Introduction
난소 암은 이환율과 사망률이 질병의 높은 재발, chemoresistant 기능되는 주요 원인으로 미국에서 가장 치명적인 부인과 악성 종양이다. 어떤 경우에는 하나시킬 수있는 유용한 항암 요법을 제안 일부 증거가 있지만 차 처리는 일반적으로, 최대 환원성 수술 이후의 백금 계 요법을 포함한다. 대부분의 환자는 일차 치료에 호의적으로 반응하지만, 불행히도 반 18 개월이 내에 재발합니다.
대부분 난소 종양은 상피 암종 및 난소 또는 난관 3,4의 표면 상피에서 기원 할 수있다. 몇몇 연구는 아마도 배란 5,6- 다음 필요한 조직 복구에 도움 여성 생식 시스템의 체세포 줄기 세포의 존재를 지원한다. ovul 동안 난소 및 나팔관 모두에서 높은 증식 활동토 오크 (. Gharwan, 등 제출 원고) 난소 암의 발달에 중요한 요인이 될 수있다. 종양 형성 세포의 유래는 불분명하지만 그들은 분할 또는 운명을 통제 할 수없는 그들을 렌더링 돌연변이를 통해 정상 줄기 세포 전구 세포, 또는 분화 세포에서 발생할 수 있습니다. 이 세포는 또한 "암 시작 세포" "암 줄기 세포,"또는라고 한 낮은 첨부 조건 하에서 종양, 다세포 타원체로 성장할 수 있습니다. TIC 개발의 계층 모델은 동적 일 수 있지만, 틱 화학 요법, 장기간의 자기 갱신과 각종 세포 계통 7,8으로 분화하는 능력이 정지 된 저항을 포함하여 정상 줄기 세포와 같은 다양한 기능을 공유 않는다.
몇몇 연구 난소 암 틱의 존재를 지원하고 현재 노력이 종양 세포가 9-11을 지원하는 메커니즘 (들)을 명확하게 진행되고. 각 마커의 실제 기여도는 불분명 11-16 및 특정 세포 유형이 될 수 있지만, 몇몇 표식은, CD133, ALDH1A1, CD117, CD44 및 발암에서 MyD88 포함한 향상된 난소 TICS를 식별하기 위해 제안되었다. 보편적 마커 나 마커 세트가 명백하게 난소 틱 설립되지는 않았지만, 다른 그룹은 높은 알데히드 탈수소 효소 (ALDH) 활동 13,17-21와 CD44 +, 대한 CD133 + 및 / 또는 셀을 선택하여 더 일반적으로 난소 틱을 격리했다. CD44는 히알루 론산에 대한 수용체 역할을하며 부착, 증식, 이동, 혈관 신생 및 분화 (22)를 포함하는 종양 진행, 중요한 몇 가지 과정을 조절하는 횡단 당 단백질이다. CD133 누구 함수 여전히 불분명하지만 연구가 세포막 토폴로지 (23)를 구성 제안 경막 당 단백질이다. ALDH, 알데히드의 산화를 촉매하는 효소의 세포 내, 가장 UNIVERS 수있다고 활성 등의 알 틱 마커는 정상 줄기 세포 및 틱 (24)를지지 ALDH에 기인 된 여러 조직 및 다양한 역할로부터 단리 줄기 세포에서 발견되었습니다. 현재로서는, CD133 및 ALDH1 난소 틱 13,21의 가장 재현 마커로 나타납니다.
틱의 특성을 이해하는데에 더하여, 특히이 모집단을 대상으로 약물을 확인하는 큰 노력도있다. 난소 암과 관련된 높은 재발률이 성공적으로 틱을 근절하기 위해 현재 화학 요법의 실패 원인 일 수 있습니다. 종양의 부피가 기존 치료법에 민감하지만, 틱은 저항성 및 표준 방법에 의해 탐지 밀도 것으로 생각된다. 치료 내성 및 종양 재발의 메커니즘은 해명 응답 및 난소 암 환자의 생존율을 향상하는 것이 중요하다.
여기서, 배양 기술이 설명된다 번째설립 및 기본 난소 암 세포주에서 틱 풍성. 본원에 기재된 배양 조건은 줄기 세포와 자질 11,12,14,16,20 TICS 타원체 또는 세포 증식을 유도하는 여러 그룹에 의해 사용되어왔다. 일반적 틱 농축에 사용되는 여러 가지 줄기 세포 배양 매개체 보충제가 있지만 / 스페 로이드 우리는 EGF와 FGF와 혈청이없는 배지 수식을 사용하지만, B27 또는 N-2 보조제의 첨가없이. 일반적으로 신경 세포의 배양 및 줄기 세포 풍부하게 사용될 선택된 보조제, 중배엽 표현형 25,26 홍보 도시 간충직 또는 상피 표현형을 갖는 TICS 더 발암 여부에 관한 분야에서 불확실성이 남아있다 27-29 . 변수 불확실성을 최소화하기 위해, 우리는 우리가 상피 성 난소 암 세포를 처리하기 때문에, 일반적인 식을 사용하여 선택했다.
낮은 부착 플라스크에 무 혈청 배지에서 세포를 유지회전 타원체 형성을 용이하게하고 및 CD133의 발현 ALDH 높은 활성을 갖는 세포의 증식을 지원한다. 우리의 작업은 더 정상 부착 상태에서 떠있는 세포는 더 종양 TIC 인구를 나타낼 수 있음을 보여 주었다있다. 무 흉선 누드 마우스에서 이러한 조건에서 성장한 세포의 주입은 혈청의 존재하에 부가 된 조건에서 배양 세포에 비해 더 높은 전위에 발암 리드. 난소 암 개시, 진행, 치료 반응 및 질환의 재발 틱의 역할에 관한 많은 정보가이 기술의 사용을 통해 얻어 질 수있다.
Protocol
난소 암 세포주 1. 전통 문화 (점착 조건)
참고 : 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다
- 기존의 세포 배양 배지를 준비합니다. 한 DMEM : 1 사용 F12 (+ L 글루타민, 15 mM의 HEPES +)를 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충. 0.45 μm의 진공 필터를 사용하여 필터 솔루션입니다.
- interest.Remove의 세포주 매우 낮은 냉동 또는 액체 질소에서 세포의 유리 병의 전통적인 이름, 날짜 표시 폴리스티렌 75cm 두 조직 배양 플라스크와 통로 수를 준비합니다. 5 분 동안 37 ℃의 수욕에 놓아 제상.
- 3 ㎖를 (상기 제조 됨) 기존의 세포 배양 배지를 함유하는 15 ml의 원심 분리 튜브에 바이알로부터 전송 현탁액. 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 서스펜션. 한편, 플라스크에 16 ml의 전통적인 세포 배양 배지를 추가합니다.
- 대기음 뜨는. 펠렛 및 전송 현탁액 플라스크 데 풀어 위아래로 2 ml의에게 기존의 세포 배양 미디어 피펫 세포를 사용. 조심스럽게 바위 플라스크에 균등하게 37 ° C, 5 % CO 2로 설정 가습 세포 배양 인큐베이터에서 cells.Place 플라스크를 배포합니다. 80 % 합류에 도달 할 때까지 세포를 매일 모니터한다.
- 이 세포 배양 후드 : 일단 세포가 80 % 컨 플루 언트 한 배양을 분할. 기음 뜨는 (칼슘과 마그네슘없이) 따뜻한 인산염 완충 생리 식염수로 씻어 (PBS). 1.5 ml의 트립신 0.25 %의 -EDTA를 추가하고, 실온에서 3 ~ 5 분을 품어.
- 이 새로운 폴리스티렌 75cm 2 플라스크를 준비하고 각각의 플라스크에 16 ml의에게 기존의 세포 배양 배지를 추가합니다. 새로운 플라스크 각각에 4 ㎖의 전통적인 세포 배양 배지와 같은 부피의 분취 세포를 트립신으로 재현 탁.
- 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정. 80 % 합류에 도달 할 때까지 세포를 매일 모니터한다. 세포를 분리하기 위해 계속-80에서 액체 질소의 문화 또는 동결 및 저장.
부동 또는 부착 세포를 사용하여 난소 암 세포주에서 다세포 타원체의 2 세대
참고 : 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다. 2 전통 문화 방법에서 세포주를 배양 한 후 - 3 통로 (섹션 1) 다음 단계를 진행합니다.
- 줄기 세포 미디어를 준비합니다. 한 DMEM : F12 (+ L 글루타민, + 15 mM의 HEPES) 및 1 % 녹아웃 혈청 교체 (100 U의 최종 농도 / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신) 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충 한 사용 0.4 % 소 혈청 알부민 및 0.1 % 인슐린 - 트랜스페린 - 셀렌. 0.45 μm의 진공 필터를 사용하여 필터 솔루션입니다.
- 20 NG / ml 내지 10 N의 최종 농도를위한 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF) 및 인간 재조합 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)와 보충 줄기 세포 매체g / ㎖, 각각.
주 : 성장 인자는 사용 전에 바로 줄기 세포에 신선한 미디어를 첨가한다. - 플로터 TIC 문화를 만듭니다. 전통 부착 배양 조건에서 재배 80 % 융합 세포의 플라스크를 제거합니다. 뒤에 부착 인구를 떠나, 미디어 및 모든 부동 세포 (단일 및 집계)를 수집, 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 전송할 수 있습니다. 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 서스펜션.
주 : 부동 세포 응집체 명백 24-72 시간을 접착 세포 배양은 전통적 하에서 플라스크 접합 후의. 약 1.0의 80 % 융합 성 플레이트 검색 최저 - 5.0 × 10 5 가능한 부유 세포 세포주에 따라 예상 될 수있다. 본 연구에서는 80 % 합류 접착 배양 물로부터 수집 부유 세포 수의 평균은하기와 같다 : OVCAR5 5.0 ACI-23, 4.8 대 × 105 × 105, CAOV3 3.5 × 105, 및 TGS- 1.0 × 105 3. 전송시, 멀티 셀이 다소 세포주에 의존하지만 전통과 플로터 TIC 문화 울라 회전 타원체의 형성은 몇 일 이내에 발생합니다. 예를 들어, ACI-23 세포 응집체보다 더욱 용이 CAOV3 세포를 형성한다. - 한편, 이름, 날짜 및 세포주의 통로 번호로 라벨링 초저 부착면 폴리스티렌 75cm 2 조직 배양 플라스크를 준비한다. 플라스크에 성장 인자 보충 세포 미디어 줄기 ㎖로 (10)를 추가합니다.
- 원심 분리 펠렛을 풀어 아래로 세포 미디어 줄기 ㎖로 6를 추가하고 피펫 팅에 의해 낮은 부착 플라스크에 완료, 기음 미디어 및 전송 펠릿되면. 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정. 회전 타원체 형성을 관찰 3 일 - 매 2 세포를 모니터링합니다.
- 기존 TIC 문화를 만듭니다. 전통 부착 배양 조건에서 재배 80 % 융합 세포의 플라스크를 제거합니다. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 1.5 ml의 트립신 0.25 %의 EDTA를 추가하고 배양 3-5RT에서 분.
- 이름, 날짜 및 세포주의 통로 번호로 라벨링 초저 부착면 폴리스티렌 75cm 2 조직 배양 플라스크를 준비한다. 플라스크에 설명 된 바와 같이, EGF와 FGF 보충 세포 미디어, 줄기, 10 ㎖를 추가합니다.
- 트립신과 플라스크에 세포 미디어 줄기 ㎖로 추가 6. 피펫 셀 솔루션은 상하 플라스크 표면에서 세포를 풀어 시도합니다. 세포의 전체 볼륨을 이동 (10)는 세포 미디어 줄기 ㎖로 포함 된 초저 부착 플라스크에. 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정.
- 각각 ml의 20 NG / 최종 농도가 10 ng를 / ㎖에 대한 세포 매체와 신선한 EGF와 FGF 줄기 ㎖로 추가 2 72 시간 - TIC 문화마다 48 보충.
- 80 %의 합류에 도달 - 60까지 셀을 모니터링합니다. 이 새로운 초저 부착 플라스크에 같은 부피를 배치하고 18 ㎖의 최종 부피를 달성하기 위해 신선한 줄기 세포 매체를 첨가하여 분할 배양. 선택적인LY, 원심 분리기 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 전체 서스펜션. 줄기 세포 미디어 재현 탁 세포는 EGF와 FGF 보충하고 새로운 초저 부착 플라스크에 동일하게 배포 할 수 있습니다. 세포는 계대에 대한 단일 세포 현탁액으로 해리 할 필요가 없습니다.
참고 :이 시점에서 문화는 분리 배양, 냉동, 또는 실험적으로 분석 조작을 계속할 수 있습니다. 60 - 80 %의 합류 세포의 다음과 같은 농도는 ACI-23에 대해 검색했다 : 8.0 전통 자기편에 대한 × 10 (6), 전통 TIC 4.0 × 10 6, 플로터 TIC 문화 5.0 × 10 (6). 이 세포주 의존 할 수 있지만, 우리는 5 것으로 나타났습니다 - 문화에서 10 일 CD133 + ALDH + 세포의 비율로 TIC 농축을위한 최적의 처음 3 일 이내에 낮고, 5 봉우리 - 10 일, 그리고 다시 감소 십사일.
차 상피 난소 암 세포주 및 다세포 회전 타원체의 3 세대Chemoresistant 환자 복수에서
참고 : 심사위원회 (Institutional Review Board)의 승인이 프로토콜에 대한 얻었다. 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다.
- 기존의 세포 배양 배지와 1 : 1 유체 플레이트 복수. 1 절에 설명 된대로 미디어를 준비하고 여러 전통 폴리스티렌 75cm 두 조직 배양 플라스크에 10ml를 추가합니다.
- 복수 액은 일반적으로 1 L 멸균 진공 병에 제공된다; 진공 캡을 제거합니다. 조심스럽게 37 ° C, 5 % CO 2로 설정 가습 세포 배양 인큐베이터에서 10 ml의 전통적인 미디어와 장소를 포함 플라스크에 액체 10 ml의 복수를 추가합니다. 전체 미디어의 변화를 수행하기 전에, 96 시간 - 72 방해받지 둡니다. 80 % 합류 - 세포가 60에 도달 할 때까지 3 일 - 매 2 미디어 변경
- 2 절에 설명 된대로 섹션 1. TIC 문화에 설명 된대로 2 : - 세포가 60에 도달하면 80 %의 합류, 1 분할.
참고 : ascit에 존재하는 적혈구그들은 비 부착만큼 ES는 최초의 미디어 변경 후 제거됩니다. 그들은 더 민감하고 트립신에 최소한의 노출로 올라옵니다으로 존재하는 섬유 아세포 크게 트립신 처리 후 제거됩니다. 난소 암 세포의 순도는 CA-125 (MUC16)에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석으로 측정 하였다.
TIC 마커의 유동 세포 계측법 확인을위한 세포의 4. 염색
- TIC 문화를 수집합니다. 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 플라스크의 내용을 전송합니다. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 현탁액. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 대단히 짧은 시간을 깨고 하나의 세포로 해리 아래로 37 ° C에서 5 분, 최대 피펫과 -, 2 ml의에게 비 효소 세포 분리 솔루션을 추가 3 품어. 세포 미디어 줄기 ㎖로 4를 추가합니다.
- 자기편 문화를 수집합니다. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 3 ㎖에게 비 효소 세포 분리 솔루션을 추가하고 3 부화 - 37 ° C에서 5 분. 기존의 세포 3 ML을 추가문화 미디어는 최대 피펫 반복 아래 플라스크에서 세포를 분리하는 원심 분리기 튜브에 수집합니다.
- 원심 분리기 TIC 400 x g에서 5 분 동안 부착 현탁액 모두. 상등액을 버리고 3 % 소 태아 혈청을 함유하는 1 ml의 PBS에 재현 탁 각 펠릿. RT 30 분에 품어. 한편, 트리 판 블루를 사용하여 가능한 세포의 수를 계산합니다. 타원체가 하나의 세포로 해리 확인하기 위해 현미경으로 세포를 관찰합니다.
- 보상 1) 흠을 (흠없는 제어) 보상, 2) ALDH (단일 얼룩 양성 대조군) 보상, 3) CD133을 (단일 얼룩 양성 대조군), 4 : 다음 배양 조건의 각 라벨 5 X 1.5 에펜 도르프 튜브 ) ALDH + CD133 (실험 시료), 5) FL-1, FL-4 채널, 각각)에서 DEAB + ALDH (형광 배경에 대한 부정적인 제어합니다.
- 400 × g으로 5 분 동안 원심 분리기 (4) 서스펜션 - 튜브 # 1~ 약 5 × 105 세포에 각각 분배. 기음 supernata500 μL Aldefluor 분석 버퍼에서 NT 및에 resuspend 펠렛. 실험 부정적인 제어 튜브 # 5에 10 μL의 DEAB (ALDH 억제제)를 추가합니다.
- 보상 양성 대조군과 혼합하는 영화에 대한 관 # 2에 Aldefluor 시약 활성화 5 μl를 추가합니다. 실험 분석을 위해 튜브 # 4 Aldefluor 시약 활성화 5 μl를 추가합니다. 톡 튜브를 혼합하고 즉시 DEAB을 포함 튜브 # 5 (250 μL)에 튜브 # 4에서 세포의 절반 볼륨을 전송합니다.
- 톡 튜브는 잘 혼합합니다. 빛으로부터 보호 37 ° C에서 45 분 - 30에 대한 모든 튜브를 품어. 톡 튜브의 중간 잠복기를 통해 세포가 바닥에 닿고있다. 원심 분리기 400 x g에서 5 분 동안 모든 튜브. 500 μL Aldefluor 분석 버퍼에 기음 뜨는에 resuspend 세포.
- CD133 염색과 튜브 (# 3, # 4), 직접 Aldefluor 분석 버퍼에 CD133-APC 1:11 추가합니다. 빛으로부터 보호 얼음에 15 분을 품어. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 CD133 튜브. 한 번 세척분석 완충액 500 μL Aldefluor. 각각 500 μL Aldefluor 분석 완충액에 재현 탁 세포.
- 셀 스트레이너 캡 개별 폴리스티렌 원형 바닥 튜브에 필터 현탁액. 전체 볼륨 캡을 통해 여과되어 있는지 확인합니다.
- 세포 집단을 분석하는 플로우 사이토 미터를 사용한다. 보상 제어를 설정하는 튜브에게 # 1-3를 사용합니다. 세포 파편을 제외해야되고, 세포를 앞으로 사용 및 측면 산란 매개 변수, 게이트. ALDH +와 CD133 + 각각 FL-1, FL-4 채널을 사용하여 두 번 세포를 설정합니다.
- 유세포 분석 프로그램을 사용하여 배양 조건이 두 마커 높은 염색 있어야 TIC 풍부한 배양 등 TIC 세포의 비율을 향상 확인.
참고 : CD133 및 ALDH 외에 다른 markersof 난소 암 틱은 유동 세포 측정기의 성능에 의존하는 임의의 하나의 샘플에 사용 된 마커들의 수와 분석 될 수있다.
5. 생체 내
참고 : 심사위원회 (Institutional Review Board)의 승인이 프로토콜에 대한 얻었다. 3 케이지의 실험 그룹으로 세 8 주 및 주사하기 전에 며칠 동안 적응 할 수 있도록 - 흉선 여성 누드 마우스 (6)를 배포합니다. NIH 동물 관리 및 사용위원회에 따라 인도적인 실험 지침에 따라 마우스를 따라; 체중 감소 또는 20 % 이상을 확보, 수척 외관, 설사 피부염 체중, 신체적 외모를 모니터링 및 CO 2 질식에 의해 이러한 기준에 맞는 마우스를 안락사.
- 1 ml의 PBS에서 2 절 재현 탁 각각의 세포 집단에 설명 된대로 문화를 수집합니다. 트리 판 블루 분석법을 이용하여 가능한 세포를 계산합니다.
- 15 ml의 원심 분리기 튜브를 준비합니다. 중으로 대책 각 튜브에 2 ml의 PBS 중에 희석 1.5 × 106 생세포를 추가 (0.5 ml의 부피의 5 × 105 세포를 피하 주입 F 오른쪽 될각 마우스의 여윈). 만 제어 마우스 0.5 ml의 PBS를 준비합니다.
- 27 G 바늘을 사용하여, 그룹 당 3 마우스의 각각의 오른쪽 측면에 TIC 문화를 뜨는 또는 PBS, 전통 부착 문화, 전통 TIC 문화에서 0.5 ml의 세포 현탁액을 subcutaneouslyinject. 원래 케이지 포스트 분사에 마우스를 돌려줍니다.
- 마우스 무게와 길이와 폭을 수립, 버니어 캘리퍼스 weeklyby 두 번 두 차원에서 어떤 만져서 알 수있는 종양을 측정한다.
주 : 종양 대기 시간은 일반적으로 20 - 세포주에 따라 50 일. - 표준 방법 (V = (폭) 2 × 길이 / 2)에 의해 종양 젖은 볼륨을 계산합니다.
참고 :이 연구는, 유사한 조건 하에서 성장 틱의 생체 시리얼 계대가 다른 11,20에 의해 완성 된 첫 번째 세대에 대한 부착 세포 대 틱의 발암를 비교하지만.
Representative Results
TIC의 배양 조건에서 배양 동일한 세포 TIC 인구 공통 회전 타원체 형태를 떠 표시 할 반면, 난소 암 세포주 및 장착 혈청 쇼 조약돌 형태의 존재 하에서 전통적인 접착 배양 조건에서 배양 일차 복수 세포주를 설치했다. 그림 1에 표시 시야 화상이 선명 배양 조건의 형태 학적 차이를 보여줍니다. 그림 1B는 기존의 부착 상태에서 ACI-23 및 TGS-3 TIC 문화를 replating 후 달성 차별화 된 형태학을 보여줍니다. 전형적인 부착 세포를 닮은, 그냥 24 시간 부착 된 상태에서 다시 파종 후, 다세포 타원체의 대부분은 해리와 표면에 부착합니다.
분석은 난소 틱의 두 가지 일반적인 마커를 사용하여 수행 된 세포 계측법 TIC 조건이 흐름 줄기 세포 마커와 세포 풍부 있는지 확인하려면 - CD133의 expressio을n 및 ALDH 활동. 그림 2 점 플롯은 낮은 첨부, 무 혈청 조건에서 CD133 + 세포의 증가 비율을 강조 표시합니다. 마찬가지로, ALDH 효소의 활성은 전통적인 접착 배양 조건에 비해 다음과 같은 상태에서 더 높다. 전통적인 부착 배양 CD133 + 세포, 회전 타원체의 형성을 강화 조건 백분율 증가를 포함 않는다. 만능 마커 분석, TRA-1-60, TIC 조건 틱, 그림 2 B에 대해 풍부하게하는 것이 더 지원을 빌려 준다. 그림 2 C의 정량 더블 플러스 (CD133 + ALDH +) ACI-23 세포가 크게 TIC 강화 조건 하에서 성장 문화로 제한되어 있음을 보여줍니다. TIC 조건에서 배양 5 일 후 ACI-23 세포에서 발생하는 다른 전사 인자의 단백질 수준에서의 변화도 조사 하였다. 마커의 각 점진적 증가s는 자기편 문화에서 볼 수있는 상대적으로 낮은 수준, 그림 2 D에 비해 TIC 조건을 뜨는 전통에서 볼 수있다. 흥미롭게 다양한 조건에서 재배 복수 인간 세포주 뜨는 TIC 전혀 오염 조건의 존재도 2 E 거의없이 전통적인 TIC 조건 하에서 최고 표현형 마커를 표시한다.
TIC의 배양 조건의 발암는 흉선 누드 마우스의 동료에 모든 조건에서 획득 가능한 세포 같은 수의 피하 주사를 통해 검증 하였다. (3)이 보여 그림이 ACI-23 (A, B)와 OVCAR-5 (C) 세포에서 전통 부착 문화 TIC 문화보다 덜 종양이었다. 뜨는 TIC 배양 전통적인 부착 또는 전통적인 TIC 배양보다 짧은 시간에 더 큰 종양을 유의 제조. 이 DATA는 심지어 난소 TIC 마커의 완만 한 증가, 극적인 표현형의 변화가 있음을 시사한다. 그러나 다른 세포주 (미도시)와 함께 기존의 TIC 배양 물은 전통적인 뜨는 TIC 및 접착 배양 세포보다 종양 형성했다.
다른 배양 조건에서도 1 회전 타원체 개발. (A) 설립 난소 암 세포주 (ACI-23, OVCAR-5 및 CAOV3) 및 혈청이없는 낮은 부착 플라스크에서 성장 기본 환자 유래의 복수의 셀 (TGS-3) 줄기 세포 미디어는 쉽게 다세포 타원체를 형성한다. 이미지는 TIC 조건에서 96 시간 내에 구 상체를 형성 같은 세포 반면, 전통적인 부착 배양 조건은 ACI-23의 상피 조약돌 형태를 유지 OVCAR-5, CAOV3 및 TGS-3 세포 보여줍니다. 스케일 바 100 μm의. 24 시간 노출시 (B)전통 부착 배양 조건에, TIC 문화 모폴로지는 원래 부착 형태를 닮은 차별화 된 표현형을 표시합니다. 스케일 바 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 낮은 부착, 무 혈청 조건 TIC 마커 세포 풍부. (A) CD133 항체 결합 APC를 사용하여 ACI-23 세포의 유동 세포 계측법 분석은 무 혈청 줄기 낮은 부착 플라스크에 CD133 + 세포의 증가 비율을 보여줍니다 세포 미디어. Aldefluor 분석 프로그램을 이용하여 분석 유동 세포 계측법은 무 혈청 줄기 세포 미디어 낮은 부착 플라스크에서 배양 세포에서 ALDH 활동을 증가했다. CD133 음성 대조군은 항체 및 ALDH 부정적인 사기꾼이 없습니다트롤 ALDH 억제제 (DEAB)의 존재 하에서 활성화 된 기판이다. FITC 복합 TRA-1-60 항체를 이용하여 (B) 분석 ACI-23 세포에서 뜨는 TIC 조건 TRA-1-60 + 세포의 가장 높은 비율을 보여줍니다. 음성 대조군은 항체를 포함하지 않는다. (C) + CD133 + 세포는 ALDH 전통적인 TIC에서 최고이고 ACI-23 세포주 TIC 조건 뜨는. 오차 막대 : SEM, N = 6, * P <0.05. (D) 웨스턴 블롯 분석은 5 일간 배양 조건 TIC ACI-23 세포에서 줄기 세포의 전사 마커 단백질 수준에서의 증가를 도시. 전체 세포 용 해물 (50 μg의)을 로딩 대조군으로서 GAPDH 분석 하였다. (E)에서와 같이 분석 TGS-3 차 복수 세포의 대표 도트 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 낮은 부착, 무 혈청 조건이 증가 발암와 세포 풍부. (A) 5 × 10 5 가능한 ACI-23 세포는 피하 세중를 누드 마우스에 주입했다. 마우스의 무게를 측정하고 종양은 일주일에 두 번 캘리퍼스로 측정. A = 전통 부착 문화, F = 플로터 TIC 문화, S = 전통 TIC 문화. * P <0.05. (B) 다른 배양 조건에서 성장 된 세포를 사용 이십오일 후 ACI-23에서 형성된 종양의 대표적인 이미지. (C) 5 × 10 5 가능한 OVCAR-5 세포는 피하 세중를 누드 마우스에 주입과 같이 관찰 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜이 확립 난소 암 세포주에서 줄기 세포 기능과 세포 배양 물을 풍부하게 할 수있는 효과적이고 일관된 방법을 제시하고, 기본 환자 샘플에 적용 가능하다. 이 방법은 성공적 다양한 세포주 걸쳐 TICS위한 풍부. 그것은 물리적으로 인구 내에서 비 틱에서 틱를 정렬하는 시간을 고려하지 않고, TIC 및 / 또는 종양 표현형에 대한 풍부 조건을 적시에 식별 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 서로 다른 신호 경로의 상대 수준의 기능 분석을 사용하여 다양한 배양 TIC 전통적인 접착 배양을 비교하여 TIC 표현형 기여도에 대해 평가 될 수있다. 순수한 TIC 인구 원하는 경우, 분리 용이 프로토콜 유세포 형광의 보조 또는 자기 정렬 공정을 도입함으로써 달성 될 수있다.
그것은, 그러나, 명심하는 것이 중요하다 TIC 마커의 발현예컨대 CD133, CD44, 또는 같은 ALDH들, 세포주 또는 동일한 유형의 종양 샘플 환자마다 다를 수있다. 예를 들어 우리는 역이 ACI-23에 해당하는 반면, OVCAR-5 세포는 CD133에 CD44 상대적으로 높은 표현을 가지고 있음을 발견했다. 이 마우스에서 종양 개시에 의존 TIC 존재의 결정적인 등 유동 세포 계측법 분석하는 것이 적절하다. 난소 암 세포는 줄기 세포에서 성장 조건 때이 프로토콜에 따라, 높은 ALDH 활성을 일관되게 관찰 하였다. ALDH가 뜨는 TIC 조건에서 가장 높은 반면 흥미롭게 CD133의 발현은 기존 TIC의 배양 조건에서 배양 ACI-23 세포에서 높은 수치이다. 대조적 TGS -3- 차 전지는 복수 뜨는 TIC 조건 CD133 양성의 작은 증가하지만, 전통적인 TIC 조건 ALDH 활성의 현저한 증가를 표시. 이러한 연구 결과는 난소 암 세포의 이질성 일반적 TICS와 연관된 가소성 강조. 더 CIA 요원을 지원하기 위해이러한 방법은 틱을 향상 메신저, TRA-1-60 양성 세포의 농축도 관찰되었다. TRA-1-60 능성 마커 및 TICS 전립선 암 (30-32)뿐만 아니라 배아 난소 암종 및 고환을 식별하는 데 사용되어왔다. 우리의 방법은 다양한 세포주를 성공적으로 완료되었지만,이 변성 뜨는 조건이 더 좋은 다른 난소 암 세포 집단에서 틱 풍성 동안 표준 TIC 조건 일부 난소 암 세포에 더 적합 할 수도있다. 이는 다시 두 환자 유래의 확립 및 난소 암 세포주 내의 예상 이질성을 강조.
이러한 마커는 난소 암 틱 특정 아니며 오히려 배아 줄기 세포의 분화능에 중요한 인자들을 나타내지 만 세포 표면 마커에 더하여에 Nanog, SOX2, 10 월 4-11 포함 난소 암 틱을 특성화 도시 된 여러 전사 인자가 있는데 및 DIFferentiation (33, 34). 우리는 이러한 요소의 단백질 수준의 변화를 검사하고 Nanog를 수준이 다른 13,35뿐만 아니라 CD133, TRA-1-60, 및 CD117와 일치, TIC의 배양 조건에서 증가 할 것으로 나타났다. 인간 줄기 세포 마커의 cDNA 배열은 또한 기존에 비해 접착 조건 TIC 조건 CD133, Nanog를, 멜크 및 PODXL 유전자의 증가를 보였다. 중요한 것은,이 세포 표면 마커로서, 난소 TICS와 연관된 전사 인자 세포주 및 환자 샘플에 따라 다를 수 있음을 알아야한다.
우리는 그들이 시험관 내에서 본질적으로 비 - 부착 세포 인 경우보다 종양 형성하고 줄기 세포 마커의 발현 수준이 높은 것을 관찰 할 수있다 (즉, 용이하게 부착 판에 부착되지 않은 세포를 부유). 문화, 이러한 ACI-23 등의 세포주는 일반적으로 전통 문화 CONDIT에서 적층 방식으로 수직 성장 많은 가능한 부동 세포 및 / 또는 세포가이온. 부동 세포 집계에서 틱의 농축에 성공이 본 연구와 OVCAR-3 (12)을 포함하여 상대적으로 적은 수에 적용 세포주 수는 있지만, 우리의 연구 결과는이보다 종양 인구를 나타낼 수 좋습니다. 따라서, 상업적인 줄기 세포 매체 저조한 적응 셀, TIC 농축 다른 방법으로 작용할 수있다 표준 조직 배양 플레이트에서 성장 매체 세포 "부동"인구를 수확.
이 논문에서 제시된 다양한 배양 방법의 사용은 TIC 개체군 빠른 농축 및 다른 셀들에서이 표현형을 지원 요인을보다 잘 이해할 수있게된다. 이 방법의 현재 응용 프로그램은 신호 전달 경로는 세포의 독특한 인구의 전파를 지원하는 필수적인 특성화를 포함한다. 이러한 연구 결과는 종양 진행과 재발의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
| Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
| CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
| Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
| Epidermal Growth Factor - human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
| DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | |
| Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning Cellgro | 25-056-CI | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (heat inactivated) | Gemini | 100-106 | |
| Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) | Nalgene | 450-0045 | |
| 15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
| 50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |
References
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