Introduction
そのような蛍光分光法などの技術、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーは、すべてが、蛍光に広く、生化学的、生物医学的、及び化学的用途において利用性を依存している。蛍光、内因性または標識を介して、タンパク質発現パターンおよびプロファイル、細胞の運命、タンパク質相互作用及び生物学的機能1-9の分析のために利用され、されているかどうかの生体分子相互作用及び立体配座の変化を検出するための蛍光/蛍光共鳴エネルギー移動を介して10-13。 オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質（GFP）14の単離以来、他の刺胞動物、特にサンゴからの追加の天然に存在する蛍光タンパク質の発見は、大部分が識別可能な励起/発光スペクトルを有する既存の蛍光タンパク質の数が増加している。一緒に彼らの遺伝子に変異を導入し15-19とこれら、HAVEさらに、顕微鏡を利用する研究者に利用可能な蛍光タンパク質の真のパレットを取得し、可能性を拡大し、フローサイトメトリーとその研究のために他の蛍光ベースの技術。
並行して、独立しているが、レトロウイルス技術の開発が大幅に哺乳動物細胞における異所性の遺伝情報20-23の安定な発現を促進した。その技術は、細胞型および組織24-28の広い数に、またはトランスジェニック動物の産生のために29〜31の蛍光タンパク質の遺伝子を導入するために使用されていることは驚くべきことではない。レトロウイルスの性質に続いて、異所性蛍光タンパク質の遺伝情報は、セル32のゲノム内に導入され、細胞がever'は`蛍光性になる。このプロパティは、細胞の運命の、または細胞集団内の単一セルの追跡を可能にした。今蛍光細胞は、このようにアックイいます独自のbiosignatureを赤とバーコードのように定義することができます。そのユニークなbiosignatureは、他の細胞からそれを識別し、重要なのは、遺伝的に識別可能な吸収/発光スペクトルを有する異なる蛍光タンパク質を発現するように操作された細胞と区別します。そのような多能性33に向けて初期化因子の追跡などの生物学的用途、核小体局在34の解明のための核内要因の分析、転写の研究35またはニューロンネットワークアーキテクチャ36の研究のための神経細胞の遺伝的標識のための蛍光レポータープラスミドの構築、同じ実験のセットアップのために、異なる蛍光タンパク質遺伝子を悪用している多くのわずか4例です。
フローサイトメトリー広く、遺伝子発現、細胞周期、アポトーシス、及びホスホリルを介したシグナル伝達のような単一細胞レベルでの生物学的プロセスの分析に利用されているATION 37-43は、哺乳動物細胞中の蛍光タンパク質遺伝子の.theの安定な発現は、細胞分析38,44およびリガンド-受容体相互作用45のフローサイトメトリーの有用性が増強されている。拡張機能は、フローサイトメトリーは、ハイスループットおよびハイコンテントスクリーニング46のために広く利用される方法論になることを可能にした。できるカップルのプレートリーダーシステム、イメージングおよびフローサイトメトリー蛍光計とロボット技術の今拡張した数にもかかわらず、これらの強化された技術力を活用し、合うことができる実験的なデザインの欠如があるように思われる。
、高速で信頼性の高い、簡単かつ堅牢な細胞ベースの方法が大幅にさらにハイスループット能力を高める多重化アプリケーションのために必要とされる。これは、多重化された形式で、エンジニアリング、細胞ベースのアッセイは、ハイスループットスクリーニング39,47-50のパワーを高めることができる創薬の分野において特にそうである51-54を高める。蛍光遺伝子バーコードは、エレガント多重化を可能にするだけでなく、一度に操作、時間のかかるプロトコルの必要性を回避する、抗体、ビーズや汚れ39,52,55に伴うコストを削減し、高に必要なスクリーンの数を減らすことができるだけでなくスループットのアプリケーション。我々は最近、以前に別の臨床的に普及している変異体58とHIV-1プロテアーゼ活性56,57を監視するために開発されたアッセイを発現させることによって、生物学的用途のために、蛍光遺伝子バーコードを介して多重化を向上させることができる方法のレトロウイルス技術が記載されている。方法は、遺伝的に、蛍光バーコードのセルを選択し、増幅する方法に焦点を当て、より説明的な方法で説明した方法を異なる蛍光タンパク質および/または異なる蛍光intensitを発現するクローン集団のパネルを生産するさIES。それらの蛍光特性に基づいて識別可能な細胞集団のパネルは、異なる生物学的問題に取り組むための細胞ベースのアッセイと組み合わせて利用することができる多重化能力を高める。プロトコルはまた、例えば59のように、以前に研究室で開発されたセルベースアッセイの1を保有するバーコード細胞のパネルを設計する方法について説明します。このプロトコルは、このように遺伝的伝達のための十分に確立されたレトロウイルス/レンチウイルス技術、60,48サイトメトリー蛍光タンパク質またはフローのアプリケーションの価値を示すためではなく、多重化されたアプリケーションのための3つを組み合わせて強化する力を示すことを意図するものではない。
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Protocol
遺伝バーコーディングのための哺乳動物細胞、ウイルス産生および形質導入の作製
- 10％ウシ胎児血清（FCS）を有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中にトランスフェクションの前に、プレート10cmプレート（または周囲の50〜60％コンフルエンシー）で2.5×10 6個の接着性細胞を一日。そのようなフェニックス-GP（ゲイリー·ノーラン、スタンフォード大学からの親切な贈り物）として選択したレトロウイルス生産用パッケージング細胞線に対する。
注：パッケージング細胞株を安定トランスにおけるレトロウイルス粒子形成のためのGagおよびPolタンパク質を発現する。細胞が健康と単層板に接着し、トランスフェクションの前にあることを確認してください。 - 24時間後、DNAトランスフェクション混合物を調製。
- 無血清DMEMの125μlに関心の蛍光タンパク質遺伝子を有するベクター（PCI-VSVG）及びトランスファーベクターの3μgの糖タンパク質3μgの水疱性口内炎ウイルスエンベロープを追加します。 2 mg / mlの（混ぜ、ポリエチ15μlのを追加）。
- 15分間室温で混合物をインキュベートし、滴ずつ細胞に添加する。
NOTE：ポリエチはポリプレックスを形成するためのトランスフェクション試薬として均質なDNA混合物に添加される。異なる蛍光タンパク質マーカーを担持するウイルス粒子を得るために、選択したマーカーでそれぞれ独立して、トランスフェクションを行う。レトロウイルス導入ベクターの長さは約7 KBで、10 KBを超える場合、パッケージ化することができないことに注意してください。
- 37℃でプレートをインキュベートする。代わりに、30℃または32℃でのウイルスの生産地板を高めるために。
注：24時間後にトランスフェクション培地を新鮮な培地7mlを置き換えることができ、これは細胞の健康を改善することができるが、それは、上清中のウイルス負荷を減少させることができる。 - 48時間後にトランスフェクションを、0.45μmのポリテトラフルオロエチレンフィルターで上清を含むウイルス粒子とフィルタを集める。形質導入のために新鮮に収集したウイルス上清を使用してください。 OTHerwise -80℃でアリコートで上清を維持し、凍結融解を避ける。ウイルス力価は、それぞれの凍結融解サイクルで、おそらく最大50％に減少することを忘れないでください。
- 非付着した場合付着する場合、またはすぐに形質導入する前に、形質導入の前に選択24時間のプレートの細胞株。シード2.0×10 5 10×3.0 5接着細胞（ここでのHuh 7.5.1およびHEK 293T）または5.0×10 5〜 1×10 6個の非接着細胞（ここでSupT1）あたり6ウェルプレートで。
注：細胞が形質導入時に60％程度の集密度を達成ので、特に接着細胞用ように、形質導入前に播種する細胞数を校正してください。 - 播種した細胞に5μg/ mlのポリブレン（hexadimethreneブロマイド）を追加して、周りの20から40パーセントの感染（ここでは2ミリリットル）を得、以前に収集されたウイルス上清を追加します。
注：ソート任意subpopulatを増幅することを可能にするようにMOIまたは感染の割合は、主に任意である細胞のイオン。明らかに、感染のより高いレートが容易になり、増幅のプロセスをスピードアップ。 - 32℃で120分間1500×gで吊りバケットローターで遠心分離によって細胞を形質導入。インキュベーション前に新鮮な培地で非接着細胞を懸濁します。接着細胞の場合は、新鮮な培地24時間後伝達に交換してください。
注：これは、波及回避するために、パラフィルムで遠心分離に先立って、プレートをシールすることをお勧めします。遺伝的にバーコードのセルダイバーシティを増加させるために、（ステップ1.4から得られた）異なる蛍光タンパク質を担持するウイルス粒子を細胞に形質導入する。蛍光マーカーを選択するとき、彼らは計装と互換性があり、それらが識別可能な蛍光パラメータを持っていることを確認してください。
遺伝的にバーコード細胞の選択および増幅
- 形質導入の割合率を定量するために、フローサイトメトリーにより、少なくとも72時間後に形質導入し、形質導入哺乳類細胞を分析する。陰性対照として比較可能な非形質導入細胞株を使用してください。
注：ソートが、個々のバーコードの細胞集団は、最初の形質導入の割合が高い率を精製するために使用されるように必要ではないが、増幅のプロセスをスピードアップする必要がある。 - 目的のタンパク質を発現する細胞を得るために選択した細胞ソーターを利用する。
- そのために、ゲートが適切に左右のチャンネルに設定されていることを確認。
- 負の人口は各蛍光軸に10 3の値以下になるように、そのためにはネガティブコントロールと同じナイーブ細胞株を使用し、パラメータ/チャンネル電圧を設定します。各蛍光チャンネルの陰性対照のそれの上に表示されるイベントなどの正の蛍光をゲーティングを決定します。
- 各楽器は変更になる場合がありますので注意してくださいとゲーティングを決定するための正しい電圧は、すべてのexpの中で不可欠ポジティブとネガティブコントロールを作る、それに応じて調整する必要がありますerimentalセットアップ。
- この実験における蛍光検出のためにtdのトマトのためのeGFPのためのFITCチャネル（502ロングパスフィルタによって進行530/30バンドパスフィルタ）、PEチャネル（556ロングパスフィルタによって進行585/42バンドパスフィルタ）を使用するE2クリムゾンため、及びAPCチャネル（20分の660バンドパスフィルタ）。
注：E2クリムゾンが633nmのレーザーによって励起されながら488nmのレーザーのeGFPおよびtdのトマトを励起する。
- この実験における蛍光検出のためにtdのトマトのためのeGFPのためのFITCチャネル（502ロングパスフィルタによって進行530/30バンドパスフィルタ）、PEチャネル（556ロングパスフィルタによって進行585/42バンドパスフィルタ）を使用するE2クリムゾンため、及びAPCチャネル（20分の660バンドパスフィルタ）。
- そのために、ゲートが適切に左右のチャンネルに設定されていることを確認。
- 100パーセントFCSの1ミリリットルと並びに15ミリリットルコニカルチューブ。
NOTE：一つは、直接個々のクローン（下記参照）のようなものを進めることができるように、蛍光細胞集団を選別する工程が必須ではない。選ばれた蛍光に基づいてタイトな集団をソートする個々のクローンの将来の選択のためのバックアップ集団を保証します。細胞の大集団が簡単に凍結され、その後、後の段階で解凍し、増幅することができるしながら、個々の細胞が倍で成長することが困難であることに留意してください。 - SP5分間32℃で524グラムで吊りバケットローター遠心機でソートされた集団ダウンで細胞をペレットに。再懸濁細胞集密度が少なくとも2日間増殖および分裂を可能にするために60％以下になるように、新鮮な培地、および再プレート細胞1ml中。
- 例えば、6ウェルプレート中のウェルあたり2mlの培地で約3×10 5細胞を6cmプレート中の培地2ml中で2×10 6細胞でプレート接着細胞。 （必要な場合、または指定した任意の媒体）非接着細胞用接着細胞およびRPMIためのDMEMを使用してください。増幅を可能にするために、数日間37℃のインキュベーター中で平板培養した細胞を配置します。
3.異なる強度での遺伝的にバーコード細胞のクローン集団を得る
- もともと形質導入細胞からクローン集団を取得し（ステップ1.7）、またはソートされた人口（ステップ2.3）から。
注：これは、すべての細胞の中で蛍光タンパク質発現の同等または類似のレベルを確保する集団内の（最大40％の平均蛍光強度の小さいCVとの緊密な集団）。- その目的のために、自動細胞沈着ユニット（ACDU）を有する96ウェルプレート中に並べ、単セル。興味のある集団に応じてソートするためのゲートを設定します。確認ゲートは、異なる蛍光強度でセルを選択する際に識別可能な集団を得るために離れて、少なくとも1対数スケールを設定している。ここに示す手順については、ステップ2.2で説明した1のように設定、実験サイトメトリ同じフローを使用しています。
- 少なくとも2週間、37℃のインキュベーター内の個々のクローンを増幅する。増幅の工程を経て成長した集団は、複数の個々の細胞から発生していないことを確認するために顕微鏡下で細胞を分析する。
注：ソーターは、平均してウェル当たり1セルを配置して、いくつかのウェルはまったく任意のセルを持っていない可能性がありながら、他の人が複数あることを覚えておいてください。- POことを確認するために、pulationは、1つの細胞から生じる、プレートと非常に穏やかである、ピペッティングにより井戸を乱すことはありません。顕微鏡下で、ウェルによって、プレートを観察します。
注：個々の細胞は時間にそれらが容易に認識できるであろう除し始めると、識別することは困難かもしれないが。 - エッジに沿って、多くの場合、細胞の塊」があることに注意してください。複数のクローン集団を観察することができるこれらのウェルを破棄し、1タイトな人口を持つものを残し。
注：それは増幅のためのより大きなプレートにそれらを転送することをお勧めします。
- POことを確認するために、pulationは、1つの細胞から生じる、プレートと非常に穏やかである、ピペッティングにより井戸を乱すことはありません。顕微鏡下で、ウェルによって、プレートを観察します。
- フローサイトメトリーによってそれらを分析することによって、推定上のクローン集団をスクリーニングする。実験のセットアップサイトメトリ同じ流れを利用し、陰性対照と比較します。
- サンプルの唯一の割合を分析し、バックアップとして残りを保つ。人口の平均強度と気密性に基づいて、最もはっきりと独立した集団を選択してください。必要に応じてそれらを増幅またはで株式を凍結より長い時間液体窒素の短い期間のために-80℃で20％グリセロールを含む培地を凍結する。
注：「本当の」クローン集団は、非常にタイトな蛍光パターンを持っている必要があることを覚えておいてください。
- サンプルの唯一の割合を分析し、バックアップとして残りを保つ。人口の平均強度と気密性に基づいて、最もはっきりと独立した集団を選択してください。必要に応じてそれらを増幅またはで株式を凍結より長い時間液体窒素の短い期間のために-80℃で20％グリセロールを含む培地を凍結する。
4.（HTS）のハイスループットスクリーニングのための多重化機能を確認してください
- さらに、多重化フォーマットで利用できるように、必要な数の異なるクローン集団を組み合わせる。識別可能な吸収/発光スペクトルおよび/または異なる強度を有するクローンを選択してください。 96ウェルプレートフォーマットをHTSに適している、使用される場合、ウェル当たり200μl中50,000個の細胞を播種する。
注：細胞の数はあくまでも目安であり、細胞型に基づいて変更される可能性があり、それが付着しているか否かということを覚えておいてください。 - 独立した確立された蛍光細胞株のそれぞれは、互いに区別できることを保証するために、フローサイトメトリーを用いて試料を分析する。分析の前に、負の準備単色パラメータと補正値を設定するように制御する。
注：明瞭にそれらを可能にする混合集団を区別するために、パラメータの設定は、さらに、多重化フォーマットで利用される。
5.選択した生物学的応用に遺伝的にバーコード付き細胞株を適応
- Stolp ら 、ここで説明したように、任意のアッセイ要素を含むウイルス粒子を確立し、遺伝的バーコードの細胞株を形質導入。、2013 59。選択したアッセイは、追加および識別可能な蛍光チャネルを占有する必要があることを覚えているので、それが適切なバーコード化細胞株に転送される。
注：各バーコード細胞株は、異なるアッセイを負担することができます。 - アッセイの要素を含むもののソート遺伝的に蛍光バーコード細胞。
注：アッセイ要素はfの（融合または内部リボソーム侵入部位を介して）タグまたは蛍光タンパク質に結合操作することができるまたはウェスタンブロッティングを通じて直接的な検出は、フローサイトメトリーまたは顕微鏡。このプロトコルで利用されるシステムは、HA単独エピトープ表面発現に依存している、または追加のFLAGエピトープ発現と。- HAとAPC-、蛍光結合した抗体を用いたアッセイを含むクローン集団を染色する。その後、抗FLAGおよびFITC結合抗体染色とのクローン集団を分析。
- アッセイをバックトラッキングするには明確な遺伝的にバーコードの細胞株は区別することができる適切なチャネルで集団を、分析したり、「復号」。ここで、tdはトマトの検出のためのPEチャンネルで分析することにより、基板の性質を復号する。
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Representative Results
多重蛍光は、遺伝的に、個々のクローン集団が生成された後にのみ達成することができる生物学的用途の目的のために細胞をバーコード。バーコードの集団は最小限のスペクトルの重なりとの明確な異なる蛍光特性を持っているとき多重化は最も効果的である。哺乳類SupT1細胞のクローン集団を図1に示す例では、mCherryをシアノ蛍光タンパク質（CFP）とバーコードの細胞は容易に個々の蛍光特性を損なうことなく、同時に分析することができることを示している。この行列は、このようにまだ追加の利用可能なチャネルにおける読み出しとの多重化の生物学的用途のために使用可能である蛍光遺伝子組バーコード細胞のパネルを例示している。そのようなパネルを得るためにはそれが原因挿入EFへの集団内の蛍光強度の可変範囲につながるレトロウイルス技術の本質を、覚えておくことが重要ですfectsおよび/ またはMOI。 図2のいずれか一方または強度の広い範囲（左パネル）における蛍光タンパク質の両方を発現する細胞におけるトマトまたはE2クリムゾン結果をtdとのいずれかを含むウイルス粒子を哺乳動物細胞の最初の形質導入を示している。選択ゲート制御ボックス（中パネル）に示すように、96ウェルプレート中に単一細胞の選別は、一つの拡張（右パネル）は、以下のタイトクローン集団を得ることを可能にする。タイトな集団は、平均蛍光強度の30〜40％、通常は、細胞型に応じて範囲であり得る小さなCVを有すると定義されるべきである。 図2はまた、には、さらにつだけの蛍光のマトリックスと遺伝的にバーコードの集団の数を増やすことを示しているタンパク質は、1つはまた、蛍光強度を利用することができる。一般的に、個体群間の平均蛍光強度のログ偏差は、ソートやamplifica互いに下記より適切な分離を実現するのに適しているる。 Tdはトマトは中、高の異なる強度、の2集団は、単一の強度でE2クリムゾンとの多重化のために入手したこの特徴を、説明するために示す例では、選択されました。
多重化は、同時に多数の試料の分析を容易にし、マスクされた集団をデコードする能力のための強力なツールである。多重化を増強することであれば、分光特性が互いに干渉しないように、そのようなeGFPをまだ第三蛍光タンパク質を用いて達成することができる。 図3に示される実験手順にtdのトマトとE2クリムゾンで得られた6集団のパネルは、eGFPを用いて多重化を増加させるために利用された。レトロウイルス技術は、行列のいずれかで表される集団のeGFPを転送するために使用した。 eGFPのチャネルで観察すると、非緑色ナイーブ6集団マトリックス（ 図3の左上のパネル）のeGFP-形質導入と区別がつかない人口マトリックス（ 図3の左下のパネル）。重要なことは、パネルが元の遺伝子バーコードによって占有チャネルに分析することができる（トマトおよびE2クリムゾンをtd）。 （集団の中間パネルで7-12で集団1-6を比較すると、 図3）、これらのチャネルで区別でき、一方、ヒストグラムに示されるように、個々の集団は、eGFPのチャネルで分析し、復号またはバック追跡することができる（右パネルで図3）。右の補償が可能スペクトルの重なりを調整するために適用されていない場合、形質導入、選択、ソート、および増幅の工程を繰り返す非占有チャネルを利用して後に無駄である。集団1、2、3（非緑）、7、8、9（緑）のeGFPで分析し、トマトチャネルをtdとする場合には、これを証明するために、個体群7および8は、（ 図4の左パネル）を区別することが困難である。これは、負の詐欺としてナイーブ細胞（人口1）を選択する必要があるコントロール計装のパラメータを設定することができるように。特にスペクトル的にオーバーラップする蛍光体で、任意の行列を解析する場合には、単一のカラーコントロールは正しい補正値を決定するために使用されることが必須である。 図4集団2または3の分析、および図7に優れた真の二重陽性（集団8および9）である集団を定義することができ、この目的を果たす。
右の楽器を持つ右の蛍光チャネルで分析した場合、彼らのbiosignatureによって定義されるような蛍光マーカーとの遺伝的にバーコード細胞が自分自身のアイデンティティを維持する。生物学的用途のために利用されない限りしかし、biosignatureは単に追加の個々のプロパティになります。多重蛍光遺伝子バーコードのパワーを証明するために、我々は、蛍光バーコード哺乳動物細胞株の一部に、創薬のための我々の以前に開発されたアッセイの1つを導入することを決めた。そうすることによって、fluorescENT遺伝的バーコードは、1つのサンプル中の3つのアッセイを達成するために利用された。この手順では、タンパク質分解のための3つの推定上のウイルスの基板のうちの1つを含む足場タンパク質は、遺伝的にバーコードのセルに移した。アッセイでは、切断は、細胞表面上のFLAGエピトープの損失（ 図5B）によって明らかにされる。対照的に、FLAG表面染色は、切断がないことを表す。図5は 、3つの異なる基質の分析結果を示す図である。 HIV-1エンベロープ野生型（のEnv重量）、HIV-1エンベロープ変異体（のEnv MUT）、およびデング熱ウイルス（DENV）のprM。それらの各々は、ナイーブ、3バーコードの細胞株の1に導入され、異なる強度でtdのトマトを用いた2人（中高; 図5A）した。 FLAG表面発現のための染色は、それぞれのバーコードに基づいて、切断された基質のどの明らかにする。緑-FIに見られるように例では唯一、HIV EnvポリMUTは、FLAGタグ（正、以下の染色）を保持TCチャンネル（ 図5C、右下のパネル）。アッセイの分析は、このように独立して、元のバーコードを実行することができ、さらに異なる集団をデコードし、バックトラックするために利用する。多重化のこの方法は、この目的の生物学的読み出しのために予約追加のチャネルに依存している。
図1：多重バーコード遺伝子操作などmCherryを、CFPまたは両方（左パネル）などの異なる蛍光タンパク質を用いたバーコードの個々の集団は、混合を分析し、フローサイトメトリーを介して、それぞれのチャネルにおいて（右パネル）を復号することができる。 Smurthwaite、C. ら、2014年58から適応。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ソートとバーコードのセルの増幅哺乳動物細胞は、tdのトマトまたはE2-クリムゾン（左パネル）のいずれかを含有するウイルス粒子の形質導入の48時間後に分析した。ゲートは、次に/アウトE2-クリムゾン（中央パネル）で、異なる強度でtdのトマトを発現する細胞を含むことをソートするために設定されている。種類からクローンを。6識別可能な個体群（右パネル）の行列を生成するために増幅され、再分析した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：復号がマスクされた集団を明らかに行列。図2に得られた6集団の（トマトおよび/ またはE2-クリムゾンをtd）さらに、eGFPのような付加的な蛍光タンパク質を発現するように操作することができる。 eGFPのチャンネル（左パネル）で分析した（A）元の行列は、負であり、6集団は互いに区別できない。ヒストグラム（右パネル）に示すように、6つの集団の各々は、独立して、eGFPのチャネルで分析することができる。現在でeGFPを発現する（B）同行列は、今では緑の蛍光特性を明らかにし、Aのように分析した。 Smurthwaite、C. ら、2014年58から適応。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：報酬が正しい分離を確実に元々 tdはトマトおよび/ またはeGFP発現（左パネル）と共に分析したとき（集団7,8）が正しく分離できずに基づいて選択された集団の一部をこれらのチャネルのための適切な補償が調整されていない限り（右。パネル）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：アッセイを選択したためにさらなる適応のためのバーコードのセルの選択（A）の選択と選択の検定への適応。。遺伝的に異なる強度でtdのトマト（左上パネル）バーコードの集団は、生物学的用途のために使用した。集団の各々は、さらに切断をモニターするアッセイを含むように操作されたしかし、別の基板のそれぞれの（右上パネル）。 （B）アッセイの描写。負のFLAGの汚れが切断を示している肯定フラグ染色は切断の欠如を示している。 FLAG染色以下のアッセイの（C）の解析。混合集団は、FITCチャネル（左パネル）におけるTDトマトのバーコードが、区別できないに基づいて識別可能である。 FLAG-FITC抗体で染色した場合には、唯一つの集団は、FLAG陽性である。復号化は、この集団がHIVのEnv MUT基板（右パネル）を有することを、遺伝バーコードに基づいて、明らかにしている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、2つのよく確立された手順がまとめられました。レトロウイルス技術、フローサイトメトリーを用いて蛍光タンパク質を検出することにより遺伝子工学。ユニークな細胞株の生産のための蛍光タンパク質ベースの遺伝的バーコードは、多重化されたアプリケーションのための堅牢かつ簡単な方法を提供します。レトロウイルス技術による遺伝子操作されたバーコード細胞を生成する、最初は長いプロセスですが、一つは、一度、電池材料の信頼性と安定した供給源を確立し、取得することができます。この技術の性質は、一貫して、自分の本当の識別可能なbiosignatureなって安定した蛍光特性を持つ遺伝的に操作された細胞株を生成します。
接着性および非接着細胞タイプの両方が、それらの物理的吸光/発光スペクトルに基づいて、容易に識別可能である蛍光タンパク質を利用してバーコードすることができる。これらには、そのようなCFP、mCherryをなどのタンパク質に限定されるものではない、E2クリムゾンとTDトマト。遺伝的にそれらの識別可能な蛍光タンパク質とバーコードと、それらは細胞集団のパネルを製造するために組み合わせることができる。重要なことは、パネルが正確な遺伝子型のメイクアップで細胞集団が含まれていますが、唯一のそれらの蛍光特性によって区別。このように、これらのパネルは、非常に高いスループット能力を高めること、多重化アプリケーションに最適である。
によりMOIの違いと相まって、宿主ゲノムへのレトロウイルス粒子の異なる挿入嗜好に、運ば特定の蛍光タンパク質遺伝子からの可変の蛍光強度が期待される。固有の蛍光遺伝子を有する遺伝子操作された集団の分析は、このように蛍光強度に基づいて定義することができる発現プロファイルの範囲を検出する。この示差的発現プロフィールは、互いにスペクトル的に区別される集団を作成するために利用することができる。一つは、このようにコンビ缶実験計画に適合するように、蛍光強度と蛍光マーカーの選択ね。ここで、E2クリムゾンおよびまたはeGFPをなしtdのトマト、二つの6集団パネルを含む4,6、および12集団の行列は、示されている。理論的には、これはさらに3つの異なる蛍光タンパク質の集団を作成するだけでなく、eGFPの異なる強度で拡張することができる。それに関連する異なる強度のそれぞれ。前述のように分離が実際に達成できることを保証するために、蛍光タンパク質を選択する際に、考慮に注意すべきである。選択されたタンパク質は、異なる吸光および発光スペクトルを有するべきである。 2スペクトル的に区別できるが、同様の蛍光タンパク質を使用する場合しかし、補償が適用されるべきである。異なるフルオロフォアまたは蛍光タンパク質間の発光/吸光度スペクトルの物理的な分離を可能にする重要なことには、適切な補償は、適切な単色コントロールの使用のために達成されるフローサイトメトリーを介して検出する。
少ない蛍光タンパク質が、強度の多様性を悪用による多重化は、その後さらに興味のある生物学的な適用のために活用することができる追加のチャネルを解放します。これは、実験設定の柔軟性を高め、使用される蛍光マーカーの組合せの選択を簡素化することができる。例えば、 図5に示されている多重アッセイは、FITCに結 合され、この場合、抗体染色に依存している。のみPEチャネルは、遺伝バーコードによって占有されているように、適切な器具類および/または抗体の利用可能性に基づいて行うことができる決定を、一方はFITC標識抗体を利用することができ、あるいは逆に、APC結合。
流れの分野で技術の成果は、フローサイトメトリー、顕微鏡または組み合わせた方法論が印象的ですが、ボトルネックは、生物学的用途およびHTSのために利用可能な電池技術のようです。レトロウイルスハイテク蛍光タンパク質の拡大数と相まってテクノロジーは、このクエリに答えるためにマージすることができます。蛍光遺伝子バーコードが大幅に順番に、細胞ベースのアッセイのHTS機能を拡張するための増大する必要性を満たす多重化を容易にする。遺伝的バーコードは、生物学的用途および薬物スクリーニングのためのハイスループット方法論と結合細胞ベースのアッセイに効果的な堅牢性、コスト、および簡単な方法をもたらす。 3集団のパネルを用いたものではなく、3つの画面を行う力が有益コストと時間関連意味を有する。フローサイトメトリー、高コンテンツイメージングおよびフローサイトメトリーに結合された顕微鏡で成長している汎用性、蛍光性の遺伝的バーコードは、アッセイ開発のために一貫して信頼性の高いツールとなります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
私たちは、レトロウイルス粒子の生産のためのフェニックスGPパッケージング細胞株を提供するためにスタンフォード大学から博士ギャリーノーランに感謝したいと思います。私たちは、TDトマトを提供するために、カリフォルニア州サンディエゴの大学の博士ロジャーツィンに感謝。我々はまた、彼らのサービスと助けをサンディエゴ州立大学フローサイトメトリーコアファシリティに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
References
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