Supramolekylære hydrogelators baseret på ureidogrupper-pyrimidinoner tillader fuld kontrol over de makroskopiske gel egenskaber og sol-gel switching adfærd ved hjælp af pH. Her præsenterer vi en protokol for at formulere og injektion sådan supramolekylær hydrogelator via et kateter leveringssystem for lokal levering direkte i relevante områder i grisen hjerte.
Regenerering af tabt myocardium er et vigtigt mål for fremtidige behandlinger på grund af den stigende forekomst af kronisk iskæmisk hjertesvigt og den begrænsede adgang til donor hjerter. Et eksempel på en behandling for at genvinde funktionen af hjertet består i lokal levering af lægemidler og bioaktive stoffer fra en hydrogel. I dette papir indføres en metode til at formulere og injicere et stof-loaded hydrogel ikke-invasivt og side-specifikke ind grisen hjerte ved hjælp af en lang, fleksibel kateter. Anvendelsen af 3-D elektromekanisk kortlægning og injektion via et kateter tillader side-specifikke behandling af myokardiet. At tilvejebringe en hydrogel er kompatibel med denne kateter, er en supramolekylær hydrogel anvendes på grund af den bekvemme skift fra en gel til en opløsning tilstand vha miljømæssige udløsere. Ved basisk pH modificeret denne ureido-pyrimidinon poly (ethylenglycol) virker som en Newtonsk væske, der let kan injiceres, men ved fysiologisk pH opløsningen hurtigt skifter inden gel. Disse milde skift betingelser tillader inkorporering af bioaktive stoffer og bioaktive arter, såsom vækstfaktorer og exosomer som vi præsenterer her i både in vitro og in vivo forsøg. In vitro eksperimenter giver en på forparten indikation af stabiliteten gel og lægemiddelfrigivelse, som giver mulighed for tuning af gelen og slip egenskaber inden den efterfølgende anvendelse in vivo. Denne kombination giver mulighed for optimal indstilling af gelen til de anvendte bioaktive forbindelser og arter, og indsprøjtningssystemet.
Selvom behandling af akut myokardieinfarkt er væsentligt forbedret overlevelsesrater, kronisk iskæmisk hjertesvigt er et stort problem for folkesundheden, der skrider frem med en aldrende befolkning. Der er ca. 6 millioner patienter med hjertesvigt i USA med en anslået stigning på 25% i forekomsten i 2030 1,2. Indledende tab af myocardievæv fører til hjerte-remodellering og til sidst forårsager kronisk hjertesvigt. Undtagen for hjertetransplantation, er der ingen reel behandling for denne gruppe patienter. Den stigende mangel på donor hjerter understreger behovet for at udvikle nye tilgængelige behandlinger for at vende denne proces med remodeling. Derfor et mål for fremtidige behandlinger er regenerering af tabt myokardiet.
Hydrogeler er interessante materialer inden for regenerativ medicin på grund af deres biokompatibilitet, og deres følsomhed over for eksterne triggere 3. Injicerbare hydrogeler tilbyder annonceulemper end ikke-injicerbare hydrogeler i deres anvendelse i minimal invasiv kirurgi 4. Disse injicerbare hydrogeler kan anvendes gennem en sprøjte på grund af deres for skift inden fysiologiske forhold 5, og i princippet mulighed for kateter-baserede injektion nærmer 6. Forskellige strategier er blevet anvendt til injicerbare materialer, der spænder fra kemisk tværbinding efter injektion til fysisk tværbinding ved enten temperatur, pH og shear-thinning adfærd 4,7,8. Selv om flere systemer har vist let injicerbarhed via en sprøjte 9,10, har fuld kateter-kompatibilitet ikke vist ofte 6.
Hydrogeler fremstillet fra supramolekylære polymerer dannes ved ikke-kovalente interaktioner der kan tændes hensigtsmæssigt fra en gel til en opløsning tilstand og omvendt ved hjælp af miljømæssige udløsere 11. Endvidere er de lavmolekylære forstadier giver mulighed for nem bearbejdelighed 12,13 </sup>. De milde betingelser for at skifte tillade tilsætning af forskellige biologisk aktive komponenter såsom ofte vanskeligt at håndtere vækstfaktorer.
Supramolekylære forbigående netværk i vand baseret på poly (ethylenglycol) (PEG), ultimo modificeret med ureido-pyrimidinon (UPy) dele 14 har vist fordelene ved ikke-kovalente interaktioner i kombination med biomedicinske anvendelser og er blevet brugt som lægemiddeladministrationssystem i hjertet 6 og under nyrekapslen 15. Disse netværk dannes ved dimerisering af UPy-grupper afskærmet fra det vandige miljø med alkyl afstandsstykker danner en hydrofob lomme. Urea hydrogenbinding letter efterfølgende stabling af disse dimerer i nanofibre. På grund af den reversible interaktion mellem UPy-UPy dimer, udløser såsom pH og temperatur kan bruges til at skifte fra opløsninger til geler. Anvendelsen af en syntetisk motiv muliggør design af molekylet, og gelegenskaber ved til eksamenple tuning længden af PEG-kæder og alkyl afstandsstykker 14,16.
Desuden kan flere bioaktive komponenter inkorporeres ved simpel blanding af den supramolekylære hydrogelator opløsning før injektion, med stoffer eller bioaktive arter, såsom vækstfaktorer eller exosomer, hhv. Exosomer er små membranvesikler, der indeholder cytosoliske derivater. De secerneres af mange celler og er involveret i intercellulær kommunikation. Exosomer afledt fra cardiomyocyte progenitorceller er foreslået at spille en rolle i hjerte-beskyttelse 17.
Her beskriver vi protokollen af formuleringen, og in vivo myocardial injektion af et sådant bioaktivt supramolekylær hydrogel. In vitro forsøg er beskrevet som giver på forehand en indikation af gel stabilitet og lægemiddelfrigivelse, som giver mulighed for tuning af gelen og slipegenskaber før anvendelse in vivo.
En central udfordring er at opnå en løsning, som er injicerbar gennem en lang kateter samtidig holde løsningen forenelig med de bioaktive stoffer. Selvom pH skal øges for at øge injicerbarhed bioaktive forbindelser såsom vækstfaktorer er skrøbelige molekyler, der skal håndteres forsigtigt. Vi overvåger opløsningens pH tæt ved hjælp af et pH-meter efter tilsætning af hydrogelator at bekræfte det er pH 9,0, før du tilføjer nogen bioaktive komponenter. Indledningsvis, flere runder af justering udgangs pH af PBS var nødvendigt at ende med den rette pH. Endvidere, fordi vi bruger relativt viskose opløsninger og en lang tynd kateter, et stort trykfald er til stede (i størrelsesordenen 0,5 MPa, afhængigt af hastigheden af injektion). Derfor bør særlig forsigtighed skal træffes i vælge de rigtige forbindelser mellem sprøjten og kateteret. En sprøjte pumpe understøtter styret indsprøjtning, som anvender sådanne kræfter i hånden er udfordrende. For i vi troo eksperimenter blev opløsningen gelerede ved neutralisering af opløsningen med HCI, mens in vivo dette gøres ved den naturlige pH af vævet. Derfor er det vigtigt at tilsætte den rigtige mængde af HCI for at forhindre en overskridelse i pH. Diffusionen af denne syre er sandsynligvis den begrænsende faktor for geleringen af hydrogelen i in vitro-forsøg; dog in vivo væsken ville have en høj kontaktflade med neutraliserende væv, hvilket vil højst sandsynligt føre til en hurtigere og mere jævnt gelering sammenlignet med dråbevis tilsætning af koncentreret syre. Desuden omskiftningen gel er meget hurtigere med denne milde procedure sammenlignet med tidligere anvendte metoder (0,5 timer vs 2 timer) 25. Brug af kroppens naturlige pH til at skifte de materialeegenskaber er meget tiltalende, da overgangen er hurtig, reversibel, kan ikke finde sted inde i kateteret og er in vivo fuldautomatisk. Disse egenskaber giver fordele i forhold fx termisk switChable gels 26, hvor risikoen for gelering i et kateter på grund af temperaturændringer er til stede, geler, der kræver foto-inducerede polymerisation, som er udfordrende på grund af begrænset lysgennemtrængning og radikaldannelse 27, eller geler, der kræver co-injektion af en polymerisationsinitiator eller accellerator 28.
Vellykket frigivelse af et lægemiddel fra hydrogelen i vid udstrækning afhænger af størrelsen af lægemidlet. Som vist, er den lille molekyle narkotika frigives straks, mens den gradvise frigivelse af model protein over 1 uge viser løftet om disse hydrogeler som leveringssystemer for vækstfaktorer. Generelt hydrogeler er mere lovende, da levering redskab til større objekter, såsom proteiner, exosomer og celler 29,30.
Det 3-D elektromekanisk kortlægning og injektion procedure giver en klinisk valideret kateter-baserede levering tilgang til forskellige myocardial regenerative behandlingsformer såsom hydrogeler. Den Added værdi af denne teknologi i forhold til andre ikke-kirurgisk leveringsteknikker er planlægning behandlingen, hvilket gør det muligt at differentiere normal, infarkt og hibernating myocardium og lede terapier i området af interesse. Ulemper ved denne tilgang vedrører de nødvendige tekniske færdigheder og den tidskrævende og dyre procedure 20. I det præsenterede svin model for myokardieinfarkt elektromekaniske kortlægning blev efterfulgt af guidede intramyocardiale injektioner med bioaktive supramolekylære UPy-hydrogel. Andre kombinationer med regenererende behandlinger har at blive testet in vitro og in vivo for at få mere succes i denne nye område. Endvidere har optimering af injicerbarhedssvigt og sterilisering procedurer, der skal udføres for at succesfuldt oversætte denne metode til en klinisk indstilling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Ministeriet for uddannelse, kultur og videnskab (Gravity program 024.001.035), Nederlandene Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO), Det Europæiske Forskningsråd (FP7 / 2007-2013) ERC-tilskudsaftale 308.045 og gennemføres inden for LSH TKI rammer. Denne forskning er en del af projektet P1.03 Pent af forskningsprogrammet for Biomedical Materials institut, co-finansieret af det hollandske økonomiministerium. Dette projekt blev støttet af için – Holland Heart Institute ( www.icin.nl ) og "Wijnand M. Pom Stichting". Forfatterne vil gerne takke Henk Janssen og Joris Peters til syntese af UPy-hydrogelator og Remco Arts for at give mRuby2. Vi takker Bert Meijer, Tonny Bosman, Roxanne Kieltyka, Stijn Kramer, Joost Sluijter, Imo Hoefer og Frebus van Slochteren for de mange nyttige diskussioner og Marlijn Jansen, Joyce Visser, Grace Croft og Martijn van Nieuwburg for technical bistand.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1M HCl | |||
1M NaOH | |||
Polystyrene 24-wells plate | Falcon | 353047 | |
Amiodarone | Cordaron I.V. (Sanofini) | ||
Anton Paar Physica MCR501 | Anton Paar GmbH | Equipped with a parallel-plate geometry (25 mm) | |
Atropine | PCH | ||
Balloon ventilator | |||
Cary 50 Scan UV-Visible Spectrophotometer | Varian | ||
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer | Varian | ||
Defibrillation patches | |||
DMSO | Biosolve | 44705 | |
Endotracheal tube | Covidien | ||
Heparin | |||
Ketamine | Narketan 10 Vétoquinol | ||
Mapping catheter 115cm | Biosense Webster | ||
Midazolam | Actavis | ||
MilliQ | MD Milipore MilliQ Integral Water Purification System | ||
mRuby2 | |||
NaCl 0.9% 500cc | Braun | ||
NOGA guided Myostar injection catheter | Biosense Webster | ||
NOGA-RefStar EFO-patch | Biosense Webster | ||
Pancuronium bromide | |||
Parafilm | VWR | IKAA3801100 | |
PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
PET millicel | Millipore | PIEP12R48 | |
Pirfenidone | Sigma Aldrich | P2116 | Used from 100mM stock in DMSO |
Sodiumthiopental | Inresa | ||
Sufentanil | Sufentanil-Hameln | ||
Tegaderm | |||
UPy-PEG10k | |||
UV-Lamp | |||
Vet ointment | |||
Visipaque contrastfluid 100cc |