Supramoleculaire hydrogelators gebaseerd op ureido-pyrimidinonen maken volledige controle over de gel macroscopische eigenschappen en de sol-gel-schakelgedrag met pH. Hier presenteren we een protocol voor de formulering en het injecteren van een dergelijke supramoleculaire hydrogelator via een katheter afgiftesysteem voor lokale afgifte direct betrokken gebieden in het varkenshart.
Regeneratie van verloren myocard is een belangrijk doel voor toekomstige therapieën vanwege de toenemende optreden van chronisch ischemisch hartfalen en de beperkte toegang tot donor hart. Een voorbeeld van een behandeling om de functie van het hart te herstellen bestaat uit lokale toediening van geneesmiddelen en bioactieve een hydrogel. In dit document wordt een methode geïntroduceerd formuleren en injecteren geneesmiddel beladen hydrogel non-invasieve en side-specifieke in het varkenshart met behulp van een lange, buigzame katheter. Het gebruik van 3-D elektromechanische mapping en injectie via een catheter maakt side-specifieke behandeling van het myocardium. Om een hydrogel compatibel is met deze katheter te bieden, wordt een supramoleculaire hydrogel gebruikt vanwege de gunstige omschakeling van een gel naar een oplossing staat het gebruik van milieu-triggers. Bij basische pH gemodificeerde dit ureido-pyrimidinon poly (ethyleenglycol) als een Newtonse vloeistof die gemakkelijk kan worden geïnjecteerd, maar bij fysiologische pH van de oplossing snel schakelt ineen gel. Deze milde schakeltoestanden oog op het opnemen van bioactieve middelen en bioactieve soort, zoals groeifactoren en exosomes wij hier presenteren in zowel in vitro en in vivo experimenten. De in vitro experimenten geven een op voorhand indicatie van de stabiliteit gel en geneesmiddelafgifte, die zorgt voor het afstemmen van de gel en lossingseigenschappen voordat het volgende verzoek in vivo. Deze combinatie zorgt voor de optimale afstemming van de gel van de gebruikte biologisch actieve verbindingen en soorten, en het injectiesysteem.
Hoewel de behandeling van acuut myocardinfarct aanzienlijk is verbeterd overlevingskansen, de chronisch ischemisch hartfalen is een groot probleem voor de volksgezondheid dat vordert met een vergrijzende bevolking. Er zijn ongeveer 6.000.000 hartfalen patiënten in de VS met een geschatte 25% toename in de prevalentie van 2030 1,2. Eerste verlies van myocardweefsel leidt tot cardiale remodeling en uiteindelijk veroorzaakt chronisch hartfalen. Behalve harttransplantatie, is er geen echte behandeling voor deze groep patiënten. De toenemende tekortkoming van donorharten benadrukt de noodzaak om nieuwe beschikbare therapieën om dit proces van remodeling keren ontwikkelen. Daarom is een doel voor toekomstige therapieën is de regeneratie van verloren myocard.
Hydrogels zijn interessante materialen op het gebied van regeneratieve geneeskunde vanwege hun biocompatibiliteit en hun gevoeligheid voor externe triggers 3. Injecteerbare hydrogels bieden advoordelen oplevert ten opzichte van niet-injecteerbare hydrogels bij het gebruik in minimaal invasieve chirurgie 4. Deze injecteerbare hydrogels kunnen worden aangebracht via een injectiespuit door hun schakelbaarheid in fysiologische omstandigheden 5 en in principe mogelijk katheter gebaseerde injectie nadert 6. Verschillende strategieën zijn gebruikt voor injecteerbare materialen, variërend van chemische verknoping na injectie fysische verknoping door een temperatuur, pH en afschuiving verdunnende gedrag 4,7,8. Hoewel verschillende systemen hebben aangetoond eenvoudig injecteerbaarheid via een spuit 9,10, full katheter-compatibiliteit is niet vaak 6 getoond.
Hydrogelen bereid uit supramoleculaire polymeren worden gevormd door niet-covalente interacties die gemakkelijk kan worden omgeschakeld van een gel naar een oplossing toestand, en vice versa gebruik gemaakt worden 11. Bovendien is de laagmoleculaire precursors voor gemakkelijke verwerkbaarheid 12,13 </sup>. De milde omstandigheden nodig zijn voor het schakelen kan de toevoeging van verschillende biologisch werkzame bestanddelen zoals vaak moeilijk groeifactoren verwerken.
Supramoleculaire transient netwerken in water op basis van poly (ethyleenglycol) (PEG), end-gemodificeerd met ureido-pyrimidinon (UPy) delen 14 hebben aangetoond dat de voordelen van niet-covalente wisselwerkingen in combinatie met biomedische toepassingen en zijn gebruikt als geneesmiddelafgiftesysteem in het hart 6 en onder de renale capsule 15. Deze netwerken worden gevormd door dimerisatie van het UPy-groepen afgeschermd van de waterige omgeving door alkyl spacers vormen een hydrofobe pocket. Urea waterstofbinding vergemakkelijkt daaropvolgende stapeling van deze dimeren in nanovezels. Door de omkeerbare wisselwerking van de UPy-UPy dimeer, triggers zoals pH en temperatuur kan worden omgeschakeld van oplossingen voor gelen. Het gebruik van een synthetisch motief maakt ontwerp van het molecuul en geleigenschappen door Examencontractvoorwaardeple tuning lengte van de PEG-ketens en alkyl spacers 14,16.
Bovendien kunnen meerdere biologisch actieve componenten worden opgenomen door eenvoudig mengen van de supramoleculaire hydrogelator oplossing voor injectie met geneesmiddelen of biologisch actieve species, zoals groeifactoren of exosomes respectievelijk. Exosomen zijn kleine membraanvesicles die cytosolische derivaten bevatten. Zij worden uitgescheiden door veel cellen en zijn betrokken bij intercellulaire communicatie. Exosomes afgeleid van cardiomyocyten progenitorcellen voorgesteld om een rol te spelen in cardiale bescherming 17.
Hier beschrijven we het protocol formulering en in vivo myocardiale injectie van dergelijke bioactieve supramoleculaire hydrogel. In vitro experimenten beschreven die uit over forehand vermelding van gelstabiliteit en geneesmiddelafgifte, die zorgt voor het afstemmen van de gel en lossingseigenschappen vóór toepassing in vivo.
Een belangrijke uitdaging is om een oplossing die injecteerbaar door een lange katheter terwijl de oplossing compatibel is met de bioactieve stoffen te verkrijgen. Hoewel de pH te verhogen tot injecteerbaarheid te vergroten, bioactieve stoffen zoals groeifactoren zijn kwetsbaar molecules die zorgvuldig moet worden behandeld. We volgen de pH van de oplossing dicht met een pH meter na toevoeging van het hydrogelator te bevestigen pH 9,0 vóór toevoeging van bioactieve componenten. Aanvankelijk verscheidene series van instellen van de pH van het starten van de PBS waren nodig om bij de juiste pH. Verder omdat we relatief dikke monsters een lange dunne katheter, een grote drukdaling aanwezig is (in de orde van 0,5 MPa, afhankelijk van de snelheid van injectie). Daarom moet speciale zorg worden genomen bij het selecteren van de juiste verbindingen tussen de spuit en de katheter. Een injectiepomp steunen gecontroleerde injectie, zoals het aanbrengen van dergelijke krachten met de hand is uitdagend. Want in Vitro experimenten werd de oplossing gegeleerd door het neutraliseren van de oplossing met HCl, terwijl in vivo wordt dit gedaan door de natuurlijke pH van het weefsel. Daarom is het belangrijk om de juiste hoeveelheid HCl aan een overshoot in pH te voorkomen. De verspreiding van dit zuur is waarschijnlijk de beperkende factor in de gelering van de hydrogel in in vitro experimenten; In vivo zou de vloeistof een groot contactoppervlak met neutraliserende weefsel hebben die zal waarschijnlijk resulteren in een snellere en gelijkmatiger gelering vergelijking met toevoeging van geconcentreerd zuur druppelsgewijs. Bovendien is de gel switching veel sneller met deze milde procedure in vergelijking met eerder gebruikte werkwijzen (0,5 uur versus 2 uur) 25. Met de natuurlijke pH voor het schakelen van de materiaaleigenschappen is zeer aantrekkelijk omdat de overgang is snel, reversibel, kan optreden binnen de katheter en is in vivo volautomatisch. Deze eigenschappen geven voordelen boven bv thermische switchable gels 26, waarbij het risico van gelering in een katheter als gevolg van veranderingen in temperatuur aanwezig is, gels die foto-geïnduceerde polymerisatie, dat is een uitdaging vanwege de beperkte lichtinval en radicale vorming 27 of gels die co-injectie van een polymerisatie-initiator nodig nodig of versneller 28.
Succesvolle afgifte van een geneesmiddel uit de hydrogel grotendeels afhankelijk van de grootte van het geneesmiddel. Zoals getoond is de kleinmoleculige geneesmiddel onmiddellijk vrijgegeven terwijl de geleidelijke afgifte van het modeleiwit dan 1 week geeft de belofte van deze hydrogelen als afgiftesystemen voor groeifactoren. In het algemeen, hydrogels zijn veelbelovend als afgiftewerktuig voor grotere objecten zoals eiwitten, exosomes en cellen 29,30.
De 3-D elektromechanische mapping en injectieprocedure biedt een klinisch gevalideerde katheter gebaseerde afgifte benadering van verschillende myocardiale regeneratieve therapieën zoals hydrogels. De Added waarde van deze technologie in vergelijking met andere niet-chirurgische toedieningstechnieken de behandelingsplanning, waardoor de normale, geïnfarceerde en hibernerend myocardium differentiëren en therapieën begeleiden in het interessegebied. Nadelen van deze benadering betreffen de vereiste technische kennis en de tijdrovende en kostbare procedure 20. In de gepresenteerde varkens model van myocardinfarct elektromechanische mapping werd gevolgd door begeleide intramyocardiale injecties met de bioactieve supramoleculaire UPy-hydrogel. Andere combinaties met regeneratieve therapieën worden getest in vitro en in vivo meer succes op dit nieuwe terrein winnen. Voorts optimalisatie van injecteerbaarheid en sterilisatie procedures worden uitgevoerd om deze werkwijze met succes te vertalen naar een klinische omgeving.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Cultuur en Wetenschap (Gravity programma 024.001.035), Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO), de European Research Council (FP7 / 2007-2013) overeenkomst ERC Grant 308.045 en uitgevoerd binnen het LSH TKI kader. Dit onderzoek maakt deel uit van het Project P1.03 PENT van het onderzoeksprogramma van het BioMedical Materials-instituut, mede gefinancierd door het Nederlandse ministerie van Economische Zaken. Dit project werd gesteund door ICIN – Nederland Heart Institute ( www.icin.nl ) en de "Wijnand M. Pom Stichting". De auteurs willen graag Henk Janssen en Joris Peters bedanken voor de synthese van de UPy-hydrogelator en Remco Arts voor het verstrekken van de mRuby2. Wij danken Bert Meijer, Tonny Bosman, Roxanne Kieltyka, Stijn Kramer, Joost Sluijter, Imo Hoefer en Frebus van Slochteren voor de vele nuttige discussies en Marlijn Jansen, Joyce Visser, Grace Croft en Martijn van Nieuwburg voor technische hulp.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1M HCl | |||
1M NaOH | |||
Polystyrene 24-wells plate | Falcon | 353047 | |
Amiodarone | Cordaron I.V. (Sanofini) | ||
Anton Paar Physica MCR501 | Anton Paar GmbH | Equipped with a parallel-plate geometry (25 mm) | |
Atropine | PCH | ||
Balloon ventilator | |||
Cary 50 Scan UV-Visible Spectrophotometer | Varian | ||
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer | Varian | ||
Defibrillation patches | |||
DMSO | Biosolve | 44705 | |
Endotracheal tube | Covidien | ||
Heparin | |||
Ketamine | Narketan 10 Vétoquinol | ||
Mapping catheter 115cm | Biosense Webster | ||
Midazolam | Actavis | ||
MilliQ | MD Milipore MilliQ Integral Water Purification System | ||
mRuby2 | |||
NaCl 0.9% 500cc | Braun | ||
NOGA guided Myostar injection catheter | Biosense Webster | ||
NOGA-RefStar EFO-patch | Biosense Webster | ||
Pancuronium bromide | |||
Parafilm | VWR | IKAA3801100 | |
PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
PET millicel | Millipore | PIEP12R48 | |
Pirfenidone | Sigma Aldrich | P2116 | Used from 100mM stock in DMSO |
Sodiumthiopental | Inresa | ||
Sufentanil | Sufentanil-Hameln | ||
Tegaderm | |||
UPy-PEG10k | |||
UV-Lamp | |||
Vet ointment | |||
Visipaque contrastfluid 100cc |