Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
डिम्बग्रंथि कैंसर रुग्णता और मृत्यु दर इस रोग की अत्यधिक आवर्तक, chemoresistant सुविधाओं होने का प्रमुख कारण के साथ संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे घातक स्त्रीरोगों द्रोह है। कुछ मामलों 1 में फायदेमंद हो सकता है neoadjuvant चिकित्सा का सुझाव करने के लिए कुछ सबूत है, हालांकि वहां प्राथमिक उपचार आमतौर पर अधिक से अधिक cytoreductive सर्जरी और बाद में प्लैटिनम आधारित थेरेपी शामिल हैं। रोगियों के बहुमत प्राथमिक उपचार के लिए अनुकूल प्रतिक्रिया है, लेकिन दुर्भाग्य से आधे 18 महीने 2 के भीतर पलटा जाएगा।
अधिकांश डिम्बग्रंथि कैंसर उपकला कार्सिनोमा हैं और अंडाशय या फैलोपियन ट्यूब 3,4 की सतह epithelia में ही शुरू हो सकता है। कई अध्ययनों से संभवतः ovulation के 5,6 निम्नलिखित की जरूरत है कि ऊतकों की मरम्मत में सहायता कि महिला प्रजनन प्रणाली में दैहिक स्टेम कोशिकाओं के अस्तित्व का समर्थन है। ovul दौरान अंडाशय और फैलोपियन ट्यूब दोनों पर उच्च proliferative गतिविधिसमझना (। Gharwan, एट अल प्रस्तुत पांडुलिपि) डिम्बग्रंथि के कैंसर के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है। ट्यूमर के गठन की कोशिकाओं की व्युत्पत्ति स्पष्ट नहीं है, लेकिन वे विभाजन या भाग्य को विनियमित करने में असमर्थ हैं उन्हें प्रस्तुत करना है कि म्यूटेशन के माध्यम से सामान्य स्टेम सेल, पूर्वज कोशिकाओं, या विभेदित कोशिकाओं से उत्पन्न हो सकती है। इन कोशिकाओं को भी ", कैंसर की शुरुआत कोशिकाओं" "कैंसर स्टेम कोशिकाओं," या करार दिया गया है और कम लगाव शर्तों के तहत tumorigenic, बहुकोशिकीय spheroids के रूप में विकसित कर सकते हैं। घरेलू विकास की पदानुक्रमित मॉडल गतिशील हो सकता है, tics कीमोथेरेपी, लंबी अवधि के आत्म नवीकरण और विभिन्न सेल प्रजातियों 7,8 में अंतर करने की क्षमता के लिए निष्क्रियता है, प्रतिरोध सहित सामान्य स्टेम कोशिकाओं के रूप में एक ही सुविधाओं के कई साझा करते हैं।
कई अध्ययनों से डिम्बग्रंथि के कैंसर में tics के अस्तित्व का समर्थन और वर्तमान प्रयासों इन कोशिकाओं tumorigenesis 9-11 का समर्थन व्यवस्था है जिसके द्वारा (ओं) को स्पष्ट करने के लिए चल रहे हैं। प्रत्येक मार्कर की सटीक योगदान स्पष्ट नहीं है और 11-16 विशेष सेल प्रकार का हो सकता है, हालांकि कई मार्करों, CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, और MyD88 सहित बढ़ाया tumorigenicity साथ डिम्बग्रंथि tics की पहचान करने के लिए प्रस्तावित किया गया है। एक सार्वभौमिक मार्कर या मार्कर का सेट स्पष्ट डिम्बग्रंथि tics के लिए स्थापित नहीं किया गया है, वहीं विभिन्न समूहों उच्च एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (ALDH) गतिविधि 13,17-21 साथ CD44 + के लिए CD133 + और / या कोशिकाओं का चयन करके और अधिक सामान्यतः डिम्बग्रंथि tics अलग है। CD44 Hyaluronic एसिड के लिए एक रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है और आसंजन, प्रसार, प्रवास, angiogenesis और भेदभाव 22 सहित ट्यूमर प्रगति के लिए महत्वपूर्ण कई प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है कि एक transmembrane ग्लाइकोप्रोटीन है। CD133 समारोह जिसका अभी स्पष्ट नहीं है लेकिन अध्ययन से यह प्लाज्मा झिल्ली टोपोलॉजी 23 का आयोजन का सुझाव एक transmembrane ग्लाइकोप्रोटीन है। ALDH, एल्डीहाइड के ऑक्सीकरण catalyzes कि एक intracellular एंजाइम, सबसे विश्वविद्यालय में हो सकता हैउच्च गतिविधि के रूप में tics के अल मार्कर सामान्य स्टेम कोशिकाओं और tics 24 के समर्थन में ALDH करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है ऊतकों और कई भूमिकाओं की एक किस्म से पृथक स्टेम कोशिकाओं को पहचान लिया गया है। अब के रूप में, CD133 और ALDH1 डिम्बग्रंथि tics 13,21 के सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मार्करों होना दिखाई देते हैं।
Tics की विशेषताओं को समझने के लिए इसके अलावा, विशेष रूप से इस उप-जनसंख्या लक्ष्य है कि दवाओं की पहचान के लिए एक बड़े प्रयास भी है। डिम्बग्रंथि के कैंसर के साथ जुड़े उच्च पलटा दर सफलतापूर्वक tics उन्मूलन के लिए वर्तमान chemotherapies की विफलता की वजह से हो सकता है। ट्यूमर के थोक मौजूदा उपचार के लिए अतिसंवेदनशील है, tics प्रतिरोधी और मानक विधियों द्वारा undetectable एक घनत्व में माना जाता है। चिकित्सा प्रतिरोध और ट्यूमर पतन की elucidating तंत्र की प्रतिक्रिया और डिम्बग्रंथि के कैंसर के रोगियों की कुल जीवित रहने की दरों में सुधार के लिए महत्वपूर्ण हैं।
इधर, संस्कृति तकनीक वें वर्णित हैंपर स्थापित किया है और प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों से tics के लिए समृद्ध। इस के साथ साथ वर्णित संस्कृति शर्तों स्टेम सेल गुणों 11,12,14,16,20 साथ tics या अंडाकार आकृति कोशिकाओं के प्रसार को प्रेरित करने के लिए कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है। सामान्यतः tics समृद्ध बनाने के लिए इस्तेमाल किया कई स्टेम सेल संस्कृति medias और पूरक हालांकि वहाँ / spheroids हम EGF और FGF के साथ एक सीरम मुक्त मीडिया फार्मूला इस्तेमाल किया, लेकिन B27 या एन-2 की खुराक के अलावा बिना। सामान्यतः neuronal सेल संस्कृति और स्टेम कोशिकाओं के लिए समृद्ध बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है इन पूरक, एक mesenchymal फेनोटाइप 25,26 बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है और एक mesenchymal या उपकला फेनोटाइप होने tics अधिक tumorigenic रहे हैं कि क्या करने के रूप में मैदान में कुछ अनिश्चितता बनी हुई है किया गया है 27-29 । अनिश्चितताओं और चर को कम से कम करने के लिए हम हम उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, के बाद से सबसे आम सूत्र का उपयोग करने का विकल्प चुना।
एक कम लगाव फ्लास्क में सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखनेअंडाकार आकृति के गठन की सुविधा और CD133 अभिव्यक्ति और उच्च ALDH गतिविधि के साथ कोशिकाओं के प्रसार का समर्थन करता है। हमारा काम आगे सामान्य पक्षपाती शर्तों के तहत अस्थायी कोशिकाओं को भी एक और अधिक tumorigenic टिक आबादी का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं दिखाया गया है। Athymic नग्न चूहों में इन परिस्थितियों में विकसित कोशिकाओं के इंजेक्शन सीरम की उपस्थिति में जुड़ी शर्तों में विकसित कोशिकाओं की तुलना में अधिक है tumorigenic संभावित की ओर जाता है। डिम्बग्रंथि के कैंसर दीक्षा, प्रगति, चिकित्सकीय प्रतिक्रिया है, और रोग पतन में tics की भूमिका के बारे में ज्यादा जानकारी के लिए इन तकनीकों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों से स्टेम सेल सुविधाओं के साथ कोशिकाओं के लिए संस्कृतियों समृद्ध बनाने के लिए एक कुशल और सुसंगत विधि प्रस्तुत करता है और प्राथमिक रोगी के नमूने के लिए लागू है। इस पद्धति को सफलतापूर्वक सेल लाइनों की एक किस्म में tics के लिए समृद्ध करती है। यह शारीरिक रूप से जनसंख्या भीतर गैर tics से tics सॉर्ट करने के लिए समय लेने के बिना, एक घरेलू और / या tumorigenic phenotype के लिए समृद्ध है कि शर्तों के समय पर पहचान के लिए अनुमति देता है। इस तरीके में, अलग-अलग संकेत दे रास्ते के सापेक्ष स्तरों कार्यात्मक assays के एक किस्म का उपयोग संस्कृतियों टिक करने के लिए परंपरागत पक्षपाती संस्कृतियों की तुलना द्वारा घरेलू phenotype के लिए उनके योगदान के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। एक शुद्ध घरेलू आबादी वांछित है, अलगाव आसानी प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry में एक प्रतिदीप्ति की सहायता या चुंबकीय छँटाई कदम शामिल करके प्राप्त किया जा सकता है।
यह, हालांकि, यह ध्यान रखें कि करने के लिए महत्वपूर्ण है घरेलू मार्कर की अभिव्यक्तिऐसे CD133, CD44, या ALDH के रूप में, सेल लाइनों या यहां तक कि एक ही ट्यूमर के प्रकार के रोगी के नमूने के बीच भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए हम उलटा ACI-23 के लिए सच है, जबकि OVCAR-5 कोशिकाओं, CD133 के लिए CD44 रिश्तेदार के उच्च अभिव्यक्ति है कि पाया। यह चूहों में ट्यूमर दीक्षा पर भरोसा करते हैं और घरेलू उपस्थिति की निश्चित रूप प्रवाह cytometry विश्लेषण करने के लिए इसलिए प्रासंगिक है। डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को स्टेम सेल की स्थिति में बड़े हो रहे थे जब इस प्रोटोकॉल के बाद, उच्च ALDH गतिविधि लगातार मनाया गया। ALDH फ्लोटर घरेलू परिस्थितियों में सबसे अधिक है, जबकि दिलचस्प है, CD133 अभिव्यक्ति, पारंपरिक घरेलू संस्कृति की स्थिति में उगाई ACI-23 कोशिकाओं में लगातार अधिक है। इसके विपरीत TGS-तीन प्राथमिक जलोदर कोशिकाओं फ्लोटर टिक शर्तों के तहत CD133 सकारात्मकता में एक छोटे से वृद्धि हुई है, लेकिन पारंपरिक टिक शर्तों के तहत ALDH गतिविधि में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित करते हैं। इन निष्कर्षों डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की विविधता और आमतौर पर tics के साथ जुड़े plasticity के पर प्रकाश डाला। आगे सीएलए का समर्थन करने के लिएइन तरीकों tics बढ़ाने कि आईएम, टीआरए-1-60 सकारात्मक कोशिकाओं के संवर्धन भी मनाया गया। टीआरए-1-60 एक pluripotency मार्कर है और प्रोस्टेट कैंसर tics 30-32 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भ्रूणीय अंडाशय की कार्सिनोमा और वृषण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हमारे तरीके में कई सेल लाइनों के साथ सफल रहे हैं, यद्यपि यह संशोधित फ्लोटर स्थिति बेहतर अन्य डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल आबादी में tics के लिए समृद्ध है, जबकि मानक घरेलू परिस्थितियों, कुछ डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को बेहतर करने के लिए उपयुक्त हो सकता है कि संभव है। यह फिर से दोनों रोगी ली गई है और स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों के भीतर होने की उम्मीद है विविधता को रेखांकित करता है।
इन मार्करों डिम्बग्रंथि के कैंसर tics के लिए विशिष्ट नहीं कर रहे हैं और नहीं बल्कि भ्रूण स्टेम सेल pluripotency के लिए महत्वपूर्ण कारकों का प्रतिनिधित्व करते हैं, हालांकि कोशिका की सतह मार्करों के अलावा Nanog, Sox2, अक्टूबर-4 11 सहित डिम्बग्रंथि के कैंसर tics चिह्नित करने के लिए दिखाया गया है कि कई ट्रांसक्रिप्शनल कारकों, वहाँ रहे हैं और अलगferentiation 33,34। हम इन कारकों में से प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन की जांच की और Nanog स्तरों दूसरों 13,35 के साथ ही CD133, टीआरए-1-60, और CD117 के साथ समझौते में, घरेलू संस्कृति की स्थिति में है कि वृद्धि पाया। एक मानव स्टेम सेल मार्कर सीडीएनए सरणी आगे पारंपरिक पक्षपाती शर्तों की तुलना में घरेलू परिस्थितियों में CD133, Nanog, Melk, और PODXL जीन में वृद्धि देखी गई। महत्वपूर्ण बात है, यह कोशिका की सतह मार्कर के साथ के रूप में, डिम्बग्रंथि tics के साथ जुड़े ट्रांसक्रिप्शनल कारकों सेल लाइनों और रोगी के नमूने के बीच भिन्न हो सकते हैं, कि ध्यान दिया जाना चाहिए।
हम वे इन विट्रो में स्वाभाविक गैर पक्षपाती हैं यदि कोशिकाओं को और अधिक tumorigenic हो सकता है और स्टेम सेल मार्कर के उच्च स्तर व्यक्त कर सकते हैं कि मनाया है (यानी, आसानी से एक पक्षपाती थाली करने के लिए संलग्न नहीं है कि कोशिकाओं फ्लोटिंग)। संस्कृति में, इस तरह के ACI-23 के रूप में सेल लाइनों आमतौर पर पारंपरिक संस्कृति Condit के तहत एक स्टैकिंग फैशन में खड़ी हो जाना है कि कई व्यवहार्य अस्थायी कोशिकाओं और / या कोशिकाओं हैआयनों। अस्थायी कोशिकाओं और समुच्चय से tics के सफल संवर्धन वर्तमान अध्ययन और OVCAR-3 12 में उन सहित अपेक्षाकृत कुछ करने के लिए लागू सेल लाइनों हो सकता है, हमारे निष्कर्ष यह एक अधिक tumorigenic आबादी का प्रतिनिधित्व हो सकता सुझाव देते हैं। इसलिए, वाणिज्यिक स्टेम सेल मीडिया के लिए खराब अनुकूलन है कि कोशिकाओं के लिए, घरेलू संवर्धन का एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में सेवा कर सकता है मानक टिशू कल्चर प्लेट और मीडिया में विकसित कोशिकाओं की "अस्थायी" जनसंख्या कटाई।
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत अलग संस्कृति तरीकों का उपयोग घरेलू आबादी के त्वरित संवर्धन और विभिन्न कोशिकाओं में इस phenotype का समर्थन कारकों की एक बेहतर समझ के लिए सक्षम हो जाएगा। इस विधि के प्रचलित अनुप्रयोग संकेत दे रास्ते कोशिकाओं की इस अनूठी आबादी के प्रचार-प्रसार का समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं जो निस्र्पक शामिल हैं। इन अध्ययनों के परिणाम से ट्यूमर प्रगति और पतन के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी।
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |