Introduction
В течение долгого времени производство индиго был экономически очень важный процесс. Перед крупномасштабных химических синтезов дал дешевый доступ к индиго, предшественники были получены из природных источников с дохристианских времен. Выращивание индиго обеспечения растений (естественно индиго) в Европе стал неблагодарным в 17-м веке, как количество индиго предшественники индийской индиго (0,2-0,8%) составляет около 30 раз выше. В конце 19-го века химического синтеза индиго подавил обычный выращивание 1,2.
Indigo предшественники, происходящие в растениях включают индикана (1), Insatan A (2) и Isatan B (3) (рис 1). Все они состоят из индоксил мотива, связанного с гликозильного остатка. Расщепление гликозидной связи, например, с помощью ферментативного гидролиза, приводит к выделению индоксил (4). Сама индоксил практически бесцветны, но могут быть быстро окисляется с образованием индиго Краситель (5). Это чувствительная реакция была адаптирована в биохимии, бактериологии, гистохимии и молекулярной биологии для мониторинга активности ферментов. Скрининг активности в естественных условиях без выделения или очистки ферментов, а также экспресс-тесты на чашках с агаром или в растворе (например, бело-голубым скрининга, микро-скважин) возможно. В зависимости от остатка (например, сложные эфиры, гликозиды, сульфаты), связанного с индоксил фрагмента, пригодными субстратами в различных классов ферментов (например, эстераз, глюкозидазы, сульфатазы) были разработаны 3. В следующем внимание будет уделено формированию и применению индоксил гликозидов.
Рисунок 1: Природные предшественники индиго и формирование красителя индиго путем гидролиза.цель = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Замещение картина индоксил фрагмента определяет цвет и физические свойства полученного красителя индиго. Наиболее распространенные шаблоны замещения 5-бром-4-хлор (сокращенно от X; зеленовато-голубой), 5-бром (синий) и 5-бром-6-хлор (пурпурный), так как они образуют мельчайшие частицы красителя, делают не образуют гранулы и имеют наименьший диффузию из участков гидролиза. Последнее свойство особенно важно для естественных условиях экспериментов в 3.
Первый доклад о indigogenic метода для обнаружения эстеразы был опубликован в 1951 году и Barrnett Селигман, который занятого индоксил ацетат и бутират 4. О десятилетие спустя indigogenic принцип был адаптирован для локализации глюкозидазы млекопитающих 5. До сих пор несколько индоксил гликозидов были разработаны, хотя их синтез оказался трудно. Большинство синтезов на основе использования в -acetylated индоксил N в качестве акцептора и соответствующих гликозилгалогенидом донора 6-14. Гликозилирование проводят в ацетоне с помощью гидроксида натрия. В этих условиях количество побочных реакций происходит, значительно уменьшая выход. Специально для глюкозы структур типа очень низкие выходы гликозилирования сообщалось (например, 15% (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,4,6-тетра-О-ацетил -β-ᴅ-глюкопиранозид 6 и 26% (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,2 ', 3', 4'-пента вывода -acetyl- β-ᴅ-xylobioside 14 в более недавний пример). Через новый подход, используя сложные эфиры indoxylic кислоты, значительное количество индоксил гликозидов были получены с хорошим выходом (например, (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,4, 6-тетра-О-ацетил-β-ᴅ-глюкопиранозид выход 57%).
_content "> Следующий протокол описывает простой синтез indoxylic кислоты аллилового эфира (5-бром-4-хлор) и на их основе синтеза с индоксил гликозида (X-Gal). Простой модельный эксперимент показывает ферментную реактивность β- галактозидазы с использованием X-Gal.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Grüssing | 10298 | Corrosive, flammable |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 608-001-00-3 | Harmful, flammable |
| Allyl alcohol | Aldrich | 453021 | Harmful, dangerous for the environment |
| Amberlite IR-120 H+ | Fluka | 06428 | Irritant |
| Bromoacetic acid | Merck | 802260 | Corrosive, toxic, dangerous for the environment |
| 4-Bromo-3-chloro-2-methylaniline | ABCR | AB 171687 | Irritant |
| Dichloromethane | ACROS | 326850010 | Harmful |
| Diethyl ether | Grüssing | 10274 | Harmful, extremly flammable |
| Dimethylformamide | ACROS | 348430010 | Harmful, flammable |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | 41648 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 607-022-00-5 | Irritant, flammable |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | AppliChem | A1103.0500 | Irritant |
| β1,3-Galactosidase, recombinant, E. coli | Calbiochem | 345795 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 20252.290 | Corrosive |
| Magnesium sulfate hydrate | Merck | 105885 | |
| Methanol | ACROS | 326950010 | Toxic, flammable |
| Morpholine | Janssen Chimica | 15.868.57 | Corrosive, flammable |
| Peroleum ether | Azelis | 111053 | Flammable, irritant, dangerous for the environment |
| Potassium carbonate | Grüssing | 12005 | Corrosive |
| Potassium permanganate | Grüssing | 12056 | Harmful, oxidising |
| Potassium tert-butoxide | Merck | 804918 | Corrosive, flammable |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 613-002-00-7 | Harmful, flammable |
| Silver acetate | Fluka | 85140 | Irritant, dangerous for the environment |
| Sodium bicarbonate | Grüssing | 12144 | Corrosive |
| Sodium hydride | Merck | 814552 | Corrosive, flammable |
| Sodium hydroxide | Riedel-de Häen | S181200 | Corrosive |
| Sodium methanolate | Merck | 806538 | Corrosive, flammable |
| Sodium sulfate | Grüssing | 12175 | |
| Tetrabutylammonium hydrogensulfate | Lancaster | 5438 | Harmful |
| Tetrahydrofurane | Sigma-Aldrich | 87371 | Harmful, flammable |
| Tetrakis (triphenylphosphine)palladium(0) | Sigma-Aldrich | 216666 | |
| Triphosgene | Fluka | 15217 | Toxic |
| Tris (hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride | Sigma | T-3253 | Irritant |
References
- Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present. Endeavour. 17, 191-199 (1993).
- Hunger, K. Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).
- Kiernan, J. A. Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes. Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).
- Barnett, R. J., Seligman, A. M. Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo. Science. 114, 579-582 (1951).
- Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside. Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).
- Anderson, F. B., Leaback, D. H. Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases. Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).
- Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand. Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).
- Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase. Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).
- Horwitz, J. P., et al. Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
- Eschenfelder, V., Brossmer, R. 5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity. Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).
- Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems. Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).
- Berlin, W., Sauer, B. In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a "No-Background" Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside. Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).
- Marmuse, L., et al. New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases. Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).
- Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).
- Robertson, A. J. Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican. Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).
- Robertson, A., Waters, R. B. J. Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican. Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).
- Böttcher, S., Thiem, J. Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides. Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).
- Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities. Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).
- Böttcher, S., Thiem, J. Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine. RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).
