Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
Kræft i æggestokkene er den mest dødbringende gynækologisk malignitet i USA med den største årsag til sygelighed og dødelighed er de stærkt tilbagevendende, kemoterapi funktioner i denne sygdom. Primær behandling omfatter sædvanligvis maksimal cytoreduktiv kirurgi og efterfølgende platinbaseret behandling, selv om der er nogle tegn på, neoadjuverende terapi kan være gavnligt i nogle tilfælde 1. De fleste patienter reagerer positivt på primær behandling, men desværre halvdel vil tilbagefald inden for 18 måneder 2.
Mest æggestokkene maligniteter er epitel carcinomer og kan stamme i overfladen epitel i æggestokkene eller æggeleder 3,4. Flere undersøgelser støtter eksistensen af somatiske stamceller i det kvindelige reproduktive system, der formentlig hjælpe med vævsreparation, der er nødvendig efter ægløsning 5,6. Den høje proliferative aktivitet på både ovarie- og æggelederen under ovulation kan være en vigtig faktor i udviklingen af kræft i æggestokkene (Gharwan, et al. manuskript indsendt). Udledningen af tumor-dannende celler er uklar, men de kan stamme fra normale stamceller, stamceller eller differentierede celler gennem mutationer, som gør dem ude af stand til at regulere division eller skæbne. Er også blevet betegnet Disse celler "cancer stamceller," eller "kræft-initierende celler", og kan vokse ind tumorigene, flercellede spheroids under lave vedhæftet fil. Selv om den hierarkiske model af TIC udvikling kan være dynamisk, behøver TIC deler mange af de samme funktioner som normale stamceller, herunder ubevægelighed, modstandsdygtighed over for kemoterapi, langsigtet selvfornyelse og evnen til at differentiere til forskellige celleafstamninger 7,8.
Flere undersøgelser støtte forekomsten af tics hos ovariecancer og nuværende bestræbelser i gang for at klarlægge mekanismen (er), hvorved disse celler understøtter tumorigenesis 9-11. Adskillige markører er blevet foreslået at identificere æggestokkene TIC med forøget tumorgenicitet herunder CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, og MyD88, selv om den nøjagtige bidrag af hver markør er uklar og kan være celletypespecifik 11-16. Mens en universel markør eller et sæt af markører ikke er entydigt fastlagt for ovariale tics, har forskellige grupper isoleret æggestokkene TIC mere almindeligt ved at selektere for CD44 +, CD133 + og / eller celler med høj aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet 13,17-21. CD44 er et transmembrant glycoprotein, der virker som en receptor for hyaluronsyre og regulerer flere processer vigtige for tumorudvikling, herunder adhæsion, proliferation, migration, angiogenese og differentiering 22. CD133 er et transmembrant glycoprotein, hvis funktion er stadig uklart, men undersøgelser tyder det organiserer plasmamembran topologi 23. ALDH, et intracellulært enzym, som katalyserer oxidationen af aldehyder, kan være den mest universal markør tics som høj aktivitet er blevet identificeret i stamceller isoleret fra en række forskellige væv og flere roller er blevet tilskrevet ALDH at støtte normale stamceller og TIC 24. Hvad nu, CD133 og ALDH1 synes at være de mest reproducerbare markører for æggestokkene TIC 13,21.
Ud over at forstå karakteristika tics, er der også en stor indsats for at identificere lægemidler, som specifikt er målrettet mod denne subpopulation. Den høje tilbagefald sats forbundet med kræft i æggestokkene kan skyldes svigt af de nuværende kemoterapier at kunne udrydde TIC. Selv om størstedelen af tumoren er modtagelig for eksisterende behandlinger er TIC menes at være resistente og ved en densitet påvises ved standardmetoder. Belyse resistensmekanismer terapi og tumor tilbagefald er afgørende for at forbedre respons og samlet overlevelse satser for patienter med kræft i æggestokkene.
Her er dyrkningsteknikker beskrevet thpå berige af tics fra etablerede og primær ovariecancer cellelinjer. De dyrkningsbetingelser beskrevet heri er blevet anvendt af flere grupper til at fremkalde formering af tics eller kugleformede celler med stamcelle kvaliteter 11,12,14,16,20. Selv om der er flere stamceller kultur medier og kosttilskud, der almindeligvis anvendes til berigelse af TIC / sfæroider anvendte vi et serumfrit medie formel med EGF og FGF, men uden tilsætning af B27 eller N-2 kosttilskud. Disse kosttilskud, der almindeligvis anvendes til neuronal cellekultur og berigende for stamceller, har vist sig at fremme en mesenchymal fænotype 25,26 og der fortsat en vis usikkerhed på området, om TIC har en mesenchymal eller epiteliale fænotype er mere tumorigene 27-29 . For at minimere usikkerheder og variabler, vi har valgt for at bruge de mest almindelige formel, da vi har at gøre med epitelial kræft i æggestokkene celler.
Fastholdelse celler i serumfrie medier i en lav vedhæftning kolbeletter klumpformet dannelse og støtter udbredelsen af celler med CD133 udtryk og høj ALDH aktivitet. Vores arbejde har endvidere vist, at celler flyder under normale vedhængende forhold også kan repræsentere en mere tumorigen TIC befolkning. Injektion af celler dyrket under disse betingelser i athymiske nøgne mus fører til højere tumorigent potentiale sammenlignet med celler dyrket i tilknyttede betingelser i nærvær af serum. Meget information vedrørende rollen tics i ovariecancer initiering, progression, terapeutisk respons og sygdomstilbagefald kan opnås ved anvendelse af disse teknikker.
Den her beskrevne protokol udgør en effektiv og konsekvent metode til at berige kulturer for celler med stamcelle funktioner fra etablerede æggestokkene cancercellelinjer og gælder for patientprøver primære. Denne fremgangsmåde med succes beriger af tics over en række forskellige cellelinjer. Det giver mulighed for rettidig identifikation af forhold, der beriger en TIC og / eller tumorigen fænotype, uden at tage tid til fysisk at sortere tics fra i befolkningen ikke-TIC. På denne måde kan de relative niveauer af de forskellige signalveje skal vurderes for deres bidrag til TIC fænotype ved at sammenligne traditionelle adhærente kulturer tic kulturer ved hjælp af forskellige funktionelle assays. Hvis der ønskes en ren TIC befolkning, kan isolation nemt opnås ved at inkorporere et fluorescens-assisteret eller magnetisk sortering trin i flowcytometri protokollen.
Det er vigtigt at huske på, dog, at ekspressionen af TIC markørs, såsom CD133, CD44, eller ALDH, kan variere blandt cellelinjer eller patientprøver selv af samme tumortype. For eksempel fandt vi, at OVCAR-5-celler har højere ekspression af CD44 i forhold til CD133, hvorimod det omvendte er tilfældet for ACI-23. Det er derfor relevant at påberåbe sig tumor initiering i mus og flowcytometri analyse som endelige for TIC tilstedeværelse. Efter denne protokol, blev høj ALDH aktivitet konsekvent observeret, når ovariecancerceller blev dyrket i stamcelle forhold. Interessant, CD133 ekspressionen er konsekvent højere i ACI 23-celler dyrket i traditionelle TIC dyrkningsbetingelser, mens ALDH er højest i floater TIC forhold. I modsætning til TGS-3 primære ascites celler vise en lille stigning i CD133 positivitet under floater TIC forhold, men en bemærkelsesværdig stigning i ALDH aktivitet under traditionelle TIC forhold. Disse resultater fremhæve heterogenitet ovariecancerceller og plasticitet ofte forbundet med TIC. For yderligere at understøtte CLAim, at disse metoder forbedre tics, blev berigelsen af TRA-1-60 positive celler også observeret. TRA-1-60 er en pluripotens markør og er blevet anvendt til at identificere embryonale carcinomer i æggestokkene og testiklerne samt prostatacancer TICS 30-32. Selv om vores metoder har haft succes med mange cellelinjer, er det muligt, at de standard TIC betingelser kan være bedre egnet til nogle ovariecancerceller, mens de modificerede floater betingelser bedre berige af tics i andre ovariecancercelle populationer. Dette understreger igen det forventede heterogenitet inden for både patient-afledte og etablerede æggestokkene cancercellelinjer.
Udover celleoverflademarkører der flere transkriptionelle faktorer, der har vist sig at karakterisere ovariecancer TIC herunder Nanog, Sox2, Oct-4 11, selv om disse markører er ikke specifikke for kræft i æggestokkene TIC og snarere repræsenterer faktorer er vigtige for embryonale stamceller pluripotens og DIFrentiering 33,34. Vi undersøgte ændringerne i protein niveauer af disse faktorer og fandt, at Nanog stiger i TIC dyrkningsbetingelser efter aftale med andre 13,35 samt CD133, TRA-1-60, og CD117. En menneskelige stamceller markør cDNA-array yderligere viste en stigning i CD133, Nanog, Melk, og PODXL generne i TIC betingelser i forhold til traditionelle vedhængende forhold. Det er vigtigt, skal det bemærkes, at som med celleoverflademarkører, transkriptionelle faktorer forbundet med ovarie TIC kan variere blandt cellelinjer og patientprøver.
Vi har observeret, at celler kan være mere tumorigene og udtrykker højere niveauer af stamceller markører, hvis de er i sagens natur ikke-klæbende in vitro (dvs. flydende celler, som ikke let fastgøres til en klæbende plade). I kultur, cellelinjer, såsom ACI-23 har typisk mange levedygtige flydende celler og / eller celler, der vokser lodret i en stabling mode under traditionelle kultur conditioner. Selvom vellykket berigelse tics fra flydende celler og aggregater kan være gældende for relativt få cellelinier herunder i nærværende undersøgelse og OVCAR-3 12, vores resultater tyder på dette kunne være et mere tumorigen befolkning. Derfor høst af "flydende" population af celler dyrket i standard vævskulturplader og medier kan tjene som en alternativ fremgangsmåde til TIC berigelse for celler, der tilpasser dårligt kommerciel stamcelle medier.
Anvendelse af de forskellige dyrkningsmetoder præsenteret i dette manuskript vil muliggøre hurtig berigelse af TIC befolkninger og en bedre forståelse af, hvilke faktorer støtter denne fænotype i forskellige celler. Aktuelle anvendelser af denne fremgangsmåde indbefatter kendetegnende som signalveje er afgørende for at støtte spredning af denne unikke population af celler. Resultaterne fra disse undersøgelser vil bidrage til at klarlægge mekanismer tumor progression og tilbagefald.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |