Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
Äggstockscancer är den mest dödliga gynekologisk malignitet i USA med den största orsaken till sjuklighet och dödlighet är de mycket återkommande, kemoterapiresistent funktioner i denna sjukdom. Primär behandling består ofta svårast cytoreduktiv kirurgi och efterföljande platinabaserad terapi, även om det finns vissa tecken som tyder på neoadjuvant terapi kan vara till nytta i vissa fall en. Majoriteten av patienterna svarar positivt på primär behandling, men tyvärr hälften kommer återfall inom 18 månader 2.
De flesta äggstocks maligniteter är epiteliala karcinom och kan ha sitt ursprung i ytan epitel i äggstockarna eller äggledaren 3,4. Flera studier stödja förekomsten av somatiska stamceller i det kvinnliga reproduktiva systemet som förmodligen hjälpa till vävnadsreparation som behövs efter ägglossningen 5,6. Den höga proliferativ aktivitet vid både äggstocken och äggledaren under ovulation kan vara en viktig faktor i utvecklingen av äggstockscancer (Gharwan, et al. manuskript inlämnat). Härledningen av tumörbildande celler är oklar, men de kan uppstå från normala stamceller, progenitorceller, eller differentierade celler genom mutationer som gör dem oförmögna att reglera division eller ödet. Dessa celler har också benämnts "cancerstamceller," eller "cancer-initierande celler", och kan växa in tumörogena, flercelliga sfäroider under låga anslutningsvillkor. Även om den hierarkiska modellen för TIC utveckling kan vara dynamisk, gör TIC delar många av samma funktioner som vanliga stamceller inklusive inaktivitet, resistens mot kemoterapi, långsiktiga självförnyelse och förmåga att differentiera till olika cell härstamningar 7,8.
Flera studier stödja förekomsten av TIC i äggstockscancer och nuvarande insatser pågår för att klargöra mekanismen (s) med vilken dessa celler stöder tumorigenes 9-11. Flera markörer har föreslagits för att identifiera äggstocks TIC med förbättrad tumorigenicitet inklusive CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, och MyD88, även om den exakta bidraget från varje markör är oklar och kan vara celltyp specifik 11-16. Medan en universell markör eller en uppsättning markörer har inte entydigt fastställts för äggstocks TIC, har olika grupper isolerade äggstock TIC oftare genom att välja för CD44 +, CD133 + och / eller celler med hög aldehyddehydrogenas (ALDH) aktivitet 13,17-21. CD44 är ett transmembrant glykoprotein som fungerar som en receptor för hyaluronsyra och reglerar flera processer som är viktiga för tumörprogression, inklusive adhesion, proliferation, migrering, angiogenes och differentiering 22. CD133 är en transmembranglykoprotein vars funktion är fortfarande oklart, men studier tyder det organiserar plasmamembranet topologi 23. ALDH, en intracellulär enzym som katalyserar oxidationen av aldehyder, kan vara den mest universal markör för TIC som hög aktivitet har identifierats i stamceller isolerade från en mängd olika vävnader och flera roller har tillskrivits ALDH stödja normala stamceller och TIC 24. Från och med nu, CD133 och ALDH1 verkar vara de mest reproducerbara markörer för äggstocks TIC 13,21.
Förutom att förstå egenskaperna hos TIC, det finns också en stor insats för att identifiera läkemedel som specifikt riktar denna subpopulation. Den höga återfallsfrekvens i samband med äggstockscancer kan bero på fel i nuvarande kemoterapi att framgångsrikt utrota TIC. Fastän huvuddelen av tumören är känslig för existerande terapier, är TIC tros vara resistent och vid en densitet odetekterbar genom standardmetoder. Belysa mekanismer för terapiresistens och tumör återfall är avgörande för att förbättra svar och den totala överlevnaden hos patienter med äggstockscancer.
Här är odlingstekniker beskrivs thpå anrika TIC från etablerade och primära äggstockscancer cellinjer. De odlingsbetingelser som beskrivs häri har använts av flera grupper för att inducera förökning av tics eller sfäroida celler med stamcells kvaliteter 11,12,14,16,20. Även om det finns flera stam cellodlingsmedier och kosttillskott som vanligen används för att berika TIC / sfäroider vi använde ett serumfritt medium formel med EGF och FGF, men utan tillsats av B27 eller N-2-tillskott. Dessa tillägg, som vanligen används för neuronal cellodling och berikande för stamceller, har visat sig främja en mesenkymala fenotyp 25,26 och det återstår en viss osäkerhet när det gäller huruvida TIC har en mesenkymala eller epiteliala fenotyp är mer tumörogen 27-29 . För att minimera osäkerheter och variabler vi valt att använda det vanligaste formel, eftersom vi har att göra med äggstockscancerceller.
Underhålla celler i serumfritt medium i en låg fäst kolvunderlättar sfäroid formation och stöder spridning av celler med CD133 uttryck och hög ALDH aktivitet. Vårt arbete har vidare visat att celler flytande under normala vidhäftande förhållanden också kan representera en mer tumörframkallande TIC befolkningen. Injektion av celler odlade under dessa förhållanden i atymiska nakna möss leder till högre tumörogen potential jämfört med celler odlade i bifogade betingelser i närvaro av serum. Mycket information om vilken roll TIC i äggstockscancer initiering, progression, terapeutiskt svar, och återfall kan vinnas genom användning av dessa tekniker.
Protokollet som beskrivs här utgör ett effektivt och konsekvent metod för anrikning kulturer i celler med stamcells funktioner från etablerade äggstockscancercellinjer och gäller primära patientprover. Denna metod framgångsrikt berikar för TIC inom en rad cellinjer. Det gör för att i tid identifiera förutsättningar som berikar en TIC och / eller tumörogen fenotyp, utan att ta tid att fysiskt sortera tics från icke-TIC inom befolkningen. På detta sätt kan relativa nivåer av olika signalvägar bedömas för deras bidrag till TIC fenotypen genom att jämföra traditionella vidhäftande kulturer att tic kulturer med hjälp av olika funktionella analyser. Om en ren TIC befolkning önskas, kan isoleringen lätt uppnås genom att införliva en fluorescens-assisterad eller magnetisk sortering steg i flödescytometri protokollet.
Det är viktigt att ha i åtanke är dock att uttrycket av TIC markörs, såsom CD133, CD44, eller ALDH, kan variera mellan cellinjer eller patientprover även av samma tumörtyp. Exempelvis fann vi att de OVCAR-5-celler har högre uttryck av CD44 i förhållande till CD133, medan det omvända är sant för ACI-23. Det är därför relevant att åberopa tumörinitiering hos möss och flödescytometri analys som definitiv i TIC närvaro. Efter detta protokoll, var hög ALDH aktivitet konsekvent observerats när äggstockscancerceller odlades i stamcellsförhållanden. Intressant är CD133 uttryck genomgående högre i ACI-23 celler som odlas i traditionella TIC odlingsbetingelser, medan ALDH är högst i flottar TIC förhållanden. Däremot de TGS-3 primära ascites celler visar en liten ökning av CD133 positivitet i flottar TIC förhållanden, men en anmärkningsvärd ökning av ALDH verksamhet enligt traditionella TIC förhållanden. Dessa fynd belysa heterogenitet äggstockscancerceller och plasticitet som vanligen förknippas med TIC. För att ytterligare stödja claim att dessa metoder förbättrar muskelryckningar, anrikning av TRA-1-60 positiva celler observerades också. TRA-1-60 är en pluripotens markör och har använts för att identifiera embryonala karcinom i äggstocken och testiklar samt prostatacancer TICS 30-32. Även våra metoder har varit framgångsrika med många cellinjer, är det möjligt att standard TIC förhållanden kan vara bättre lämpade för vissa äggstockscancerceller, medan de modifierade floater förhållandena bättre anrika TIC i andra äggstockscancer cellpopulationer. Detta understryker återigen den förväntade heterogeniteten inom både patient härledda och etablerade äggstockscancer cellinjer.
Förutom cellytmarkörer finns det flera transkriptionsfaktorer som har visat att karakterisera äggstockscancer TIC inklusive Nanog, Sox2, Oct-4 11, även om dessa markörer är inte specifika för äggstockscancer tics och snarare utgör faktorer som är viktiga för embryonala stamceller pluripotens och difpassad 33,34. Vi undersökte förändringar i proteinnivåer av dessa faktorer och fann att nanog nivåerna ökar i TIC odlingsbetingelser, i samförstånd med andra 13,35 samt CD133, TRA-1-60, och CD117. En mänskliga stamceller markör cDNA array visade vidare en ökning av CD133, nanog, Melk och PODXL gener i TIC villkor jämfört med traditionella vidhäftande förhållanden. Viktigt bör det noteras att, såsom med cellytmarkörer, kan transkriptions faktorer associerade med äggstocks TIC variera mellan cellinjer och patientprover.
Vi har observerat att cellerna kan vara mer tumörogen och uttrycka högre nivåer av markörer stamceller om de är till sin natur icke-vidhäftande in vitro (dvs flytande celler som inte lätt fäster en vidhäftande platta). I kultur, cellinjer såsom ACI-23 har typiskt många livsdugliga flytande celler och / eller celler som växer vertikalt i en stapling sätt under traditionell kultur conditjoner. Även framgångsrika anrikning av TIC från flytande celler och aggregat kan vara tillämpliga på relativt få cellinjer inklusive de i denna studie och OVCAR-3 12, föreslår våra resultat kan detta utgöra en mer tumörogen befolkning. Därför, skörd av "flytande" population av celler odlade i standardvävnadsodlingsplattor och media kan tjäna som en alternativ metod för TIC anrikning, för celler som anpassar dåligt på kommersiell stamcellsmedier.
Användning av de olika odlingsmetoder som presenteras i detta manuskript kommer att möjliggöra snabb anrikning av TIC befolkningar och en bättre förståelse för vilka faktorer stödja denna fenotyp i olika celler. Aktuella tillämpningar av denna metod är bland annat kännetecknande som signalvägar är viktigt att stödja spridning av denna unika population av celler. Resultat från dessa studier kommer att bidra till att klargöra mekanismerna för tumörprogression och återfall.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |