Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
سرطان المبيض هو الورم الخبيث الأكثر فتكا أمراض النساء في الولايات المتحدة مع سببا رئيسيا من أسباب المراضة والوفيات يجري في المتكررة للغاية، وميزات chemoresistant من هذا المرض. المعالجة الأولية تتكون عادة عملية جراحية cytoreductive القصوى واللاحق البلاتين العلاج القائم، على الرغم من أن هناك بعض الأدلة التي تشير إلى العلاج المواد الجديدة المساعدة قد تكون مفيدة في بعض الحالات 1. الغالبية العظمى من المرضى تستجيب بشكل إيجابي للعلاج الأولية، ولكن للأسف نصف والانتكاس خلال 18 شهرا 2.
معظم الأورام الخبيثة سرطان المبيض هي الظهارية ويمكن أن تنشأ في ظهائر سطح المبيض أو قناة فالوب 3،4. العديد من الدراسات تدعم وجود الخلايا الجذعية الجسدية في الجهاز التناسلي للأنثى التي تساعد يفترض في إصلاح الأنسجة أن هناك حاجة التالية الإباضة 5،6. النشاط التكاثري عالية في كل من المبيض وقناة فالوب خلال ovulأوجه قد يكون عاملا مهما في تطور سرطان المبيض (Gharwan، وآخرون. مخطوطة قدم). اشتقاق الخلايا المكونة للورم غير واضح ولكنها قد تنشأ من الخلايا الطبيعية الجذعية، الخلايا الاصلية، أو خلايا متباينة من خلال الطفرات التي تجعلها غير قادرة على تنظيم الانقسام أو مصير. كما تم وصف هذه الخلايا "الخلايا الجذعية السرطانية"، أو "الخلايا بدء السرطان"، ويمكن أن تنمو لتصبح مكون للأورام، الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا تحت ظروف الحجز منخفضة. على الرغم من أن نموذج هرمي للتنمية TIC قد تكون دينامية، لا الحيازات تبادل العديد من نفس خصائص الخلايا الجذعية العادية بما في ذلك السكون، ومقاومة للعلاج الكيميائي، على المدى الطويل التجديد الذاتي والقدرة على التمايز إلى مختلف الأنساب الخلية 7،8.
العديد من الدراسات تدعم وجود التشنجات اللاإرادية في سرطان المبيض وهي الجهود الحالية جارية لتوضيح آلية (ق) من هذه الخلايا التي تدعم تكون الأورام 9-11. وقد اقترحت عدة علامات لتحديد الحيازات المبيض مع تعزيز tumorigenicity بما في ذلك CD133، ALDH1A1، CD117، CD44، وMyD88، على الرغم من أن مساهمة الدقيقة لكل علامة غير واضحة وربما تكون نوع من الخلايا محددة 11-16. في حين أن علامة عالمية أو مجموعة من علامات لم يثبت بشكل لا لبس فيه لالحيازات المبيض، ومجموعات مختلفة عزلت الحيازات المبيض أكثر شيوعا عن طريق اختيار لCD44 +، CD133 + و / أو الخلايا مع ارتفاع ألدهيد نازعة (ALDH) النشاط 13،17-21. CD44 هو بروتين سكري عبر الغشاء الذي يعمل بمثابة مستقبلات للحمض الهيالورونيك وينظم العديد من العمليات الهامة لتطور الورم، بما في ذلك التصاق، والانتشار والهجرة والأوعية الدموية والتمايز 22. CD133 هو بروتين سكري عبر الغشاء الذي تتمثل مهمته لا يزال غير واضح ولكن تشير الدراسات إلى أنه ينظم غشاء البلازما طوبولوجيا 23. ALDH، وهو الانزيم الذي يحفز الخلايا أكسدة الألدهيدات، قد يكون معظم الكونتم التعرف آل علامة التشنجات اللاإرادية كنشاط عالية في الخلايا الجذعية المعزولة من مجموعة متنوعة من الأنسجة والأدوار المتعددة وقد نسبت إلى ALDH في دعم الخلايا الجذعية العادية والحيازات 24. اعتبارا من الآن، تظهر CD133 وALDH1 أن تكون علامات الأكثر استنساخه التشنجات اللاإرادية المبيض 13،21.
بالإضافة إلى فهم خصائص التشنجات اللاإرادية، وهناك أيضا جهد كبير لتحديد الأدوية التي تستهدف على وجه التحديد هذا حيوانية. قد يكون راجعا إلى فشل الكيميائي الحالية للقضاء على الحيازات بنجاح معدل الانتكاس عالية المرتبطة بسرطان المبيض. على الرغم من أن الجزء الأكبر من الورم هو عرضة للعلاجات الحالية، ويعتقد أن الحيازة مشتركة لتكون مقاومة وبكثافة لا يمكن الكشف عنها بالطرق العادية. آليات توضيح للمقاومة العلاج وورم انتكاس حيوية لتحسين الاستجابة ومعدلات البقاء على قيد الحياة العامة للمرضى الذين يعانون من سرطان المبيض.
هنا، يتم وصف تقنيات زراعة عشرفي إثراء لالحيازات من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض أنشئت والابتدائية. وقد استخدمت الظروف الثقافة الموصوفة هنا من قبل عدة مجموعات للحث على نشر التشنجات اللاإرادية أو خلايا كروي مع صفات الخلايا الجذعية 11،12،14،16،20. على الرغم من أن هناك العديد من الوسائط زراعة الخلايا الجذعية والمكملات الغذائية التي تستخدم عادة لتخصيب الحيازات / الكروية استخدمنا صيغة خالية من المصل وسائل الاعلام مع EGF وجمعية جيل المستقبل، ولكن بدون إضافة B27 أو N-2 ملاحق. هذه الملاحق، وتستخدم عادة لزراعة الخلايا العصبية وإثراء للخلايا الجذعية، وقد ثبت لتعزيز النمط الظاهري الوسيطة 25،26 وهناك لا يزال بعض الشكوك في مجال ما إذا كان الحيازات وجود الوسيطة أو النمط الظاهري الظهارية هي أكثر مكون للأورام 27-29 . للحد من عدم اليقين والمتغيرات اخترنا أن استخدام الصيغة الأكثر شيوعا، حيث أننا نتعامل مع خلايا سرطان المبيض الظهاري.
الحفاظ على الخلايا في مصل الدم خالية من وسائل الاعلام في مرفق قارورة منخفضةيسهل تشكيل كروي وتدعم نشر الخلايا مع التعبير CD133 والنشاط ALDH عالية. وقد أظهر عملنا كذلك أن خلايا العائمة في ظل ظروف ملتصقة العادية يمكن أيضا أن يمثل السكان TIC أكثر مكون للأورام. حقن الخلايا المزروعة في هذه الظروف في الفئران عارية athymic يؤدي إلى إمكانية مكون للأورام أعلى بالمقارنة مع الخلايا المزروعة في ظروف المرفقة في وجود المصل. الكثير من المعلومات فيما يتعلق بدور التشنجات اللاإرادية في بدء المبيض السرطان، والتقدم، والاستجابة العلاجية، وانتكاس المرض ويمكن الحصول من خلال استخدام هذه التقنيات.
بروتوكول الموصوفة هنا يقدم وسيلة فعالة ومتسقة لإثراء الثقافات للخلايا مع ميزات الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض ثابتة وقابلة للتطبيق على عينات المريض الأولية. هذه الطريقة يثري بنجاح لالحيازات المشتركة عبر مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا. انها تسمح لتحديد الوقت المناسب لظروف التي تثري لTIC و / أو النمط الظاهري مكون للأورام، من دون أخذ الوقت لفرز جسديا التشنجات اللاإرادية من غير الحيازات ضمن السكان. في هذه الطريقة، المستويات النسبية للمسارات إشارات مختلفة يمكن تقييم لمساهمتهم في النمط الظاهري TIC بمقارنة الثقافات تمسكا التقليدية إلى TIC الثقافات باستخدام مجموعة متنوعة من المقايسات الفنية. إذا كان المطلوب من السكان TIC النقي، والعزلة يمكن أن يتحقق بسهولة من خلال دمج خطوة بمساعدة مضان أو مغناطيسية الفرز في التدفق الخلوي البروتوكول.
من المهم أن نأخذ في الاعتبار، مع ذلك، أن التعبير عن علامة TICالصورة، مثل CD133، CD44، أو ALDH، قد تختلف بين خطوط الخلايا أو عينات من المرضى حتى من نفس النوع الورم. على سبيل المثال وجدنا أن OVCAR-5 الخلايا لديها أعلى من التعبير CD44 نسبة إلى CD133، في حين أن العكس هو الصحيح لACI-23. ولذا فمن المناسب أن الاعتماد على بدء الورم في الفئران والتدفق الخلوي التحليل كما نهائيا من الوجود TIC. بعد هذا البروتوكول، لوحظ نشاط ALDH عالية باستمرار عندما كانت تزرع خلايا سرطان المبيض في ظروف الخلايا الجذعية. ومن المثير للاهتمام، CD133 التعبير هو أعلى باستمرار في ACI-23 الخلايا المزروعة في ظروف ثقافة TIC التقليدية، في حين ALDH هو أعلى في ظروف TIC العوام. في المقابل تعرض TGS-3 خلايا استسقاء الأولية زيادة صغيرة في CD133 إيجابية في ظل ظروف TIC العوام، ولكن زيادة ملحوظة في النشاط ALDH في ظل ظروف TIC التقليدية. هذه النتائج تسلط الضوء على عدم تجانس خلايا سرطان المبيض واللدونة المرتبطة عادة مع الحيازات. لزيادة دعم CLAايم أن هذه الأساليب تعزز الحيازات، وقد لوحظ أيضا في إثراء TRA-1-60 خلايا إيجابية. TRA-1-60 هو علامة تعدد القدرات واستخدمت لتحديد سرطان الجنينية من المبيض والخصيتين وكذلك سرطان البروستاتا TICS 30-32. على الرغم من أن طرقنا كانت ناجحة مع العديد من خطوط الخلايا، فمن الممكن أن الشروط TIC القياسية قد تكون أنسب لبعض خلايا سرطان المبيض، في حين أن الظروف العوام تعديل إثراء أفضل لالحيازات في غيرهم من السكان خلية سرطان المبيض. وهذا يؤكد مرة أخرى عدم التجانس المتوقع سواء داخل المبيض خطوط الخلايا السرطانية للمرضى المشتقة وراسخة.
بالإضافة إلى علامات سطح الخلية هناك عدة عوامل النسخ التي ثبت أنها تميز الحيازات سرطان المبيض بما في ذلك NANOG، Sox2، أكتوبر 4 11، على الرغم من أن هذه العلامات ليست محددة لالحيازات سرطان المبيض وتمثل بدلا من العوامل الهامة لتعدد القدرات الخلايا الجذعية الجنينية وDIFferentiation 33،34. درسنا التغيرات في مستويات البروتين من هذه العوامل، ووجدت أن مستويات NANOG زيادة في ظروف ثقافة TIC، بالاتفاق مع الآخرين 13،35 وكذلك CD133، TRA-1-60، وCD117. وأظهر علامة الخلية الجذعية [كدنا مجموعة الإنسان مزيد من زيادة في الجينات CD133، NANOG، ميلك، وPODXL في الظروف TIC مقارنة مع الظروف ملتصقة التقليدية. الأهم من ذلك، وتجدر الإشارة إلى أنه، كما هو الحال مع علامات سطح الخلية، والعوامل النسخي المرتبطة الحيازات المبيض قد تختلف بين خطوط الخلايا وعينات المرضى.
وقد لاحظنا أن الخلايا قد تكون أكثر مكون للأورام والتعبير عن مستويات أعلى من علامات الخلايا الجذعية إذا كانت هي بطبيعتها غير ملتصقة في المختبر (أي الخلايا التي لا نعلق بسهولة إلى لوحة ملتصقة العائمة). في الثقافة، وخطوط الخلايا مثل ACI-23 وعادة ما يكون العديد من خلايا قابلة للحياة العائمة و / أو الخلايا التي تنمو عموديا بطريقة التراص تحت كونديت الثقافة التقليديةأيونات. وعلى الرغم من تخصيب ناجح التشنجات اللاإرادية من خلايا العائمة والمجاميع قد تكون خطوط الخلايا التي تنطبق على عدد قليل نسبيا بما في ذلك تلك الموجودة في هذه الدراسة وOVCAR-3 12، وتشير النتائج التي توصلنا إليها هذا قد يمثل السكان أكثر مكون للأورام. ولذلك، حصاد "عائم" سكان الخلايا المزروعة في لوحات زراعة الأنسجة القياسية وسائل الإعلام قد تكون بمثابة أسلوب بديل لتخصيب TIC، للخلايا التي تتكيف بشكل سيئ على وسائل الاعلام الخلايا الجذعية التجاري.
واستخدام الأساليب ثقافة مختلفة المعروضة في هذه المخطوطة تمكين تخصيب سريع للسكان التشنج وفهم أفضل لما العوامل دعم هذا النمط الظاهري في خلايا مختلفة. وتشمل التطبيقات الحالية لهذه الطريقة التي تميز مسارات إشارات حيوية لدعم انتشار هذه الفئة من السكان فريد من الخلايا. ونتائج هذه الدراسات تساعد على توضيح آليات تطور الورم والانتكاس.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |