Supra hydrogelators basert på ureidoderivat pyrimidinones tillate full kontroll over de makroskopiske gelegenskaper og sol-gel switching atferd med pH. Her presenterer vi en protokoll for å formulere og injisere slikt supra hydrogelator via et kateter levering system for lokal leveranse direkte på relevante områder i grisen hjerte.
Regenerering av tapte myokard er et viktig mål for fremtidige behandlinger på grunn av den økende forekomsten av kronisk iskemisk hjertesvikt og begrenset tilgang på donor hjerter. Et eksempel på en behandling for å gjenopprette funksjonen til hjertet består av lokal avlevering av medikamenter og bioaktive stoffer fra en hydrogel. I denne utredningen en metode er innført for å formulere og injisere et stoff belastet hydrogel non-invasiv og sidespesifikke inn grisen hjertet ved hjelp av en lang, fleksibel kateter. Bruken av 3-D elektro kartlegging og injeksjon via et kateter muliggjør side-spesifikk behandling av myokard. For å gi en hydrogel kompatible med dette kateteret blir et supra hydrogel brukt på grunn av den praktiske omkobling fra en gel til en løsning tilstand ved hjelp av miljømessige utløsere. Ved basisk pH denne ureido-pyrimidinon modifisert poly (etylenglykol) virker som en Newtonsk væske som lett kan injiseres, men ved fysiologisk pH oppløsningen skifter hurtig tilen gel. Disse milde koblingsbetingelser tillater inkorporering av bioaktive stoffer og bioaktive arter, slik som vekstfaktorer og exosomes som vi presenterer her i både in vitro og in vivo eksperimenter. In vitro eksperimenter gi en på forhånd angivelse av gelen stabilitet og medikamentfrigjøring, som gir mulighet for justering av gelen og slipp egenskaper før den etterfølgende påføring in vivo. Denne kombinasjonen gir den optimale avstemning av gelen til de brukt bioaktive forbindelser og arter, og innsprøytningssystemet.
Selv om behandlingen av akutt hjerteinfarkt er betydelig forbedret overlevelse, er kronisk iskemisk hjertesvikt et stort folkehelseproblem som utvikler seg med en aldrende befolkning. Det er ca 6 millioner hjertesviktpasienter i USA med anslagsvis 25% økning i prevalens i 2030 1,2. Innledende tap av hjerteinfarkt vev fører til hjerte ombygging og til slutt fører til kronisk hjertesvikt. Med unntak av hjertetransplantasjon, er det ingen reell behandling for denne gruppen av pasienter. Den økende mangel på donor hjerter understreker behovet for å utvikle nye tilgjengelige behandlinger for å reversere denne prosessen med ombygging. Derfor er et mål for fremtidige terapier regenerering av tapt hjertemuskelen.
Hydrogelene er interessante materialer innen regenerativ medisin på grunn av deres biokompatibilitet, og deres følsomhet for ytre utløser tre. Injiserbare hydrogelene tilby annonsefortrinn enn non-injiserbare hydrogelene i deres bruk i minimal invasiv kirurgi 4. Disse injiserbare hydrogeler kan brukes ved hjelp av en sprøyte på grunn av deres veksling innenfor fysiologiske betingelser 5, og i prinsippet mulig for kateterbasert injeksjons tilnærminger 6. Forskjellige strategier har blitt brukt for injiserbare materialer, som strekker seg fra kjemisk tverrbinding etter injeksjonen for å fysisk tverrbinding ved enten temperatur, pH og skjærtynningsadferd 4,7,8. Selv om flere systemer har vist seg lett injiserbarhet via en sprøyte 9,10, har full kateter kompatibilitet ikke vist ofte 6.
Hydrogeler er fremstilt fra supramolekylære polymerer blir dannet ved ikke-kovalente interaksjoner som kan skrus hensiktsmessig fra en gel til en løsning tilstand, og vice versa ved hjelp av miljømessige utløsere 11. Videre er de lavmolekylære forløpere gir enkel bearbeidbarhet 12,13 </sup>. De milde betingelser som kreves for omkopling tillate tilsetning av forskjellige biologiske aktive komponenter som ofte er vanskelige å håndtere vekstfaktorer.
Supraforbigående nettverk i vann basert på poly (etylenglykol) (PEG), endemodifisert med ureido-pyrimidinon (UPy) grupper 14 har vist fordelene ved ikke-kovalente interaksjoner i kombinasjon med biomedisinske anvendelser og er blitt anvendt som medikamentleveringssystem i hjertet 6 og under den renale kapselen 15. Disse nettverk er dannet ved dimerisering av UPy-gruppene skjermet fra det vandige miljø etter alkyl-avstandsstykker som danner en hydrofob lomme. Urea hydrogenbinding forenkler påfølgende stabling av disse dimers inn nanofibers. På grunn av den reversible vekselvirkning mellom UPy-UPy dimer, utløser så som pH og temperatur kan brukes til å skifte fra løsninger på geler. Bruken av en syntetisk motiv tillater utforming av molekylet og gelegenskaper ved for undersøkelseple innstiller lengden av PEG-kjeder og alkyl- avstandsstykker 14,16.
Videre kan flere bioaktive komponenter bygges inn ved ganske enkelt å blande den supra hydrogelator oppløsning før injeksjon, med medikamenter eller bioaktive arter, for eksempel vekstfaktorer eller exosomes, henholdsvis. Exosomes er små membranvesikler som inneholder cytosolic derivater. De blir utskilt av mange celler, og er involvert i intercellulær kommunikasjon. Exosomes avledet fra cardiomyocyte progenitorceller er foreslått å spille en rolle i hjertebeskyttelse 17.
Her beskriver vi protokollen for formulering, og in vivo myokardial injeksjon av et slikt bioaktiv supra hydrogel. In vitro-eksperimenter er beskrevet, som gir på forehand en indikasjon på gel-stabilitet og medikamentfrigjøring, som gir mulighet for justering av gelen og slipp egenskaper før anvendelse in vivo.
En viktig utfordring er å oppnå en løsning som er injiserbart ved en lang kateter samtidig oppløsningen forenlig med de bioaktive forbindelser. Selv om pH-verdi økes for å øke injiserbarheten, bioaktive forbindelser, slik som vekstfaktorer er skjøre molekyler som skal håndteres forsiktig. Vi overvåke pH-verdien i oppløsningen tett ved hjelp av et pH-meter etter tilsetning av hydrogelator å bekrefte at det er pH 9,0 før tilsetning av noen bioaktive komponenter. I utgangspunktet flere runder med justering av utgangs pH i PBS var nødvendig å ende med riktig pH. Videre, fordi vi bruker relativt viskøse løsninger og et langt tynt kateter, er et stort trykkfall tilstede (i størrelsesorden 0,5 MPa, avhengig av hastigheten på injeksjonen). Derfor bør man være spesielt forsiktig i å velge de rette kontaktene mellom sprøyten og kateteret. En sprøyte pumpe støtter styrt injeksjon, som bruker slike krefter for hånd er utfordrende. For i vitro eksperimenter ble løsningen gelated ved nøytralisering av oppløsningen med HCl, mens in vivo dette gjøres ved den naturlige pH-verdien i vevet. Derfor er det viktig å tilsette riktig mengde HCl for å hindre en oversving i pH. Spredningen av denne syre er sannsynligvis den begrensende faktor i gelering av hydrogelen i in vitro eksperimenter; Imidlertid in vivo væsken vil ha en høy kontaktflateareal med nøytraliserende vev, noe som vil mest sannsynlig resultere i en raskere og mer jevnt gelering i forhold til dråpevis tilsetning av konsentrert syre. Videre er gelen svitsje mye raskere med dette mild fremgangsmåte i forhold til tidligere brukte metoder (0,5 timer mot 2 timer) 25. Ved hjelp av kroppens naturlige pH-verdi for omkopling av materialegenskaper er meget tiltalende fordi overgangen er rask, reversibel, ikke kan forekomme inne i kateteret og er in vivo helautomatisk. Disse egenskapene gir fordeler i forhold til f.eks termisk bytChable geler 26, hvor faren for gelering i et kateter som følge av temperaturendringer er til stede, geleer som krever fotoinduserte polymerisering, noe som er vanskelig på grunn av lett penetrasjon begrenset og radikaldannelse 27 eller geler som krever ko-injeksjon av en polymerisasjonsinitiator eller accellerator 28.
Vellykket frigjøring av et medikament fra hydrogel i stor grad avhenger av størrelsen av stoffet. Som vist er det lite molekyl medikamentet frigis umiddelbart, mens den gradvise frigjøring av modellen protein i løpet av en uke viser løftet av disse hydrogeler som leveringssystemer for vekstfaktorer. Generelt hydrogelene er mer lovende som levering verktøy for større gjenstander som proteiner, exosomes og celler 29,30.
3-D elektro kartlegging og injeksjonsprosedyren gir en klinisk validert kateterbasert levering tilnærming for ulike myokardielle regenerative behandlinger, for eksempel hydrogeler. Den AddeD-verdien for denne teknologien i forhold til andre ikke-kirurgiske leveringsteknikker er behandling planlegging, noe som gjør det mulig å skille mellom normal, infarkt og hi myokardium og for å lede behandling i området av interesse. Ulempene med denne tilnærmingen bekymring de nødvendige tekniske ferdigheter og tidkrevende og kostbar prosedyre 20. I present svin modell av hjerteinfarkt elektro kartlegging ble etterfulgt av guidet intramyocardial injeksjoner med det bioaktive supra UPy-hydrogel. Andre kombinasjoner med regenerativ behandling har til å bli testet in vitro og in vivo for å få mer suksess i dette nye feltet. Videre optimalisering av injiserbarhet og steriliseringsprosedyrer må utføres for å kunne oversette denne fremgangsmåte til en klinisk sammenheng.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av departementet for utdanning, kultur og vitenskap (Gravity program 024.001.035), Nederland Organisation for Scientific Research (NWO), European Research Council (FP7 / 2007-2013) ERC Grant Agreement 308045 og gjennomføres innenfor LSH TKI rammeverk. Dette forsknings er en del av prosjektet P1.03 PENT av forskningsprogrammet av biomedisinske materialer instituttet, delfinansiert av den nederlandske Ministry of Economic Affairs. Dette prosjektet ble støttet av icin – Nederland Heart Institute ( www.icin.nl ) og "Wijnand M. Pom Stichting". Forfatterne ønsker å takke Henk Janssen og Joris Peters for syntesen av UPy-hydrogelator og Remco Arts for å gi mRuby2. Vi takker Bert Meijer, Tonny Bosman, Roxanne Kieltyka, Stijn Kramer, Joost Sluijter, Imo Hoefer, og Frebus van Slochteren for de mange nyttige diskusjoner og Marlijn Jansen, Joyce Visser, Grace Croft og Martijn van Nieuwburg for technical hjelp.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1M HCl | |||
1M NaOH | |||
Polystyrene 24-wells plate | Falcon | 353047 | |
Amiodarone | Cordaron I.V. (Sanofini) | ||
Anton Paar Physica MCR501 | Anton Paar GmbH | Equipped with a parallel-plate geometry (25 mm) | |
Atropine | PCH | ||
Balloon ventilator | |||
Cary 50 Scan UV-Visible Spectrophotometer | Varian | ||
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer | Varian | ||
Defibrillation patches | |||
DMSO | Biosolve | 44705 | |
Endotracheal tube | Covidien | ||
Heparin | |||
Ketamine | Narketan 10 Vétoquinol | ||
Mapping catheter 115cm | Biosense Webster | ||
Midazolam | Actavis | ||
MilliQ | MD Milipore MilliQ Integral Water Purification System | ||
mRuby2 | |||
NaCl 0.9% 500cc | Braun | ||
NOGA guided Myostar injection catheter | Biosense Webster | ||
NOGA-RefStar EFO-patch | Biosense Webster | ||
Pancuronium bromide | |||
Parafilm | VWR | IKAA3801100 | |
PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
PET millicel | Millipore | PIEP12R48 | |
Pirfenidone | Sigma Aldrich | P2116 | Used from 100mM stock in DMSO |
Sodiumthiopental | Inresa | ||
Sufentanil | Sufentanil-Hameln | ||
Tegaderm | |||
UPy-PEG10k | |||
UV-Lamp | |||
Vet ointment | |||
Visipaque contrastfluid 100cc |