Supramolekulare Hydrogelbildner basierend auf Ureido-Pyrimidinone ermöglicht volle Kontrolle über die makroskopischen Eigenschaften Gel und Sol-Gel-Schaltverhalten mit pH. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Formulierung und Einspritzen eines solchen supramolekularen Hydrogelbildner über ein Kathetersystem für die lokale Zustellung direkt in den relevanten Bereichen in der Schweineherz.
Regeneration der verlorenen Myokard ist ein wichtiges Ziel für zukünftige Therapien wegen der zunehmenden Auftreten von chronischen ischämischen Herzversagen und dem begrenzten Zugang zu Spenderherzen. Ein Beispiel für eine Behandlung, um die Funktion des Herzens zu gewinnen aus der lokalen Abgabe von Arzneistoffen und bioaktiven Substanzen, aus einem Hydrogel. In dieser Arbeit wird ein Verfahren eingeführt, zu formulieren und zu injizieren, eine wirkstoffbeladene Hydrogel nicht-invasiv und Seitenspezifische in das Schweineherz mit einem langen, flexiblen Katheter. Die Verwendung von 3-D elektro Kartierung und Injektion über einen Katheter ermöglicht seitenspezifischen Behandlung des Herzmuskels. Um ein Hydrogel mit diesem Katheter kompatibel ist, wird ein supramolekulares Hydrogel wegen der günstigen Schalt von einem Gel zu einem Lösungszustand mit Umwelt-Trigger verwendet. Bei einem basischen pH-Wert dieser Ureido-pyrimidinon modifizierten Poly (ethylenglycol) als eine Newtonsche Flüssigkeit, die leicht injiziert werden kann, aber bei einem physiologischen pH-Wert der Lösung schnell schaltet inein Gel. Diese milden Schaltbedingungen erlauben für den Einbau von biologisch aktiven Arzneimitteln und bioaktiven Spezies, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren und Exosomen, wie wir hier sowohl in vitro als auch in vivo gegenwärtig. Die in-vitro-Experimente geben ein auf Vorhand Angabe der Gelstabilität und Wirkstofffreisetzung, die für die Abstimmung des Gels erlaubt und vor der späteren Anwendung in vivo Freisetzungseigenschaften. Diese Kombination ermöglicht die optimale Abstimmung des Gels auf die verwendeten bioaktiven Verbindungen und Spezies und das Einspritzsystem.
Obwohl die Behandlung des akuten Myokardinfarkts hat sich deutlich verbessert Überlebensraten, ist die chronische ischämische Herzversagen eine wichtige Problem der öffentlichen Gesundheit, die mit einer alternden Bevölkerung fortschreitet. Es gibt rund 6 Millionen Patienten mit Herzinsuffizienz in den USA mit einem geschätzten 25% ige Erhöhung der Prävalenz im Jahr 2030 1,2. Initial Verlust von Herzmuskelgewebe führt zu kardialen Remodeling und verursacht chronischer Herzinsuffizienz schließlich. Außer für eine Herztransplantation, gibt es keine wirkliche Behandlung für diese Gruppe von Patienten. Der zunehmende Mangel an Spenderherzen unterstreicht die Notwendigkeit, neue Therapien zur Verfügung, um diesen Prozess der Umgestaltung rückgängig zu entwickeln. Daher ist ein Ziel für zukünftige Therapien ist die Regenerierung verloren Myokard.
Hydrogele sind interessante Materialien auf dem Gebiet der regenerativen Medizin aufgrund ihrer Biokompatibilität und ihrer Empfindlichkeit gegenüber externen Trigger 3. Injizierbare Hydrogele bieten adVorteile gegenüber nicht-injizierbaren Hydrogele in deren Einsatz in der minimal invasiven Chirurgie 4. Diese injizierbaren Hydrogele können durch eine Spritze aufgrund ihrer Schaltbarkeit im physiologischen Bedingungen 5 aufgebracht werden und im Prinzip erlauben katheterbasierten Injektions nähert 6. Verschiedene Strategien sind für injizierbare Materialien verwendet worden sind, von der chemischen Vernetzung nach der Injektion, um eine physikalische Vernetzung entweder durch Temperatur, pH und scherentzähende Verhalten 4,7,8. Obwohl mehrere Systeme einfach Injizierbarkeit über eine Spritze 9,10 gezeigt, hat die volle Katheter-Kompatibilität nicht oft 6 gezeigt.
Hydrogele, die aus supramolekulare Polymere hergestellt werden durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, die bequem von einem Gel zu einem Lösungszustand geschaltet werden können und umgekehrt unter Verwendung von Umwelt-Trigger 11 ausgebildet. Darüber hinaus ermöglichen die Gewichts Vorläufer mit niedrigem Molekular für leichte Verarbeitbarkeit 12,13 </sup>. Die milden Bedingungen zum Umschalten kann der Zusatz von verschiedenen biologisch aktiven Komponenten, wie oft schwierig, Wachstumsfaktoren zu behandeln erforderlich.
Supramolekulare transienten Netzwerke in Wasser, bezogen auf Poly (ethylenglycol) (PEG), End-modifizierten mit Ureido-pyrimidinon (UPY) -Einheiten 14 haben die Vorteile der nicht-kovalente Wechselwirkungen in Kombination mit biomedizinischen Anwendungen gezeigt und sind als Arzneimittel-Abgabesystem verwendet im Herzen 6 und unter der Nierenkapsel 15. Diese Netze werden durch Dimerisierung der UPY-Gruppen aus der wässrigen Umgebung durch Alkylspacer Bildung einer hydrophoben Tasche abgeschirmt gebildet. Harnstoffwasserstoffbrückenbindung erleichtert anschließende Stapelung dieser Dimere in Nanofasern. Aufgrund der reversiblen Wechselwirkung des UPY-UPY Dimer löst, wie pH und Temperatur können verwendet werden, um aus Lösungen, Gele zu schalten. Die Verwendung eines Kunstmotiv ermöglicht Gestaltung der Molekül und Geleigenschaften von PrüfungsB. tuning Länge der PEG-Ketten und Alkylspacer 14,16.
Darüber hinaus können mehrere bioaktive Komponenten durch einfaches Mischen des supra Hydrogelbildner Lösung vor der Injektion mit Medikamenten oder bioaktive Spezies, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren oder Exosomen bzw. eingebracht werden. Exosomen sind kleine Membranbläschen, die Cytosol-Derivate enthalten. Sie werden von vielen Zellen sezerniert und in die interzelluläre Kommunikation beteiligt. Exosomen von Kardiomyozyten-Vorläuferzellen abgeleitet werden vorgeschlagen, um eine Rolle bei Herz-Schutz 17 zu spielen.
Hier beschreiben wir das Protokoll der Formulierung und in vivo myokardialen Injektion eines derartigen bioaktiven supra Hydrogel ist. In-vitro-Versuche beschrieben, die auf der Vorhand ein Indiz für Gelstabilität und Wirkstofffreisetzung, die für die Abstimmung des Gels ermöglicht geben und vor dem Trenneigenschaften Anwendung in vivo.
Eine zentrale Herausforderung ist es, eine Lösung, die injizierbare durch einen langen Katheter während die Lösung mit den bioaktiven Verbindungen einholen. Obwohl der pH-Wert erhöht die Injizierbarkeit zu erhöhen, bioaktive Substanzen wie Wachstumsfaktoren sind empfindliche Moleküle, die vorsichtig gehandhabt werden müssen. Wir überwachen den pH-Wert der Lösung eng mit einem pH-Meter nach dem Hinzufügen des Hydrogelbildner zu, bevor Sie irgendwelche bioaktiven Komponenten zu bestätigen ist es pH 9,0. Anfänglich wurden mehrere Runden des Einstellens der Ausgangs-pH der PBS erforderlich sind, um den richtigen pH beenden. Ferner, weil wir relativ viskosen Lösungen und einen langen dünnen Katheter ist ein großer Druckabfall vorhanden ist (in der Größenordnung von 0,5 MPa in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit der Injektion). Deshalb sollte besondere Sorgfalt bei der Auswahl der richtigen Verbindungen zwischen der Spritze und dem Katheter entnommen werden. Eine Spritzenpumpe Träger gesteuerte Einspritzung, wie die Anwendung solcher Kräfte von Hand ist eine Herausforderung. Für in vitro Experimenten wurde die Lösung durch Neutralisieren der Lösung mit HCl geliert, während in vivo Dieses wird durch den natürlichen pH-Wert des Gewebes erfolgt. Daher ist es wichtig, die richtige Menge von HCl in den ein Überschwingen im pH zu verhindern. Die Diffusion dieser Säure ist wahrscheinlich der begrenzende Faktor bei der Geliertemperatur des Hydrogels in in vitro-Experimenten; jedoch in vivo würde die Flüssigkeit eine hohe Kontaktfläche mit neutralisierenden Gewebe besitzen, die höchstwahrscheinlich zu einem schneller und gleichmäßiger gegenüber Gelierung Zugabe von konzentrierter Säure tropft. Außerdem ist das Gel Schalt viel schneller mit dieser milden Verfahrens im Vergleich zu bisher verwendeten Methoden (0,5 h gegenüber 2 Stunden) 25. Mit natürlichen pH-Wert des Körpers zum Umschalten der Materialeigenschaften ist sehr ansprechend, da der Übergang ist schnell, reversibel, kann nicht innerhalb des Katheters auftreten und ist in vivo vollautomatisch. Diese Eigenschaften geben, Vorteile gegenüber zB thermische switchable geliert 26, denen das Risiko einer Gelbildung in einem Katheter aufgrund von Temperaturänderungen vorhanden ist, die Gele, die photoinduzierte Polymerisation, die aufgrund der begrenzten Lichteinfall und die Radikalbildung 27 oder Gele, die Co-Injektion eines Polymerisationsinitiators erforderlich herausfordernd ist erforderlich oder accellerator 28.
Erfolgreiche Freisetzung eines Arzneimittels aus dem Hydrogel hängt weitgehend von der Größe des Arzneimittels. Wie gezeigt, wird das kleine Molekül Medikament sofort freigelassen, während die allmähliche Freisetzung des Modellproteins ab 1 Woche zeigt die Versprechen dieser Hydrogele als Abgabesysteme für Wachstumsfaktoren. Im Allgemeinen sind die Hydrogele versprechender als Abgabewerkzeug für größere Objekte, wie Proteine, Exosomen und Zellen 29,30.
Die 3-D-Mapping und elektromechanische Einspritzverfahren bietet eine klinisch validierten katheterbasierte Liefer Ansatz für verschiedene Herzmuskel regenerative Therapien, wie Hydrogele. Die added-Wert dieser Technologie im Vergleich zu anderen nicht-chirurgische Abgabetechniken ist die Planung der Behandlung, so dass es möglich ist, normal ist, und infarzierten Myokard hibernating unterscheiden und Therapien in dem interessierenden Bereich zu führen. Nachteile dieses Ansatzes betreffen die erforderlichen technischen Fähigkeiten und die zeitraubende und kostspieliges Verfahren 20. In der vorliegenden Schweinemodell von Myokardinfarkt elektromechanische Mapping wurde von geführten intramyokardialen Injektionen mit dem bioaktiven supramolekularen UPY-Hydrogel gefolgt. Andere Kombinationen mit regenerativer Therapien wurden in vitro getestet und in vivo zu mehr Erfolg in diesem neuen Gebiet zu erlangen. Außerdem Optimierung Injizierbarkeit und Sterilisationsverfahren haben, um durchgeführt werden, um erfolgreich zu einer klinischen Umgebung zu übersetzen diese Methode.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Bildung, Kultur und Wissenschaft (Gravity Programm 024.001.035) finanziert, der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), dem European Research Council (FP7 / 2007-2013) ERC Grant Agreement 308.045 und in der durchgeführt, LSH TKI Rahmen. Diese Forschung ist Teil des Projekt P1.03 PENT des Forschungsprogramms des Instituts Biomedizinische Materialien, mitfinanziert vom niederländischen Wirtschaftsministerium. Niederlande Heart Institute (- Dieses Projekt wurde von ICIN unterstützt www.icin.nl ) und die "Wijnand M. Pom Stichting". Die Autoren bedanken sich bei Henk Janssen und Joris Peters für die Synthese des UPY-Hydrogelbildner und Remco Arts für die Bereitstellung der mRuby2 danken. Wir bedanken uns bei Bert Meijer, Tonny Bosman, Roxanne Kieltyka, Stijn Kramer, Joost Sluijter, Imo Hoefer und Frebus van Slochteren für die viele nützliche Diskussionen und Marlijn Jansen, Joyce Visser, Anmut Croft und Martijn van Nieuwburg für technische Unterstützung.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1M HCl | |||
1M NaOH | |||
Polystyrene 24-wells plate | Falcon | 353047 | |
Amiodarone | Cordaron I.V. (Sanofini) | ||
Anton Paar Physica MCR501 | Anton Paar GmbH | Equipped with a parallel-plate geometry (25 mm) | |
Atropine | PCH | ||
Balloon ventilator | |||
Cary 50 Scan UV-Visible Spectrophotometer | Varian | ||
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer | Varian | ||
Defibrillation patches | |||
DMSO | Biosolve | 44705 | |
Endotracheal tube | Covidien | ||
Heparin | |||
Ketamine | Narketan 10 Vétoquinol | ||
Mapping catheter 115cm | Biosense Webster | ||
Midazolam | Actavis | ||
MilliQ | MD Milipore MilliQ Integral Water Purification System | ||
mRuby2 | |||
NaCl 0.9% 500cc | Braun | ||
NOGA guided Myostar injection catheter | Biosense Webster | ||
NOGA-RefStar EFO-patch | Biosense Webster | ||
Pancuronium bromide | |||
Parafilm | VWR | IKAA3801100 | |
PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
PET millicel | Millipore | PIEP12R48 | |
Pirfenidone | Sigma Aldrich | P2116 | Used from 100mM stock in DMSO |
Sodiumthiopental | Inresa | ||
Sufentanil | Sufentanil-Hameln | ||
Tegaderm | |||
UPy-PEG10k | |||
UV-Lamp | |||
Vet ointment | |||
Visipaque contrastfluid 100cc |