Introduction
Kræft i æggestokkene er den mest dødbringende gynækologisk malignitet i USA med den største årsag til sygelighed og dødelighed er de stærkt tilbagevendende, kemoterapi funktioner i denne sygdom. Primær behandling omfatter sædvanligvis maksimal cytoreduktiv kirurgi og efterfølgende platinbaseret behandling, selv om der er nogle tegn på, neoadjuverende terapi kan være gavnligt i nogle tilfælde 1. De fleste patienter reagerer positivt på primær behandling, men desværre halvdel vil tilbagefald inden for 18 måneder 2.
Mest æggestokkene maligniteter er epitel carcinomer og kan stamme i overfladen epitel i æggestokkene eller æggeleder 3,4. Flere undersøgelser støtter eksistensen af somatiske stamceller i det kvindelige reproduktive system, der formentlig hjælpe med vævsreparation, der er nødvendig efter ægløsning 5,6. Den høje proliferative aktivitet på både ovarie- og æggelederen under ovulation kan være en vigtig faktor i udviklingen af kræft i æggestokkene (Gharwan, et al. manuskript indsendt). Udledningen af tumor-dannende celler er uklar, men de kan stamme fra normale stamceller, stamceller eller differentierede celler gennem mutationer, som gør dem ude af stand til at regulere division eller skæbne. Er også blevet betegnet Disse celler "cancer stamceller," eller "kræft-initierende celler", og kan vokse ind tumorigene, flercellede spheroids under lave vedhæftet fil. Selv om den hierarkiske model af TIC udvikling kan være dynamisk, behøver TIC deler mange af de samme funktioner som normale stamceller, herunder ubevægelighed, modstandsdygtighed over for kemoterapi, langsigtet selvfornyelse og evnen til at differentiere til forskellige celleafstamninger 7,8.
Flere undersøgelser støtte forekomsten af tics hos ovariecancer og nuværende bestræbelser i gang for at klarlægge mekanismen (er), hvorved disse celler understøtter tumorigenesis 9-11. Adskillige markører er blevet foreslået at identificere æggestokkene TIC med forøget tumorgenicitet herunder CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, og MyD88, selv om den nøjagtige bidrag af hver markør er uklar og kan være celletypespecifik 11-16. Mens en universel markør eller et sæt af markører ikke er entydigt fastlagt for ovariale tics, har forskellige grupper isoleret æggestokkene TIC mere almindeligt ved at selektere for CD44 +, CD133 + og / eller celler med høj aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet 13,17-21. CD44 er et transmembrant glycoprotein, der virker som en receptor for hyaluronsyre og regulerer flere processer vigtige for tumorudvikling, herunder adhæsion, proliferation, migration, angiogenese og differentiering 22. CD133 er et transmembrant glycoprotein, hvis funktion er stadig uklart, men undersøgelser tyder det organiserer plasmamembran topologi 23. ALDH, et intracellulært enzym, som katalyserer oxidationen af aldehyder, kan være den mest universal markør tics som høj aktivitet er blevet identificeret i stamceller isoleret fra en række forskellige væv og flere roller er blevet tilskrevet ALDH at støtte normale stamceller og TIC 24. Hvad nu, CD133 og ALDH1 synes at være de mest reproducerbare markører for æggestokkene TIC 13,21.
Ud over at forstå karakteristika tics, er der også en stor indsats for at identificere lægemidler, som specifikt er målrettet mod denne subpopulation. Den høje tilbagefald sats forbundet med kræft i æggestokkene kan skyldes svigt af de nuværende kemoterapier at kunne udrydde TIC. Selv om størstedelen af tumoren er modtagelig for eksisterende behandlinger er TIC menes at være resistente og ved en densitet påvises ved standardmetoder. Belyse resistensmekanismer terapi og tumor tilbagefald er afgørende for at forbedre respons og samlet overlevelse satser for patienter med kræft i æggestokkene.
Her er dyrkningsteknikker beskrevet thpå berige af tics fra etablerede og primær ovariecancer cellelinjer. De dyrkningsbetingelser beskrevet heri er blevet anvendt af flere grupper til at fremkalde formering af tics eller kugleformede celler med stamcelle kvaliteter 11,12,14,16,20. Selv om der er flere stamceller kultur medier og kosttilskud, der almindeligvis anvendes til berigelse af TIC / sfæroider anvendte vi et serumfrit medie formel med EGF og FGF, men uden tilsætning af B27 eller N-2 kosttilskud. Disse kosttilskud, der almindeligvis anvendes til neuronal cellekultur og berigende for stamceller, har vist sig at fremme en mesenchymal fænotype 25,26 og der fortsat en vis usikkerhed på området, om TIC har en mesenchymal eller epiteliale fænotype er mere tumorigene 27-29 . For at minimere usikkerheder og variabler, vi har valgt for at bruge de mest almindelige formel, da vi har at gøre med epitelial kræft i æggestokkene celler.
Fastholdelse celler i serumfrie medier i en lav vedhæftning kolbeletter klumpformet dannelse og støtter udbredelsen af celler med CD133 udtryk og høj ALDH aktivitet. Vores arbejde har endvidere vist, at celler flyder under normale vedhængende forhold også kan repræsentere en mere tumorigen TIC befolkning. Injektion af celler dyrket under disse betingelser i athymiske nøgne mus fører til højere tumorigent potentiale sammenlignet med celler dyrket i tilknyttede betingelser i nærvær af serum. Meget information vedrørende rollen tics i ovariecancer initiering, progression, terapeutisk respons og sygdomstilbagefald kan opnås ved anvendelse af disse teknikker.
Protocol
1. traditionelle kultur æggestokkræft cellelinier (Adhærente betingelser)
BEMÆRK: Al håndtering af celler og medier bør finde sted i en steril vævskultur hætte
- Forbered traditionelle celledyrkningsmedier. Brug 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamin, + 15 mM HEPES) og supplere med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin. Filter opløsning ved anvendelse 0,45 um vakuumfilter.
- Forbered en traditionel polystyren 75cm 2 vævskulturkolbe mærket med navn, dato og passage på den celle linje interest.Remove hætteglasset med celler fra ultralav fryseren eller flydende nitrogen. Optøning ved anbringelse i 37 ° C vandbad i 5 minutter.
- Transfer suspension fra hætteglasset i et 15 ml centrifugerør indeholdende 3 ml traditionelle celledyrkningsmedier (fremstillet ovenfor). Centrifuger suspensionen ved 4 ° C i 5 minutter ved 400 x g. I mellemtiden, tilsæt 16 ml traditionelle cellekultur medier til kolbe.
- Aspirer supernatanten. Under anvendelse af 2 ml traditionelle celledyrkningsmedier pipette celler op og ned for at løsne pellet og overførsel suspensionen kolbe. Ryst forsigtigt kolbe at fordele cells.Place kolben i befugtet cellekultur inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2. Overvåg celler dagligt indtil 80% konfluens er nået.
- Når cellerne er 80% sammenflydende opdele kultur 1: 2 i cellekultur hætte. Aspirer supernatanten og vask med varm phosphatbufret saltvand (uden calcium og magnesium) (PBS). Tilføj 1,5 ml Trypsin 0,25% EDTA og inkuberes 3-5 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered 2 nye polystyren 75cm 2 kolber, og der tilsættes 16 ml til hver kolbe traditionelle celledyrkningsmedier. Resuspender trypsiniserede celler i 4 ml traditionelle cellekultur medier og alikvote lige store volumener til hver af de nye kolber.
- Place kolber i befugtet cellekultur inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2. Overvåg celler dagligt indtil 80% konfluens er nået. Fortsæt med at opdele celler ogkultur eller fryse og opbevares ved -80 eller i flydende nitrogen.
2. generation af flercellet Sfæroider fra æggestokkene cancercellelinjer med flydende eller klæbende celler
BEMÆRK: Al håndtering af celler og medier bør finde sted i en steril vævskultur hætte. Efter dyrkning cellelinjer under traditionelle dyrkningsmetoder til 2 - 3 passager (punkt 1) fortsætte med følgende trin.
- Forbered stamceller medier. Brug 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamin, + 15 mM HEPES) og supplerer med 1% penicillin / streptomycin (til en endelig koncentration på 100 U / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin), 1% knockout serum udskiftning , 0,4% bovint serumalbumin og 0,1% insulin-transferrin-selen. Filter opløsning ved anvendelse 0,45 um vakuumfilter.
- Supplement stamceller medier med human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF) og human rekombinant basisk fibroblast-vækstfaktor (FGF) til en slutkoncentration på 20 ng / ml og 10 Ng / ml.
BEMÆRK: Vækstfaktorer bør tilføjes frisk til stamcelle medier lige før brug. - Opret floater TIC kultur. Fjern kolbe på 80% konfluente celler dyrket i traditionelle adhærente dyrkningsbetingelser. Saml medier og alt flydende celler (single og tilslagsmaterialer), der forlader det vedhængende befolkning bag, og overføre til 50 ml polypropylen centrifugerør. Centrifuger suspensionen ved 4 ° C i 5 minutter ved 400 x g.
BEMÆRK: Flydende celler og aggregater er tilsyneladende 24-72 timer efter adhærente celler er bundet til kolben under en traditionel kultur. Fra en 80% sammenflydende plade genfinding af ca. 1.0 - 5.0 x 10 5 levedygtige flydende celler kan forventes afhængigt af cellelinjen. I denne undersøgelse er det gennemsnitlige antal flydende celler opsamlet fra 80% sammenflydende vedhæftende kultur var: 5,0 x 10 5 til ACI-23, 4,8 x 10 5 for OVCAR5, 3,5 x 10 5 for Caov3 og 1,0 x 10 5 for TGS- 3. Ved overdragelsen multicellular sfæroid dannelse i traditionelle og floater TIC kultur forekommer inden for et par dage, selv om dette er noget cellelinie afhængige. For eksempel ACI-23 celler danner aggregater mere lettere end Caov3 celler. - I mellemtiden forbereder en ultra lav fastgørelsesflade polystyren 75 cm 2 vævskulturkolbe mærket med navn, dato og passage antal cellelinje. Der tilsættes 10 ml stamceller medier suppleret med vækstfaktorer til kolben.
- Når centrifugering er færdig, Aspirer medier og overføre pellet til lav tilknytning kolbe ved tilsætning af 6 ml stamceller medier og pipettering op og ned for at løsne pellet. Place kolber i befugtet cellekultur inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2. Overvåg celler hver 2 - 3 dage til at observere klumpformet formation.
- Opret traditionelle TIC kultur. Fjern kolbe på 80% konfluente celler dyrket i traditionelle adhærente dyrkningsbetingelser. Aspirer medier og vask med varmt PBS. Tilføj 1,5 ml trypsin 0,25% EDTA og inkuberes 3-5min ved stuetemperatur.
- Forbered en ultra lav fastgørelsesflade polystyren 75 cm 2 vævskulturkolbe mærket med navn, dato og passage antal cellelinje. Der tilsættes 10 ml stamceller medier suppleret med EGF og FGF, som beskrevet, til kolben.
- Tilføj 6 mL stamcelle medier til kolben med trypsin. Pipetter celle opløsning op og ned og forsøge at løsne cellerne fra kolben overflade. Overfør hele mængden af celler til ultralave fastgørelse kolbe indeholdende 10 ml stamcelle medier. Placer kolbe i befugtet cellekultur inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2.
- Supplement TIC kulturer hver 48-72 timer med yderligere 2 ml stamceller medier og frisk EGF og FGF for de endelige koncentrationer på 20 ng / ml og 10 ng / ml.
- Overvåg celler indtil 60-80% konfluens er nået. Split kulturer ved at placere lige store volumener i 2 nye ultra lav tilknytning kolber og tilsætning af frisk stamceller medier for at opnå et slutvolumen på 18 ml. Alternativly, centrifugeres hele suspension ved 4 ° C i 5 minutter ved 400 x g. Resuspender celler i stamceller medier suppleret med EGF og FGF og distribuere ligeligt i nye ultra-lav vedhæftede kolber. Celler behøver ikke at være dissocieret til enkelte cellesuspensioner til passage.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kulturerne kan fortsætte med at deles og dyrkes, frosset, eller eksperimentelt manipuleres til analyse. Ved 60-80% konfluens følgende koncentrationer af celler blev hentet til ACI-23: 8,0 x 10 6 for Traditional Tilhænger, 4,0 x 10 6 til traditionelle TIC, og 5,0 x 10 6 for Floater TIC kulturer. Selv om det kan være cellelinie afhængig, har vi fundet, at 5 - 10 dage i kultur er optimal for TIC berigelse som procentdelen af CD133 + ALDH + -celler er lav inden for de første 3 dage, toppe ved 5 - 10 dage, og mindsker igen 14 dage.
3. Generation af primær kræft i æggestokkene cellelinjer og Multicellulære Sfæroiderfra kemoterapi Patient Ascites
BEMÆRK: Institutional Review Board godkendelsen er opnået for denne protokol. Al håndtering af celler og medier bør finde sted i en steril vævskultur hætte.
- Plate ascitesvæske 1: 1 med traditionelle cellekulturmedier. Forbered medier som beskrevet i afsnit 1, og der tilsættes 10 ml til flere traditionelle polystyren 75 cm 2 vævskulturkolber.
- Ascitesvæske leveres normalt i 1 L sterile vakuum flasker; fjerne vakuum hætte. Tilsættes forsigtigt 10 ml ascitesvæske at kolbe indeholdende 10 ml traditionelle medier og plads i befugtet cellekultur inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2. Henstår for 72-96 timer, før du laver en komplet media forandring. Skift medier hver 2 - 3 dage, indtil cellerne når 60-80% sammenløb
- Når cellerne når 60-80% konfluens, delt 1: 2 som beskrevet i afsnit 1. Start TIC kulturer som beskrevet i afsnit 2.
BEMÆRK: Erythrocytter stede i ascites vil blive fjernet efter den første medier ændring, da de er ikke-klæbende. Eventuelle fibroblaster tilstedeværende vil blive stort set fjernet efter behandling med trypsin, da de er mere følsomme og vil løfte med minimal udsættelse for trypsin. Renhed af ovariecancerceller blev bestemt ved flowcytometri analyse under anvendelse af antistof til CA-125 (MUC16).
4. farvning af celler til flowcytometri Bekræftelse af TIC Markers
- Saml TIC kulturer. Overfør indholdet af kolbe i 50 ml polypropylen centrifugerør. Centrifuger suspensioner i 5 minutter ved 400 x g. Aspirer medier og vask med varmt PBS. Tilsæt 2 ml ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning inkuberes 3-5 minutter ved 37 ° C, og pipetteres op og ned for at opbryde klumper og dissociere i enkelte celler. Tilsættes 4 ml stamceller medier.
- Saml vedhængende kulturer. Aspirer medier og vask med varmt PBS. Tilsæt 3 ml ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning og inkuber 3-5 minutter ved 37 ° C. Tilsæt 3 ml traditionel cellekulturmedier og pipetteres op og ned flere gange for at løsne cellerne fra kolben og anbring i centrifugerør.
- Centrifuge både TIC og adhærente suspensioner i 5 minutter ved 400 x g. Supernatanten kasseres, og resuspender hver pellet i 1 ml PBS indeholdende 3% føtalt bovint serum. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. I mellemtiden, tælle antallet af levedygtige celler ved hjælp af trypanblåt. Observer celler under mikroskop for at bekræfte sfæroider dissocieres i enkeltceller.
- Label 5 x 1,5 ml Eppendorf-rør til hver af følgende dyrkningsbetingelser: 1) Ufarvet (uplettet kontrol om erstatning), 2) ALDH (enkelt plet positiv kontrol for kompensation), 3) CD133 (enkelt plet positiv kontrol for kompensation), 4 ) ALDH + CD133 (eksperimentel test prøve), og 5) DEAB + ALDH (negative kontroller til baggrundsfluorescens i FL-1 og FL-4 kanaler, henholdsvis).
- Fordel ca. 5 x 10 5 celler hver på rør # 1 - 4. Centrifuger suspensioner i 5 minutter ved 400 x g. Aspirer supernatant og resuspender pellets i 500 pi Aldefluor Assay Buffer. Tilføj 10 pi DEAB (ALDH inhibitor) til rør # 5 for eksperimentel negativ kontrol.
- Tilsæt 5 pi aktiverede Aldefluor reagens til rør # 2 om erstatning positiv kontrol og svirp for at blande. Tilsæt 5 pi aktiverede Aldefluor reagens til rør # 4 for eksperimentel analyse. Flick rør for at blande og straks overføre halvdelen af volumenet af celler fra rør # 4 ind i røret # 5 (250 pi), som indeholder DEAB.
- Flick rør for at blande godt. Inkuber alle rør for 30-45 minutter ved 37 ° C beskyttet mod lys. Flick rør halvvejs gennem inkubationsperiode som celler vil sedimentere til bunden. Centrifugeres alle rør i 5 minutter ved 400 x g. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 500 pi Aldefluor Assay Buffer.
- For rør med CD133 farvning (# 3 og # 4), tilføj CD133-APC 01:11 direkte ind Aldefluor assaybuffer. Inkuber 15 min på is beskyttet mod lys. Centrifuge CD133 rør i 5 minutter ved 400 x g. Vask en gang med500 pi Aldefluor assaypuffer. Resuspender celler i 500 pi Aldefluor assaypuffer hhv.
- Filter suspensioner i de enkelte polystyren rundbundede rør med cellefilter hætte. Sørg for, at hele mængden filtreres gennem hætten.
- Anvend et flowcytometer at analysere cellepopulation. Brug rør # 1-3 til indstilling kontrol erstatning. Brug frem og side-scatter parametre, gate cellerne, og sørg for at udelukke cellerester. Etablering ALDH + og CD133 + dobbelt celler under anvendelse af FL-1 og FL-4 kanaler, henholdsvis.
- Ved hjælp af en cytometrisk analyse program, bekræfter dyrkningsbetingelser forbedret procentdelen af TIC celler som de TIC-rige kulturer bør have højere farvning for disse to markører.
BEMÆRK: Ud over CD133 og ALDH, andre markersof ovariecancer TIC kan analyseres med det antal markører, der anvendes i et prøve afhængig af mulighederne i flowcytometer.
5. In vivo
BEMÆRK: Institutional Review Board godkendelsen er opnået for denne protokol. Fordel athymiske nøgne hunmus 6 - 8 uger gamle i forsøgsgrupper i bure af 3 og tillade at akklimatisere sig i et par dage før injektion. Følg mus under humane eksperimentelle retningslinjer som pr NIH Animal Care og brug Udvalg; overvåge kropsvægt, fysiske udseende herunder vægttab eller vinde mere end 20%, afmagret udseende, diarré eller dermatitis og aflive mus passer disse kriterier ved CO 2 kvælning.
- Saml kulturer som beskrevet i afsnit 2. Resuspender hver celle population i 1 ml PBS. Tæl levedygtige celler ved hjælp af trypanblåt assay.
- Forbered 15 ml centrifugerør. For tredobbelt foranstaltninger tilføje 1,5 x 10 6 levedygtige celler fortyndet i 2 ml PBS i hvert rør (5 x 10 5 celler i et volumen på 0,5 ml vil blive injiceret subkutant i højre flank af hver mus). Forbered 0,5 ml PBS kun for kontrol mus.
- Brug 27 g nåle, subcutaneouslyinject 0,5 ml cellesuspension fra traditionelle vedhængende kulturer, traditionelle TIC kulturer, floater TIC kulturer, eller PBS i den højre flanke af hver af 3 mus per gruppe. Retur mus til den oprindelige bure efter injektion.
- Mus veje og måle eventuelle tydelige tumorer i to dimensioner to gange weeklyby skydelære, oprettelse længde og bredde.
BEMÆRK: Tumor latenstid er normalt 20-50 dage, afhængig cellelinie. - Beregn tumor våde volumen ved standardmetoder (V = (bredde) 2 x længde / 2).
BEMÆRK: Selvom dette studie sammenlignet tumorigenicitet tics versus vedhængende celler til den første generation kun har in vivo seriepassage tics dyrket under lignende betingelser blevet gennemført af andre 11,20.
Representative Results
Etableret ovarian cancer cellelinjer og en primær ascites cellelinie dyrkes i traditionelle adhærente dyrkningsbetingelser i nærvær af serum show fastgjort brosten morfologi, medens de samme celler dyrket i TIC dyrkningsbetingelser udviser flydende sfæroid morfologi, almindelig i TIC populationer. Brightfield billeder, der vises i figur 1 A viser tydeligt de morfologiske forskelle i dyrkningsbetingelser. Figur 1B viser de differentierede morfologier opnået efter genudplade ACI-23 og TGS-3 TIC kulturer i traditionelle vedhængende forhold. Blot 24 timer efter podning tilbage i vedhængende forhold, et flertal af de flercellede spheroids dissocierer og vedhæfte til overfladen, ligner typiske vedhæftende celler.
For at verificere, at de TIC betingelser berige for celler med stamcelle markører flowcytometri analyse blev udført ved anvendelse af to almindelige markører for æggestokkene TIC - CD133 expression og ALDH aktivitet. Dot plots vist i figur 2 A fremhæve den øgede andel af CD133 + celler i lav vedhæftning, serum-fri betingelser. Tilsvarende aktiviteten af ALDH enzym er højere i disse betingelser i forhold til traditionelle adhærente dyrkningsbetingelser. Selv om de traditionelle klæbende kulturer indeholder CD133 + celler, de procentvise stigninger under betingelser, der forbedrer klumpformet formation. Analyse af en pluripotens markør, TRA-1-60, giver yderligere støtte, at de TIC betingelser berige for tics, Figur 2 B. Kvantificering i figur 2 C viser, at dobbelt positive (CD133 + ALDH +) ACI-23 celler i høj grad er begrænset til kulturer dyrket under TIC øger betingelser. Ændringer i proteinniveauer i forskellige transkriptionelle faktorer, der forekommer i ACI-23-celler efter fem dages dyrkning i TIC forhold blev også undersøgt. En progressiv stigning i hver af markørens ses fra traditionelle til floater TIC vilkår i forhold til de relativt lave niveau i den vedhængende kultur, figur 2 D. Interessant en human ascites cellelinie dyrkes i de forskellige betingelser viser den højeste markør fænotype under de traditionelle TIC betingelser med ringe til ingen farvning stede i flyderen TIC betingelser, figur 2 E.
Tumorigeniciteten af dyrkningsbetingelser TIC blev valideret ved subkutane injektioner af et lige antal af levedygtige celler opnået fra alle forhold i kohorter af athymiske nøgne mus. Figur 3 viser, at ACI-23 (A, B) og OVCAR-5 (C) celler fra traditionelle klæbende kulturer var mindre tumorigen end dem fra de TIC kulturer. Bemærk, at flyderen TIC kulturer produceret større tumorer i en kortere periode end de traditionelle klæbende eller traditionelle TIC kulturer. Disse data tyder på, at selv med en beskeden stigning i æggestokkene TIC markører, er der en dramatisk fænotypisk ændring. Men med andre cellelinjer (ikke vist) de traditionelle TIC kulturer var mere tumorigene end de traditionelle adhærente og floater TIC kultur celler.
Figur 1. Sfæroide udvikling i forskellige dyrkningsbetingelser. (A) Nedsat æggestokkene cancercellelinier (ACI-23, OVCAR-5 og Caov3) og primære patient-afledt ascitesceller (TGS-3) dyrket i lav tilknytning kolber med serumfrit stamcelle medier let danne multicellulære sfæroider. Billederne viser de traditionelle klæbende dyrkningsbetingelser opretholde epitelial brosten morfologi i ACI-23, OVCAR-5, Caov3 og TGS-3-celler, hvorimod de samme celler dannede kugler inden 96 timer i TIC forhold. Scale bar 100 pm. (B) Efter 24 timers udsættelsetraditionelle adhærente dyrkningsbetingelser TIC kultur morfologier vise en differentieret fænotype ligner den oprindelige adhærente morfologi. Scale bar 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Low-fastgørelse, serumfrie betingelser berige for celler med TIC markører. (A) Flowcytometrianalyse af ACI-23 celler under anvendelse af APC-konjugeret CD133-antistof viser en forøget procentdel af CD133 + celler i lav tilknytning kolber med serumfrit stamceller celle medier. Flowcytometri-analyse under anvendelse Aldefluor assay shows øget ALDH aktivitet i celler dyrket i lav tilknytning kolber med serumfrit stamcelle medier. CD133 negative kontrol indeholder intet antistof og ALDH negative control er det aktiverede substrat i nærværelse af ALDH inhibitor (DEAB). (B) Analyse ved hjælp af FITC-konjugeret TRA-1-60 antistof viser højeste procentdel af TRA-1-60 + celler i flyderen TIC forhold i ACI-23-celler. Negativ kontrol indeholder intet antistof. (C) CD133 + ALDH + -celler er højest i traditionel TIC og flyderen TIC betingelser i ACI-23 cellelinien. Error bars: SEM, n = 6, * p <0,05. (D) Western-blot-analyse, der viser stigningen i proteinniveauer transkriptionelle markører for stamceller i ACI-23 celler dyrket i TIC betingelser i 5 dage. Hele cellelysater (50 ug) blev analyseret med GAPDH som loading kontrol. (E) Repræsentative dot plots af TGS-3 primære ascites analyserede celler som i A. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Low-fastgørelse, serumfrie betingelser berige for celler med forøget tumorgenicitet. (A) 5 x 10 5 levedygtige ACI-23-celler blev injiceret subkutant i athymiske nøgne mus i tre eksemplarer. Mus blev vejet og tumorer målt ved caliper to gange ugentligt. A = Traditionel klæbende kultur, F = Floater TIC kultur, S = Traditional TIC kultur. * P <0,05. (B) Repræsentative billeder af tumorer dannet af ACI-23 efter 25 dage ved hjælp celler dyrket under forskellige dyrkningsbetingelser. (C) 5 x 10 5 levedygtige OVCAR-5-celler blev subkutant injiceret i athymiske nøgne mus i tre eksemplarer og overvåget som i A. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Den her beskrevne protokol udgør en effektiv og konsekvent metode til at berige kulturer for celler med stamcelle funktioner fra etablerede æggestokkene cancercellelinjer og gælder for patientprøver primære. Denne fremgangsmåde med succes beriger af tics over en række forskellige cellelinjer. Det giver mulighed for rettidig identifikation af forhold, der beriger en TIC og / eller tumorigen fænotype, uden at tage tid til fysisk at sortere tics fra i befolkningen ikke-TIC. På denne måde kan de relative niveauer af de forskellige signalveje skal vurderes for deres bidrag til TIC fænotype ved at sammenligne traditionelle adhærente kulturer tic kulturer ved hjælp af forskellige funktionelle assays. Hvis der ønskes en ren TIC befolkning, kan isolation nemt opnås ved at inkorporere et fluorescens-assisteret eller magnetisk sortering trin i flowcytometri protokollen.
Det er vigtigt at huske på, dog, at ekspressionen af TIC markørs, såsom CD133, CD44, eller ALDH, kan variere blandt cellelinjer eller patientprøver selv af samme tumortype. For eksempel fandt vi, at OVCAR-5-celler har højere ekspression af CD44 i forhold til CD133, hvorimod det omvendte er tilfældet for ACI-23. Det er derfor relevant at påberåbe sig tumor initiering i mus og flowcytometri analyse som endelige for TIC tilstedeværelse. Efter denne protokol, blev høj ALDH aktivitet konsekvent observeret, når ovariecancerceller blev dyrket i stamcelle forhold. Interessant, CD133 ekspressionen er konsekvent højere i ACI 23-celler dyrket i traditionelle TIC dyrkningsbetingelser, mens ALDH er højest i floater TIC forhold. I modsætning til TGS-3 primære ascites celler vise en lille stigning i CD133 positivitet under floater TIC forhold, men en bemærkelsesværdig stigning i ALDH aktivitet under traditionelle TIC forhold. Disse resultater fremhæve heterogenitet ovariecancerceller og plasticitet ofte forbundet med TIC. For yderligere at understøtte CLAim, at disse metoder forbedre tics, blev berigelsen af TRA-1-60 positive celler også observeret. TRA-1-60 er en pluripotens markør og er blevet anvendt til at identificere embryonale carcinomer i æggestokkene og testiklerne samt prostatacancer TICS 30-32. Selv om vores metoder har haft succes med mange cellelinjer, er det muligt, at de standard TIC betingelser kan være bedre egnet til nogle ovariecancerceller, mens de modificerede floater betingelser bedre berige af tics i andre ovariecancercelle populationer. Dette understreger igen det forventede heterogenitet inden for både patient-afledte og etablerede æggestokkene cancercellelinjer.
Udover celleoverflademarkører der flere transkriptionelle faktorer, der har vist sig at karakterisere ovariecancer TIC herunder Nanog, Sox2, Oct-4 11, selv om disse markører er ikke specifikke for kræft i æggestokkene TIC og snarere repræsenterer faktorer er vigtige for embryonale stamceller pluripotens og DIFrentiering 33,34. Vi undersøgte ændringerne i protein niveauer af disse faktorer og fandt, at Nanog stiger i TIC dyrkningsbetingelser efter aftale med andre 13,35 samt CD133, TRA-1-60, og CD117. En menneskelige stamceller markør cDNA-array yderligere viste en stigning i CD133, Nanog, Melk, og PODXL generne i TIC betingelser i forhold til traditionelle vedhængende forhold. Det er vigtigt, skal det bemærkes, at som med celleoverflademarkører, transkriptionelle faktorer forbundet med ovarie TIC kan variere blandt cellelinjer og patientprøver.
Vi har observeret, at celler kan være mere tumorigene og udtrykker højere niveauer af stamceller markører, hvis de er i sagens natur ikke-klæbende in vitro (dvs. flydende celler, som ikke let fastgøres til en klæbende plade). I kultur, cellelinjer, såsom ACI-23 har typisk mange levedygtige flydende celler og / eller celler, der vokser lodret i en stabling mode under traditionelle kultur conditioner. Selvom vellykket berigelse tics fra flydende celler og aggregater kan være gældende for relativt få cellelinier herunder i nærværende undersøgelse og OVCAR-3 12, vores resultater tyder på dette kunne være et mere tumorigen befolkning. Derfor høst af "flydende" population af celler dyrket i standard vævskulturplader og medier kan tjene som en alternativ fremgangsmåde til TIC berigelse for celler, der tilpasser dårligt kommerciel stamcelle medier.
Anvendelse af de forskellige dyrkningsmetoder præsenteret i dette manuskript vil muliggøre hurtig berigelse af TIC befolkninger og en bedre forståelse af, hvilke faktorer støtter denne fænotype i forskellige celler. Aktuelle anvendelser af denne fremgangsmåde indbefatter kendetegnende som signalveje er afgørende for at støtte spredning af denne unikke population af celler. Resultaterne fra disse undersøgelser vil bidrage til at klarlægge mekanismer tumor progression og tilbagefald.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
| Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
| CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
| Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
| Epidermal Growth Factor - human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
| DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | |
| Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning Cellgro | 25-056-CI | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (heat inactivated) | Gemini | 100-106 | |
| Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) | Nalgene | 450-0045 | |
| 15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
| 50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |
References
- Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
- Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
- Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
- King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
- Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
- Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
- Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
- Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
- Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
- Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
- Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
- Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
- Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
- Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
- McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
- Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. , (2014).
- Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
- Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
- Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
- Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
- Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
- Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
- Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
- Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).
