Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
Yumurtalık kanseri morbidite ve mortalite bu hastalığın son derece tekrarlayan, Kemoterapiye dirençli özellikleri olmanın en önemli nedeni ile ABD'de en ölümcül jinekolojik malignitedir. Bazı durumlarda 1 yararlı olabilir neoadjuvan tedavi önermek için bazı kanıtlar olmasına rağmen, birincil tedavi genellikle, maksimal sitoredüktif cerrahi ve sonraki platin bazlı tedavi içermektedir. Hastaların çoğunluğu birincil tedaviye olumlu yanıt, ama ne yazık ki yarım 18 ay 2 içinde nüks edecektir.
En over maligniteler epitel karsinomlar ve yumurtalık veya fallop tüpü 3,4 yüzey epitel kaynaklanabilir. Çeşitli çalışmalar muhtemelen yumurtlama 5,6 aşağıdaki gerekli doku tamirinde yardımcı kadın üreme sistemindeki somatik kök hücrelerin varlığını desteklemektedir. ovul sırasında yumurtalık ve fallop tüpü hem de yüksek proliferatif aktivitetirme (. Gharwan, vd gönderilen yazının) yumurtalık kanseri gelişiminde önemli bir faktör olabilir. tümör oluşturucu hücre türetme belirsizdir fakat bölme kaderlerini veya düzenlemek için mümkün hale getirilmek mutasyonlar yoluyla normal kök hücreleri, projenitör hücreler ya da farklılaşmış hücrelerden ortaya çıkabilir. Bu hücreler aynı zamanda, "kanser hücrelerini başlatan" "kanser kök hücrelerini," ya adlandırılır ve düşük bağlanma koşullarında tümörijenik, çok hücreli sferoitler dönüşebilir. TIC gelişme hiyerarşik modeli dinamik olabilir, ancak TIC kemoterapi, uzun vadeli kendini yenileme ve çeşitli hücre soyları 7,8 içine ayırt yeteneği sükunet, direniş de dahil olmak üzere, normal kök hücrelerin aynı özellikleri birçok paylaşmak yoktur.
Çeşitli çalışmalar, yumurtalık kanserinde tikler varlığını destekleyen ve mevcut çabaları bu hücreler tümör oluşumu 9-11 destekleyen hangi mekanizma (lar) netleştirmek için çalışmalar devam etmektedir. Her bir belirtecin tam katkı belirsizdir ve 11-16 belirli bir hücre tipi olabilir, ancak bazı belirteçler, CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, ve MyD88 dahil olmak üzere gelişmiş tümöre neden olan yumurtalık tikler tanımlamak için önerilmiştir. Evrensel işaretleyici veya belirteçlerin set tümden yumurtalık tikler için kurulmuş olsa da, farklı gruplar yüksek aldehit dehidrogenaz (ALDH) aktivite 13,17-21 ile CD44 +, için CD133 + ve / veya hücreleri seçerek daha sık yumurtalık tikler izole var. CD44 hiyalüronik asit için bir reseptör olarak görev yapar ve yapışma, çoğalma, göç, anjiyojenez ve farklılaşma 22 de dahil olmak üzere tümör ilerlemesi için önemli olan pek çok işlemleri düzenleyen bir zar glikoproteinidir. CD133 olan işlevi henüz belli değil, ancak çalışmalar plazma zarı topoloji 23 organize önermek bir transmembran glikoproteindir. ALDH, aldehitlerin oksidasyonu kataliz eden bir hücre içi enzim, en univers olabiliryüksek etkinlik olarak tikler el işareti, normal kök hücrelerinin ve tiklerin 24 desteklemede ALDH atfedilen doku ve çoklu rolleri çeşitli izole kök hücre tespit edilmiştir. Şu an itibariyle, CD133 ve ALDH1 over tikler 13,21 en tekrarlanabilir belirteçleri olarak görünür.
Tikler özelliklerini anlamak için ek olarak, özellikle bu alt popülasyonunu hedef ilaçların belirlenmesi için büyük bir çaba vardır. yumurtalık kanseri ile ilişkili yüksek nüks oranı başarıyla tikleri ortadan kaldırmak için mevcut kemoterapi yetmezliğine bağlı olabilir. Tümör kitlesinin mevcut tedavilere karşı duyarlı olmakla birlikte, TIC dayanıklı ve standart metodları ile tespit edilemez bir yoğunlukta olduğu düşünülmektedir. Terapi direnci ve tümör nüks açıklık mekanizmaları yanıtı ve yumurtalık kanseri olan hastalarda genel sağkalım oranlarını artırmak için hayati öneme sahiptir.
Burada, kültür teknikleri inci açıklanmıştırkurulan ve primer over kanseri hücre hatları tikler için zenginleştirmek. Burada tarif edilen kültür koşulları kök hücre nitelikleri 11,12,14,16,20 tik veya küremsi hücrelerinin çoğalmasını uyarmak için birden fazla grup ile kullanılmıştır. Yaygın Tikler zenginleştirilmesi için kullanılan birçok kök hücre kültürü ortamlarının ve ek olmasına rağmen / sferoidler biz EGF ve FGF ile bir serumsuz ortam formül kullanılır, ancak B27 ya da N-2 ek eklenmeden. Yaygın nöronal hücre kültürü ve kök hücreleri için zenginleştirici için kullanılan bu takviyeleri, bir mezenkimal fenotip 25,26 teşvik gösterilen ve bir mezenkimal veya epitel fenotipe sahip TIC daha tümörijenik olup olmadığı konusunda bazı belirsizlik kalır edilmiş 27-29 . Belirsizlikleri ve değişkenleri en aza indirmek için biz epitel yumurtalık kanseri hücreleri ile ilgileniyor çünkü, en yaygın formülü kullanmak için seçti.
Düşük bağlanma şişede serumsuz ortam içinde hücrelerin bakımıküremsi oluşumunu kolaylaştıran ve CD133 ekspresyon ve yüksek ALDH aktivitesinin hücrelerin yayılmasını destekler. Çalışmalarımız ayrıca normal yapışık şartlar altında yüzen hücreler de daha tümörijenik TIC nüfusu temsil edebilir olduğunu gösterdi. Atimik çıplak farelere, bu koşullarda çoğalan hücreler tarafından enjeksiyon serumu varlığında bağlı koşullarda yetiştirilen hücreler ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir tümörijenik potansiyeline yol açar. Yumurtalık kanseri başlaması, ilerlemesi, terapötik yanıt ve hastalık nüks içinde tikler rolü ile ilgili çok fazla bilgi bu tekniklerin kullanımı yoluyla elde edilebilir.
Burada açıklanan protokol kurulan yumurtalık kanseri hücre çizgileri ile ilgili kök hücre özellikleri olan hücreler için kültür zenginleştirmek için etkin ve tutarlı bir yöntem sunulur ve birinci hasta numuneleri için de geçerlidir. Bu yöntem, başarılı bir şekilde hücre çizgileri, çeşitli boyunca tikler için zenginleştirir. Bu fiziksel nüfus içinde olmayan tikler gelen tikleri sıralamak için zaman ayırdığınız olmadan TIC ve / veya tümörijenik fenotip zenginleştirmek koşulları zamanında tanımlanması için izin verir. Bu şekilde, farklı sinyal yollarının nispi seviyeleri, fonksiyonel analizlerin kullanarak çeşitli kültürler tlc geleneksel yapışkan kültürler karşılaştırarak TIC fenotipe katkıları için değerlendirilebilir. Saf TIC nüfus isteniyorsa, izolasyon kolaylıkla protokol akış sitometrisi bir floresan yardımlı veya manyetik ayırma adımı dahil edilmesi ile elde edilebilir.
Ancak, akılda tutmak önemlidir TIC marker ifadesiBöyle CD133, CD44, ya da ALDH gibi s, hücre hatları ve hatta aynı tümör Çeşidi hasta numuneleri arasında değişebilir. Örneğin biz ters ACI-23 için geçerlidir ise OVCAR-5 hücreleri, CD44 CD133 için göreceli yüksek ifadesini sahip olduğu bulundu. Bu farelerde tümör başlatılması güveniyor ve TIC varlığı kesin olarak akış sitometri analizine nedenle ilgili olduğunu. Yumurtalık kanseri hücreleri, kök hücre şartlarda yetiştirildiği zaman bu protokol izlenerek, yüksek ALDH aktivitesinin sürekli gözlenmiştir. ALDH Şamandıra TIC koşullarda en yüksek ise İlginçtir, CD133 ifadesi, geleneksel TIC kültür koşullarında yetiştirilen ACI-23 hücrelerinde sürekli yüksektir. Buna TGS-3 ilköğretim asit hücreleri şamandıra TIC koşullar altında CD133 pozitifliği küçük bir artış, ama geleneksel TIC koşullarında ALDH aktivite belirgin bir artış gösterir. Bu bulgular yumurtalık kanseri hücrelerinin heterojenitesini ve yaygın tikler ile ilişkili plastisite vurgulayın. Ayrıca CLA desteğinebu yöntemler, tikler geliştirmek im, TRA-1-60 pozitif hücrelerin zenginleştirilmesi de gözlenmiştir. TRA-1-60 bir Pluripotency belirtecidir ve prostat kanseri TICS 30-32 gibi embriyonal yumurtalık karsinom ve testisler tanımlamak için kullanılmıştır. Bizim yöntem çok sayıda hücre hatları ile başarılı olmuş olmasına rağmen, bu buluşun tadil edilmiş şamandıra koşullarına daha iyi Diğer yumurtalık kanseri hücre popülasyonlarında tikler zenginleştirmek ise standart TIC koşulları, bazı yumurtalık kanseri hücreleri için daha uygun olabilir mümkündür. Bu da yine, hem hasta türetilmiş ve kurulan yumurtalık kanseri hücre hatları içinde beklenen heterojenliğini altını çiziyor.
Bu belirteçler yumurtalık kanseri tikler özgü değildir ve oldukça embriyonik kök hücre pluripotensin için önemli faktörleri temsil rağmen hücre yüzey belirteçleri ek olarak Nanog, Sox2, Ekim-4 11 olmak üzere yumurtalık kanseri tikleri karakterize gösterilmiştir çeşitli transkripsiyon faktör vardır ve differentiation 33,34. Biz bu faktörlerin protein düzeylerinde değişiklikler incelenmiş ve Nanog düzeyleri diğerlerine 13,35 yanı sıra CD133, TRA-1-60 ve CD117 ile anlaşarak, TIC kültür koşullarında arttığı bulundu. Bir insan kök hücre işaretleyici cDNA dizisi bundan başka, geleneksel yapışkan koşulları ile karşılaştırıldığında TIC koşullarda CD133, Nanog, Melk ve PODXL genlerinde bir artış göstermiştir. Önemli bir şekilde, hücre yüzey belirteçleri ile olduğu gibi, yumurtalık tikler ilişkili transkripsiyon faktörleri, hücre çizgileri ve hasta örnekleri arasında değişebilir, dikkat edilmelidir.
Biz, in vitro olarak doğal olarak yapışkan olmayan ise hücreleri daha tümörijenik olduğu ve kök hücre belirteçlerin daha yüksek seviyelerde olduğunu gözledik (yani, hali hazırda bir yapışkan levha eklemek olmayan hücrelerin yüzer). Kültür, bu tür ACI-23 gibi hücre hatları, genellikle, geleneksel kültür iklimlendirme altında bir istifleme şekilde dikey olarak büyümesi çok uygulanabilir yüzen hücreler ve / veya hücre bilgisiiyonları. Yüzen hücreleri ve agrega gelen tikler başarılı zenginleştirme Bu çalışmada ve OVCAR-3 12 olanlar da dahil olmak üzere oldukça az için geçerli hücre hatları olabilir, ancak bizim bulgular bu daha tümörijenik nüfusu temsil düşündürmektedir. Bu nedenle, ticari bir kök hücre ortamına uyum sağlayamamaktadır hücreleri için, TIC zenginleştirme alternatif bir yöntem olarak hizmet edebilir, standart doku kültür plakaları ve ortam içinde yetiştirilen hücreler "yüzen" nüfus toplanması.
Bu yazıda sunulan farklı kültür yöntemlerinin kullanılması TİC nüfus hızlı zenginleşme ve farklı hücreler bu fenotip destek faktörleri ne daha iyi bir anlayış sağlayacaktır. Bu yöntemin Mevcut uygulamalar sinyal yolları hücre bu eşsiz nüfusun yayılmasını desteklemek için çok önemlidir karakterize edici içerir. Bu çalışmaların sonuçları, tümör ilerlemesi ve nüks mekanizmalarını açıklamak için yardımcı olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |