Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

Мы разработали новую Экс Vivo модель для изучения действия гормонов в груди человека. Он основан на ткани микроструктур, выделенных из хирургические образцов ткани молочной железы, сохраняющих ткани архитектуру, межклеточные взаимодействия и паракринную сигнализации.

Abstract

Исследование действия гормонов в груди человека был затруднен из-за отсутствия адекватных модельных системах. По культуре в пробирке, первичные эпителиальные клетки молочных желез, как правило, теряют экспрессии рецептора гормона. Широко используются гормон рецепторов линии положительное клеток рака молочной железы имеют ограниченное отношение к в естественных условиях ситуации. Здесь мы опишем Экс Vivo модель для изучения действия гормонов в груди человека. Свежие образцы молочной железы человека из тканей хирургическим сброса материала, такого как mammoplasties сокращения или mammectomies механически и ферментативно переваривается, чтобы получить фрагменты тканей, содержащих каналы и дольки и несколько типов стромальных клеток. Эти ткани микроструктуры хранящиеся в базальной среде без факторов роста сохраняют свои межклеточные контакты, архитектура ткани и остаются гормона реагировать в течение нескольких дней. Они легко обрабатываются для РНК и извлечения белка, гистологического анализа или хранить в замораживании среду. ФлуоресценцияАктивированный сортировки клеток (FACS) может быть использован для обогащения конкретных клеточных популяций. Этот протокол обеспечивает простой, стандартный подход для трансляционных исследований с исключительно сложной, разнообразной человека образцов.

Introduction

Информация о мутационный пейзаж рака молочной железы увеличивается на быстром темпе. Меньше внимания уделялось системных факторов, которые влияют на развитие рака молочной железы. Воздействие половых гормонов имеет большое влияние на прогрессирование заболевания 1-3. Тем не менее, механизмы, с помощью которых репродуктивные гормоны посягают на груди человека мало изучены. Работа с генетически мышиных моделях показали, что они связаны с клеточной внутренней и паракринную сигнализацию через несколько нижестоящих эффекторов 4.

Ограниченные знания о действия гормонов в груди человека в значительной степени объясняется отсутствием адекватных моделей. Большая часть работы по механизмам рецептора эстрогена (ER) и рецептора прогестерона (PR) сигнализации была выполнена с рецептор к гормону клеточных линий рака молочной железы, таких как MCF-7 и T47D. Они были получены из плеврального выпота у пациентов с распространенным раком молочной железы, которые были alreaду получил несколько процедур 5. Биологическая значимость результатов в таких простых моделей в пробирке в человеческой груди является спорным вопросом, гены-мишени, указанные в этих моделях в пробирке отличаются от генов-мишеней, которые определены в животных моделях 6. При первичной молочной железы человека эпителиальные клетки культивируют в пробирке, они теряют экспрессию рецептора гормона и, следовательно, гормон ответ 7,8. Эта проблема может быть circumventd изощренными 3D подходов с использованием Матригель. Таким образом, Кларк и его коллеги преуспели в создании молочной железы эпителиальные клетки, которые поддерживали экспрессию рецептора гормона и показал пролиферативного ответа на стимуляцию прогестерона 9. Тем не менее, два важных в естественных целевых генов рецептора прогестерона, Wnt-4 и RANKL, не индуцируется при стимуляции прогестерона в этой системе 9. Этот подход был недавно принял дальше с в пробирке 10. Предостережение остается то, что матригель имеет виды деятельности, которые партия-зависимыми, стоит дорого, и требует экспериментального дизайна, что, вероятно, для только небольшое количество клеток.

Основано на обнаружении того, что в естественных условиях ER и PR сигналов в значительной степени, опосредованного паракринных взаимодействий 11, мы утверждали, что межклеточные взаимодействия должны быть сохранены. Еще одним важным фактором, который теряется в виде тканей диссоциируют на отдельные клетки культуры в пробирке являются взаимодействия эпителиальных клеток с внеклеточным матриксом; пока они имеют решающее значение для дифференциации эпителиальных и их нарушение является важным в туморогенеза 12. Имея это в виду, мы разработали способ, чтобы изолировать ткани молочной железы микроструктур из свежих хирургического сброса материала 13. Паренхимы, состоящий из двухслойного эпителия с внутренней просвета и наружной myoepitheliAl клетки, отсечен от жировой ткани и подвергают механической и ферментативной диссоциации. После промывки и центрифугирования, фрагменты молочных протоков получаются, которые сохраняют тесное взаимодействие со многими стромальных клеток. Эти ткани микроструктуры остаются гормон реагировать. Модель была подтверждена в клинических образцах 13. Таким образом, настоящее процедура может помочь изучать действие гормонов в груди в биологически и клинически соответствующем контексте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Общие соображения: загодя, созданных протокол этика, подготовить вопросники для пациентов, и посмотреть на обучение клинического персонала. Перед использованием материала из редукционная маммопластика хирургии, обеспечить разрешений, и обеспечить согласие пациента. Ткань может быть инфекционным и должен быть обработан соответствующим образом. Этот протокол был одобрен этическим комитетом ISREC - Швейцарский институт экспериментальных исследований рака.

1. Ткань Recovery, производство и Bio-банкинг

Для обеспечения оптимального качества образца для био-банкинга, количество шагов осуществляется в больнице до транспортировки в лабораторию.

В больнице:

  1. Получить тканях молочной железы в стерильных условиях в результате сокращения маммопластика хирургии и крови, если это необходимо. Ткань должна быть рассмотрена патологоанатома, который будет отведать исключить наличие злокачественных новообразований.
  2. Поместите груди твыдавать под капотом на стерильной доски и подготовить ножницы, хирургический скальпель и пинцет, которые уже стерилизованы с парового стерилизатора. Сделайте глубокий вырез на различных участках ткани молочной железы с помощью скальпеля, чтобы открыть его. В ткани молочной железы человека искать белых нитей, состоящих из воздуховодов и долек, которые встроены в желтом жировой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: соотношение белого паренхимы к желтому жировой ткани отличается у женщин; как правило, молодые женщины имеют более эпителиальной ткани.
  3. Выберите куски белой материи и держать их щипцами, а затем разделить их осторожно из жировой ткани с помощью ножниц. Избегайте брать кровеносные сосуды.
  4. Промыть кусочки ткани в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,2, чтобы удалить кровь. Передача ткани до 250 мл пластиковые флаконы, содержащие среду F12 (средний F12 модифицированной Дульбекко Игла) без фенолового красного с 2% пенициллина / стрептомицина (в том числе 5000 ед / мл пенициллина и 5000 мкг / мл стрептомицина) и 1% ANtibiotic / амфотерицин В (в том числе 10000 единиц / мл пенициллина, 10 000 мкг / мл стрептомицина и 25 мкг / мл амфотерицина B). Магазин тканей в среде для транспортировки в лабораторию.
  5. Подготовка части 3 - диаметром 5 мм для РНК и белка добычи и вспышкой заморозить их в криопробирки холодным (сухой лед) изопентана. Перевести их в сухом боксе со льдом для транспортировки в лабораторию.
  6. Положите кусочки 3 - 5 мм в форму и покрыть ее слоем оптимального раскроя температура (ОКТ), а затем поместить форму на плоской нижней части ящик, наполненный холодной изопентана. После полного замораживания передавать форму в окне сухого льда.
  7. Fix 5 штук 3 - 5 мм в диаметре в параформальдегиде (PFA) 4%, еще 5 штук в формальдегид (ФА) 4% в PBS при комнатной температуре гистологического анализа позже. Два различных фиксаторы рекомендуется, поскольку некоторые антитела лучше работать с одной или другой из этих двух.

В лаборатории:

  1. Сделатьдокументарные всю информацию о маммопластики восстановления, дата операции и будет ли образцов получены слева по сравнению с правой груди.
  2. Поместите замороженные образцы при -80 ° С и передачи фиксированных тканей в гистологии кассеты после 2 ч фиксации. Затем поместите их либо в PBS, или 70% этанола, для O / N хранении при 4 ° С. На следующий день, трансфер гистологии кассеты в гистологии объектов для парафин.

2. Ткань Пищеварение и гормональная стимуляция

  1. Передача бутылки, содержащие образцы тканей к шкафу с ламинарным потоком в комнате Р2 клеточной культуре. Поместите кусочки ткани на стерильных разделочную доску (29 х 19 см). Держите материал с пинцетом и очистить оставшиеся жировые и сосуды от паренхимы молочной железы (белая часть) скальпелем. Поместите белый материал в PBS в 10 см блюдо культуры.
  2. После удаления жирных материал из всех частей и утилизации их в соответствии с правилом безопасностис лабораторией, поместите белых частей, содержащих эпителиальных тканей обратно на разделочную доску. Использование противоположные скальпели резать ткань и нарезать его на куски диаметром до 2 мм.
  3. Поместите фарш материал в пробирки соответствующего размера: до 1, 2,5 и 10 мл в 5, 15 или 50 мл пробирки, соответственно. Обычно 5 мл дает трубки достаточно материала для парафина заделки и гормонов стимуляции и в 15 мл дает трубки достаточно материала для клеток с возбуждением флуоресценции Сортировка (FACS). Большие трубы используются для замораживания аликвот.
  4. Подготовка пищеварения мастер смесь, состоящую из среды (DMEM / F12 без фенола красного) с 1% пенициллина / стрептомицина / амфотерицина В и коллагеназы А (Clostridiopeptidase А из Clostridium histolyticum). Доза коллагеназы в соответствии с временем пищеварения.
    1. Для 12, 24 и 36 ч инкубации, использовать конечную концентрацию коллагеназы 1,5 мг / мл, 1,0 мг / мл и 0,5 мг / мл соответственно. Добавить мастер пищеварение смесь до 4 раз вОбъем переваренной материала, чтобы обеспечить адекватное перемешивание и аэрацию.
      Примечание: В зависимости от эксперимента и продолжительности стимуляции гормона, добавление гормонов во время или после ферментативного расщепления этапе восстановления и микроструктуры.
  5. Добавить гормон (ы) в желаемой концентрации для тестирования образцов и транспортного средства с контролем. Для стимуляции 17-β-эстрадиола, и promegestone (R5020) используют в конечной концентрации 20 нМ.
    Примечание: R5020 представляет собой синтетический агонист рецептора прогестерона, который является более стабильным, чем природного прогестерона в среде.
    1. Место трубки на вальцовый смеситель внутри инкубаторе при 37 ° С и 40 оборотов в минуту O / N. Перед помещением образцов на смеситель, ресуспендируют их очень хорошо для того, чтобы все материалы, распределяет по центрифужные пробирки.
  6. Как пищеварение занимает по меньшей мере 12 ч (O / N), для стимуляции гормона раза меньше, чем 12 часа, добавить гормоны после восстановления микроструктур (де-хвост под шаге 3). Добавить гормоны, как вы ресуспендируйте микроструктуры и поместите суспензии на ультра-низких пластин крепления. Тканевые микроструктуры могут быть сохранены на ультра-низких пластин крепления на срок до 7 дней в ростовых факторов среды, свободной, сохраняющих около 70% жизнеспособность.
  7. Для РНК и анализа белков, сбора ткани микроструктуры центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин и флэш замораживание в центрифужные пробирки.

3. Восстановление тканей микроструктур

  1. Центрифуга трубки (ы) в 400 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте жир из верхней части трубки центрифуги и перенести супернатант оставшегося водного супернатанта, который обогащен в фибробластах, в новом центрифужную пробирку и центрифугируют при 1250 х г в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда ткани груди микроструктуры очень липким, для всех последующих шагов ресуспендируют осадок, осторожно перемешивая трубку. Пипетирование не рекомендуется из-за риска потерять материал. Ресуспендируют гранул, обогащенных микроструктур и в фибробластах, полученных из водного супернатанта в PBS, 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Впоследствии спина обе трубки на 1250 мкг в течение 5 мин, а затем отбросить супернатанты.
  2. Ресуспендируют гранул в 3 - 5 мл красного буфера для лизиса клеток крови и передавать их в чистые пробирки. Инкубируйте их в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Добавить 2x объем PBS, 2% FCS, и центрифугировать их в 1250 х г в течение 5 мин. Промыть гранул с PBS, 2% FCS и центрифуге при 1250 х г в течение 5 мин. Повторите этот шаг дважды.

4. Образцы для проточной цитометрии

  1. Добавить 1 - 2 мл трипсина 0,25% к осадку и смешать его с помощью пипетки вверх и вниз очень осторожно в течение 2 мин с 1000 мкл Pipetman диссоциировать клетки.
  2. Блокировка активности трипсина путем добавления 9 мл PBS, 2% FCS. Центрифуга при 450 мкг в течение 5 мин и вновь суспендируют таблетку в 10 мл PBS, 2% FCS.
  3. Передача клеточной суспензии на сито 40 мкм клетки, размещенной на топ из 50 мл центрифужную пробирку, чтобы подготовить отдельные клетки. Если несколько микролитров клеточной суспензии остаются на верхней части фильтра, помочь им пройти через фильтр с аспирацией их от другой стороны фильтра с пипеткой и добавить их к отфильтрованным микроструктур.
  4. Отдельные иммунные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки из микроструктур с коктейлем анти-CD45, анти-ФАП и анти-CD31 антитела, а затем сортировать их FACS, основанный на пан-эпителиальной маркер ЕрСАМ и CD10, чтобы отделить его стенке и базальные клетки соответственно 10 ,

5. Образцы для гистологии

  1. После промывки механически и ферментативно переваренный материал, как описано выше, устранить гранулы из 1,5 мл исходного материала в 1 мл 4% PFA в PBS при комнатной температуре в течение 30 мин.
  2. Центрифуга на 1250 мкг в течение 5 мин и промывают 1 - 2 мл PBS в два раза.
  3. Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин. В течение этого времени подготовки 1% многоцелевой агарозы в Трис-ацетат-ЭДТА (TAE) буфера и нагревают раствор в микроволновой печи до тех пор, пока раствор не доходит до кипения.
    1. Удалить раствор из микроволновой печи и вихрем колбу осторожно перемешать раствор и ресуспендируют оставшиеся частицы агарозы. Холодный раствор агарозы до 50 ° С и заливают 1 мл в парафин базовой формы, размером 31 × 23 × 13,5 мм.
  4. Жидкость над осадком сливают и помещают в гранул в верхней части затвердевшего слоя (1 - 3 мм) агарозы с использованием шпателя с плоским концом. Покройте их все с дополнительным слоем агарозы (40 ° C).
  5. После агарозном затвердевает, как правило, в течение 5 мин, положить агарозном блоки в гистологии кассеты для парафина замоноличивания. Наряду с образцами агарозные поместите белый офисную бумагу в кассету всей информации о количестве редукционная маммопластика, экспериментальных условиях, а также дату письменного маленькими буквами карандашом; это письмо выдерживает все последующие стадии обработки.
  6. Положите кассеты вPBS O / N, или в 70% -ном этаноле для хранения в течение выходных дней, при 4 ° С. Мы не заметили никакой разницы между двумя хранения данных. Затем перенесите гистологии кассеты для гистологии объектов для парафин.

6. морозильные микроструктуры (Future Культивирование)

  1. Ресуспендируют ткани микроструктуры в замораживании среду, состоящую из FCS с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и заморозить 1 мл аликвоты в криопробирки. Количество полученных криопробирки зависит от количества первичного материала, полученного из восстановительной маммопластики.
  2. Замораживание криопробирки, содержащие ткани микроструктуры с использованием контролируемой скорости морозильник со следующей программой: 5 мин жилого при 4 ° С, снижение температуры до -7 ° C со скоростью 6 ° С / мин, снижении температуры до -12 ° С с Скорость 6 ° С / мин, 10 мин жилища, снижение температуры до -40 ° С со скоростью 6 ° С / мин, уменьшение температуры до -80 ° С сСкорость 6 ° С / мин. Затем передайте эти криопробирки до -80 ° C морозильнике.
  3. На следующий день, передавать криопробирки от -80 ° С до бака с жидким азотом для длительного хранения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для изучения роли эстрогенов и прогестерона и лучше понять их молекулярная функции в человеческой груди, мы собираем свежие образцы ткани молочной железы человека от больных, перенесших mammoplasties сокращения (рис 1) после получения информированного согласия. Мы также получения медицинской и репродуктивного историю пациентов, а также образец крови для определения уровня сывороточного прогестерона на момент операции. Ткань из свежих mammoplasties сокращения механически и ферментативно диссоциированных. В результате ткани микроструктуры имеют протоки и дольки, характерные ткани молочной железы происхождения (рис 2а). Иммуногистохимический анализ агарозы и парафин ткани микроструктур, окрашенных в Миоэпителиальные маркера ΔNp63 (рис 2б) показывают, что микроструктура сохранить не только морфологические характеристики нормальной ткани молочной железы, но и молекулярный профиль челл популяции.

Для оценки реакцию гормона, ткани микроструктуры лечили либо с синтетический прогестерон агонистом рецептора promegestone (R5020) или контроля этанола. Для обогащения для рецептора гормона положительные просвета клетки проточной цитометрии был выполнен на основе эпителиальных (EpCAM) и Миоэпителиальные маркера (CALLA, рисунок 3а) после истощения для эндотелиальной фибробластов и клеток иммунной системы с коктейлем анти CD31, анти-FAP и анти- CD45 антитела. Qrt-ПЦР анализ EpCAM +, CD10- клетки появился регулирование гена-мишени прогестерона Wnt-4 (3В) в просвета клеток, обогащенной населения от R5020 воздействию тканей микроструктуры.

Рисунок 1
Рисунок 1. Образец ткани молочной железы. Фотография недавно расчлененный редукционная маммопластика образца. Стрелки указываютбелых нитей ткани, которые содержат паренхимы, т.е. молочных протоков и терминальных протоков долек единиц. Встроенный в изобилии желтый жировой ткани. В то время как цвет жира делает, это согласуется между пациентами, доля жировой ткани, как правило большая часть ткани молочной железы с точки зрения объема, изменяется. Масштабная линейка:. 5 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Тканевые микроструктуры. () Светлый поле изображения микроструктур культивировали на низком настенного крепления в течение 48 часов после механической диссоциации и ферментативного пищеварения. Шкала бар: 40 мкм (Б) Микрофотография гистологического среза ткани на микроструктур, встроенного в агарозе и парафина после 3 дней в.культура. Раздел был подвергнут иммуногистохимического окрашивания для Миоэпителиальные маркера ΔNp63 и гематоксилином. Наконечники указывают на внутренних, просвета клеток, стрелки указывают на ΔNp63 положительных миоэпителиальных клеток. Масштабная линейка:. 40 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Проточная цитометрия сортировки разделение и РНК анализ тканей микроструктур. (А) Разделение различных клеточных популяций из ткани микроструктуры, обработанных R5020 или этанол с помощью проточной цитометрии. Тканевые микроструктуры диссоциируют и immunodepleted для иммунных клеток, фибробласты, и эндотелиальных клеток с коктейлем анти-CD45, анти-FAP, и анти-CD31 антител. Клетки были помечены antiboумирает против эпителиальных клеток молекул адгезии (EpCAM) (клон HEA-125) для обогащения для просвета клеточной популяции (зеленый) и общий острый лимфобластный лейкоз антиген (CD10 / CALLA) для миоэпителиальных клеток (клон SS2 / 36). Представитель разброс блот показан. (В) Гистограмма показывает относительные Wnt-4 уровни экспрессии мРНК в субпопуляции просвета от ткани микроструктур (зеленый облако точек, панель А), индуцированных этанолом или R5050 в течение 24 ч. Относительные уровни экспрессии мРНК гена-мишени прогестерона, Wnt-4 нормализованы в отношении уровней мРНК гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT). Данные, приведенные представляют собой среднее ± SD из трех повторах. Выделение РНК и Qrt-ПЦР проводили, как описано ранее 14. Последовательности праймеров: Wnt-4: вперед 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' и обратного 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', ГФРТ: вперед 5 <EM> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' и обратного 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3 ». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Культура экс естественных описано здесь, представляет собой ткани микроструктуры груди, содержащие интактные каналы и дольки, наряду с другими типами клеток, обычно находящиеся в человеческом женской груди. При обработке ткани молочной железы человека, как правило, полученного из mammoplasties сокращения, удаление жировой ткани, механические и ферментативным расщеплением стромальной матрицы и лизиса эритроцитов обогащает для молочных протоков фрагментов и концевых протоков долек единиц. Нежный ферментативное расщепление в правильной концентрации, для правой продолжительности имеет важное значение для обеспечения того, чтобы ткани микроструктуры остаются нетронутыми, сохранить несколько типов клеток и в значительной степени сохранить свои внеклеточного матрикса. Кроме того, внимание должно быть уделено обработке ткани быстро после удаления из пациента. Образцы пациентов существенно различаются, и механические и ферментативное расщепление возможно, должны быть продлен, и / или дополнительные фермента должна быть добавлена, когда ткань является особенно высоким содержанием коллагена.

Хотя микроструктуры остаются 90% всхожесть до 6 дней, модель имеет ограничения для долгосрочных гормонов стимуляции. Поскольку различные типы клеток имеют разные периоды полураспада, клеточный состав, скорее всего, меняться с течением времени. В то время как ткани микроструктуры сохранить проникновения иммунных клеток, они не пополняются по мере ткань удаляется из обращения тела. Кроме того, твердый трубопровода с клиническими партнеров, которые предоставляют хирургических образцов, как требуется большое количество образцов должны быть проанализированы из том вариации пациента. Тканевые микроструктуры могут быть заморожены для дальнейшего использования. Тем не менее, в какой степени замораживания и оттаивания влияет на жизнеспособность клеток, возможно, по-разному для разных типов клеток, и, как это может привести к изменению реакции гормона, не были охарактеризованы. Планирование экспериментов может быть трудно, как для любого маммопластики количество ткани микроструктур, которые будут получены трудно предвидеть.

экс естественных условиях модель представляет первую модель для изучения физиологического действия гормона в человеческой груди. В то время как сложные 3D системы культуры для первичных молочной эпителиальных клеток были разработаны, это экс естественных условиях система сохраняет архитектуру ткани и ее сотовый сложности в течение нескольких дней. В результате, не только в ответ на гормон рецепторов положительных клеток-мишеней могут быть проанализированы, но события вниз по течению паракринного сигналов в других типах клеток стать поддается изучению. Микроструктура хранятся в фактор роста свободной среды в течение всего срока эксперимента. Следовательно, нет озадачив внешней активации сигнальных каскадов. Как таковые, ткани груди микроструктуры дают возможность решать вопросы в настройке, что более точно отражает биологические сложности человеческой груди.

Экс естественных условиях система может быть использована для оценки реакции БРс востока на природных и синтетических гормонов. Это очень важно в свете возрастающей заболеваемости раком молочной железы. Кроме того, лекарственные средства, малые молекулы, пептиды, факторы роста и цитокины могут быть применены и их воздействие на пролиферацию клеток, апоптоз и сигнализации быть изучены.

Настоящее подробное описание предназначено для облегчения использования этого метода другими исследователями и помочь свести к минимуму среди лабораторных изменений. Как этот подход опирается на образцах пациентов, это крайне важно, чтобы стандартизированный метод используется так, что результаты могут начать сравнивать между различными лабораториями 15 и лучшее понимание среди изменчивости пациента становится возможным. Авторы высоко ценим обратную связь и будем рады интегрировать усовершенствования в пересмотренные версии этого протокола. Работа с образцами человека является очень сложным и авторы надеются стимулировать более трансляционных исследований с интересными биологических образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят М. FICHE Университетского госпиталя Лозанны для обеспечения маммопластика фотографию, М. Вирт и А. Ayyanan из Швейцарского института экспериментальных исследований рака, Национальный центр компетенции в области исследований молекулярной онкологии, школа естественных наук, Высшей Федеральной политехнической де Лозанна для оказания технической помощи и Р. Кларк Университета Манчестера за критические замечания. Научных исследований, ведущих к этим результатам получил поддержку от SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531817, и инновационных лекарственных средств инициатива совместного проекта под грантового соглашения нет. 115188, ресурсы которой состоят из финансового вклада Седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP7 / 2007-2013) и Европейской федерации фармацевтической промышленности и ассоциаций компаний в своем роде вклад. Веб-адрес Инициативу по инновационным лекарственным это http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).

Tags

Медицина выпуск 95 гормональная сигнализация рак молочной железы снижение маммопластика ткани груди микроструктуры, эстроген прогестерон эпителиальных клеток молочной железы ткань пищеварение паракринная сигнализация микросреда архитектура ткани

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель для изучения действия гормонов в груди человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter