan påverka hormonsvar, har inte karakteriserats. Planering av experiment kan vara svårt som för alla mammoplasty mängden vävnadsmikrostrukturer som kommer att erhållas är svårt att förutse.

ex vivo modell den första modellen för att studera fysiologiska hormonverkan i människans bröst. Även avancerade 3D ​​odlingssystem för primär bröst epitelceller har utvecklats, bevarar detta ex vivo systemet vävnaden arkitekturen och dess cellulära komplexitet under flera dagar. Som ett resultat, kan inte bara svaret i hormonreceptorpositiva målceller analyseras men händelserna nedströms parakrin signalering i andra celltyper blir mottaglig för att studera. De mikrostrukturer hålls i tillväxtfaktorfritt medium under hela varaktigheten av försöken. Det finns därför ingen confounding extrinsic aktivering av signaleringskaskader. Som sådan, bröstvävnaden mikro erbjuder möjligheten att ta upp frågor i en inställning som speglar bättre de biologiska komplexiteten i det mänskliga bröstet.

Ex vivo-system kan användas för att bedöma responsen hos brösterut till naturliga och syntetiska hormoner. Detta är mycket viktigt med tanke på en ökad förekomst av bröstcancer. Vidare kan läkemedel, små molekyler, peptider, tillväxtfaktorer och cytokiner appliceras och deras effekt på cellproliferation, apoptos och signalering studeras.

Föreliggande detaljerade beskrivning är avsedd att underlätta användningen av denna metod av andra forskare och att hjälpa till att minimera interlaboratorievariation. Eftersom denna metod bygger på patientprover, är det av yttersta vikt att en standardiserad metod används så att resultaten kan börja jämföras mellan olika laboratorier 15 och en bättre bedömning av bland variabiliteten blir möjlig. Författarna uppskattar återkoppling och kommer gärna att integrera förbättringar i reviderade versioner av detta protokoll. Arbetet med mänskliga prover är mycket utmanande och författarna hoppas att stimulera mer translationell forskning med intressanta biologiska prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna.

Acknowledgments

Författarna tackar M. Fiche av Universitetssjukhuset i Lausanne för att tillhandahålla mammoplasty fotografiet, M. Wirth och A. Ayyanan schweiziska institutet för experimentell cancerforskning, National Center of Competence i forskning molekylär onkologi, Institutionen för livsvetenskaper, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne för tekniskt bistånd och R. Clarke för University of Manchester för kritiska kommentarer. Den forskning som leder till dessa resultat har erhållit stöd från SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, och innovativa gemensamma företaget Medicines Initiative enligt bidragsavtal nr. 115188, varav resurser består av ekonomiska bidrag från EU: s sjunde ramprogram (FP7 / 2007-2013) och Europeiska federationen för läkemedelsbranschorganisationen företagens naturabidrag. Webbadressen Initiativet för innovativa läkemedel är http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).

Tags

Medicin Hormone signalering bröstcancer minskning mammoplasty bröstvävnad mikrostrukturer, östrogen progesteron bröstepitelceller vävnad matsmältningen parakrin signalering mikromiljö vävnadsarkitektur

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell för att studera Hormone Action i Human Breast
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter