Abstract
Hipoksik-iskemik ensefalopati (HİE) neden Doğum asfiksi, dünya çapında 0.660.000 ölüm her yıl, dünyanın en 2,9 milyon neonatal ölümlerin yaklaşık dörtte oluşturuyor. HİE hayvan modelleri HIE patofizyoloji anlaşılmasına katkıda bulunmuştur ve bağlı perinatal asfiksi beyin hasarı meydana dinamik bir süreç sermiştir. Bu nedenle, hayvan çalışmaları taciz sonrası tedavi stratejileri için bir zaman penceresi sürmüşlerdir. Hipotermi pdiglet modellerinde HIE için bir tedavi olarak test edilmiştir ve daha sonra, klinik testlerde de etkili olmuştur. Modelin Varyasyonları adjuvan nöro-koruyucu yöntemler ve ksenon ve melatoninin domuz yavrusu çalışmaları çalışmada uygulanmıştır klinik faz yol açmıştır I ve II çalışmalarda 1,2. domuz yavrusu HİE modeli daha yenidoğan resuscitation- ve hemodinamik çalışmalar hem de hücresel seviyede serebral hipoksi araştırmalarda kullanılır. Bununla birlikte, teknik olarak zorprotokolde modeli ve varyasyonları ya çok hafif ya da çok şiddetli beyin yaralanmaya neden olabilir. Bu yazıda, yenidoğan HIE istikrarlı bir domuz yavrusu modelinin kurulması için gerekli teknik prosedürleri göstermektedir. İlk olarak, yenidoğan piglet (<24 saat eski, ortanca ağırlık 1500 gr), anestezi entübe ve yenidoğan yoğun bakım ünitesinde bulunan kıyaslanabilir bir kurulumda izlenir. Küresel hipoksi-iskemi küresel hipoksi, hipotansiyon ile iskemi ve serebral hipoksi gösteren düz bir iz genlik entegre EEG (aEEG) ulaşmak için inspirasyon oksijen fraksiyonu düşürerek indüklenir. Hayatta kalma aEEG tepki ve kan basıncına göre oksijen ayarlayarak teşvik edilmektedir. Beyin hasarı 72 saat sonra histopatolojik ve manyetik rezonans görüntüleme ile ölçülür.
Introduction
Perinatal asfiksi Hipoksik-iskemik ensefalopati (HİE) ile ilişkili akut ve sıklıkla öngörülemeyen bir durumdur. Bu protokolün genel amacı, perinatal hipoksik iskemik ensefalopati bir domuz yavrusu hayatta kalma modeli ortaya koymaktır. Bu model yenidoğan beyin üzerinde ve kan, beyin omurilik sıvısı ve idrar gibi vücut sıvılarında nöropatolojisi deneysel tedaviler, manyetik rezonans görüntüleme ve spektroskopi (MRG ve MRS) ve biyobelirteçlerin hipoksi-iskemi çeşitli derecelerde etkisini araştırmak için kullanılabilir . modeli aynı zamanda küresel hipoksi-iskemi etkilenen bütün bunlar kardiyovasküler sistemi, solunum sistemi, böbrek ve karaciğer, soruşturma için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
Perinatal asfiksi tehlikeye oksijen kaynağı intrapartum veya hemen doğum sonrası dönemde sonucudur. İntrapartum hipoksik olaylar dünyanın 2.9 değirmen yaklaşık dörtte, dünya çapında 0.660.000 ölüm her yıl için hesap2012 3 iyon neonatal ölümler. 2010 1,15 milyon bebeklerde doğum asfiksi 4 Aşağıdaki neonatal ensefalopati geliştiği tahmin edilmektedir. HIE gebelik 34 haftadan sonra doğan bebeklerde ensefalopati olarak tanımlanan sanayileşmiş dünyada 1-3 / 1000 canlı doğumda 5 oluşur ve 8.5 / 1000 canlı doğumda kadar gelişmekte olan ülkelerde 4. ölüm riski% 10-60 olduğunu ve hayatta kalanların% 30-100 6,7 nörolojik handikap riski. 50200000 sakatlık ayarlanmış yaşam yılları (DALY) intrapartum hipoksik olaylar 4 atfedilir. Halen HIE için destekleyici başka tek tedavi sonrası hipoksik hipotermi olduğunu. Böylece, tanı yöntemleri ve tedavi stratejileri gelişmeler HIE 8 yönetimini geliştirmek için gereklidir.
Perinatal asfiksi ve neonatal beyin hasarı yönetiminde sonrası prognozu gelişmeler altta yatan hastalık mekanizmaları bilgisini genişleterek dayalı bird olası tedaviler. Farklı klinik olaylar HİE yol açabilir ve tek bir doğumevinde insidans düşük 5 olarak HIE hayvan modelleri özellikle yararlıdır. Prognostik ve tanılama araçları ve tedavi stratejileri, yeni test ederken biyolojik çeşitliliği etkisi minimize edilebileceği bir deney düzeneği, esastır. Bir hayvan modeli böylece uyarılan yaralanma ve hastalık ve İt's sonucu 9 katılan dinamik bir süreç altında yatan patolojik mekanizmaların anlaşılmasına katkıda, mümkün olduğunca yakından klinik durum yaklaştığı gerekir. Yenidoğan HIE hayvan modelleri kemirgenler, kuzu, domuz da dahil olmak üzere türlerin bir dizi ihtiva ederler. Buna karşılık, yeni doğmuş domuz yavrusu teslimat 11,12 zamanında boyutu ile ilgili olarak, kalp-damar sistemi 10 ve beyin vadeli insan bebeğe daha fazla benzerliği vardır. Piglet modelinde İzleme, enstrümantasyon ve sonuç değerlendirme tha benzerHİE ile bebeklerin klinik bakımda kullanılan t. Bu duruma göre, bu modelden yenidoğan bakım çevrilmesinden yüksek derecede vardır.
Perinatal hipoksi ve HIE domuz yavrusu modelleri çok grup tarafından kullanılan ve alanda 13 bir dizi farklılık göstermektedir. Deneyin amacına göre, çok dikkat ilaçların seçimi ödenmelidir, hipoksi-iskemi, hakaret süresini ve şiddetini, post-hakaret resüsitasyon ve bakımı, ve sonuçları değerlendirme kontrol yöntemi uyarma yöntemi. Randomize bir çalışma tasarımı her zaman girişimsel çalışmalarda kullanılması gereken yanlılığı önlemek için.
hipoksik iskemik yaralanma uyaran uygulanacak yöntem önemlidir. HİE giden küresel hipoksi sıklıkla beyin, kalp, akciğerler, böbrek ve karaciğer ile ilgili çoklu organ yetmezliği ile sonuçlanır. Değerlendirilen sonuçlarına göre, HIE modelleri fokal iskemi, örneğin güveniyor ziyade küresel hipoksi ve iskemi dayanmalıdır., Arabanın ligasyonu ileotid arterler 14. Ortalama kan basıncı> 40 mm Hg 2 korurken yeni bir kağıt hipoksi kombinasyonu (FiO 2% 12) ve karotid arter sıkıştırma uyguladı. Başka bir grup negatif baz fazlalığı> 20 mmol / L kadar% 8 O 2 küresel hipoksi kaynaklı veya arteriyel kan basıncı (MABP) <15 mm Hg ortalama ve 4 saat 15 de hayvanların kurban. Hipoksi aynı zamanda kardiyak output ile titre edilmiştir MABP (bazal% 30-40) ve arteriyel pH (6,95-7,05), 16 (30-35 mm Hg).
Bu raporda sunulan benzer aEEG bastırma ile titre küresel hipoksi-iskemi, modelleri elektrofizyolojik, klinik olarak ensefalopati gösterdi ve oksijensiz dönem bebek 17,18 bulunan durumuna nöropatolojik karşılaştırılabilir olması.
indüklenen HIE derecesi önemlidir. HIE yararlı bir hayvan modeli, aynı zamanda, yeni dia test edilmesi için izin vermelidirusul ve tedavi seçenekleri gnostik. Bunu sağlamak için, modeller, yeni tedaviler değerlendirirken az alakalı olacağını çok az veya hiç tedavi potansiyeline sahip ciddi beyin hasarı gibi tedavi potansiyel var ılımlı HIE neden olmalıdır. Hipoksiye tolerans testi hayvanlar arasında önemli oranda değişmektedir. Önceki çalışmalar daha tutarlı bir beyin hasarı elde edilebileceğini göstermiştir ve daha fazla hayvan genlik entegre elektroensefalografi (aEEG) tarafından değerlendirilir her Piglet serebral yanıta göre uyarılan hipoksi bireyselleştirmekte ziyade boyunca bir dizi FiO 2 değeri kullanılarak 17,19 hayatta olduğunu hipoksik olayı. aEEG bastırma süresi 45 dakika aEEG bastırma <artmaktadır 20 dk aEEG bastırma ve şiddetli nöbetler> az sayıdaki histopatolojik değişikliklerle, beyin hasarının derecesine ilişkilidir. HİE için nöroprotektif tedavilerin bir yeni yorum davranışsal sonuç ölç sağlayan yaşam modelleri için ihtiyaç tespithayvan modellerinde 20 ures.
Sunulan HIE Piglet modelinin sayısız avantajı vardır. Bu sonuç, insan fizyolojisine çevirmek için son derece muhtemeldir bir tür dayanmaktadır. AEEG Küresel hipoksi-iskemi modelleri çoklu organ yetmezliği ve hipoksi-iskemi titrasyon biyomarkerler, MR ve davranış ile ilgili zaman noktalarında değerlendirilebilir şekilde hayatta kalma klinik sonuçlarla ilgili beyin hasarı tutarlı bir derecede neden olur.
Perinatal asfiksi ve HİE Piglet modelleri HIE patofizyolojisi içine geçerli içgörü önemli katkıda değil, aynı zamanda başarılı bir sonuçta insanlarda yeni tedaviler sonucu, klinik çalışmalar öncesinde var. Piglet model çalışmaları HIE 21 için bir tedavi olarak hipotermi kurulmasında önemli bir rol oynadı ve yenidoğan resüsitasyon araştırması 22 kullanılır. Asfiksi ve HİE, bir araştırma içinde yaparken çeşitli gruplar piglet modelleri kullanmışD çalışmaları hipotermi 23, a-melanosit uyarıcı hormon 24, kalp durması 25, tirozin hidroksilaz aktivitesi 26, tekrar hipoksik maruz 27, NMDA reseptör aktivitesi 14 içerir ve yakın kızıl ötesi spektroskopi 28.
prosedür sırasında küçük ayarlamalar çok hafif ya da çok şiddetli beyin hasarı 29,2 ya sebep olabilir, bu raporda sunulan Piglet HIE modeli ile çalışmak teknik açıdan zor. Biz mevcut literatür önce yayınlanmış modeller üretmek için yeterli ayrıntı yoktu bulundu. Böylece, burada HIE çalışmaları için bu gelişmiş modeli kurmak için araştırmacıların sağlayan bu raporda bir domuz yavrusu 72 saat hayatta kalma modelinin kurulması için gerekli teknik prosedürlerin her adımını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mevcut protokol Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği tarafından onaylandı. Tüm test hayvanları prosedürler boyunca anestezi uygulandı. Bu protokolün çoğaltılması, ulusal etik ve hayvan refahı kurallarına uygun olarak yürütülen ve yerel etik komiteleri tarafından onaylanmalıdır.
1. Hayvanlar
- 2.000 gr - yaklaşık 1.500 ağırlığında Danimarkalı Landrace domuz yavrusu <24 saat eski.
2. Anestezi ve Bakım Sıvıları
- Sevofluran yönetim, alkol bezlerden, periferik damar içi kateter, lastik bant, tuzlu su ile şırıngalar, propofol (5 mg / kg) için bir maske, fentanil (10 ug / kg) ve prokain benzilpenisilin: anestezi için gerekli olan ekipman (Şekil 1) hazırlayın (15,000 IU / kg).
- Bir solunum maskesi ile% 1-2 sevofluran sunarak anestezi neden olur.
- Palpebral ve çekilme refl için değerlendirerek anestezi derinliğini değerlendirmekgiderler. Piglet derinden anestezi olduğunu zaman belli, perkütan kulak damar içine periferik intravenöz kateter yerleştirin.
- Periferik damar içi kateter açıklığını onaylamak için, steril% 0.9 tuzlu su 1-2 ml kateteri yıkayın. Propofol (5 mg / kg) ve fentanil (/ kg 10 ug) bolus enjeksiyonları uygulayın. Bolus enjeksiyon yönetimine müteakiben steril% 0.9 tuzlu su 1-2 ml kullanarak intravenöz kateter ikinci kez yıkayın.
- Iki ayrı bir şırınga infüzyon pompalarında propofol (10 mg / ml) ve fentanil (10 ug / mi) ile bir yer şırınga. Intravenöz kateter bağlı olan tek bir satır halinde infüzyon katılarak üç yollu iki şırınga pompaları iv tüpleri bağlayın. Sürekli propofol infüzyonu (4-12 mg / kg / saat) ve fentanil (10 ug / kg / st) başlatın. Sürekli infüzyon çalışan sonra, propofol ve fentanil ek bolus enjeksiyonları vermeyin.
- Sevofluran gaz ANEST durdurulmalıdır yönetimilerine.
- Antibiyotik profilaksisi için yerel kurallar uyarınca intramüsküler prokain benzilpenisilin (15,000 IU / kg) deri altından veya enjekte edilir. Günlük tekrarlayın. Video domuz yavruları im tatbikat ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir plazma konsantrasyonu ve daha uzun yarı ömür ile sonuçlandığı gösterilmiştir SC uygulamasına göstermektedir.
- Gözlerin kurumasını önlemek için göz yağlama merhem sürün. Bir cep şeklindeki açıklık oluşturmak için yavaşça alt göz kapağını aşağı çekin. Cebin içinde merhem küçük bir miktar sıkın. Kapat göz merhemi dağıtmak için. Kuruluk saatlik kontrol edin ve gerekirse yeniden uygulayın.
- % 5 dekstroz, sürekli bir infüzyon hızı / 10 ml / kg / saat% 0.45 NaCl iv başlatın. Sırasında ve hipoksi sonrasında 5 ml / kg / saat hızını azaltın. 2-10 mmol / L arasında kan şekeri düzeylerini korumak için infüzyon hızı ayarlayın.
Figuanestezi ve entübasyon 1. donatım yeniden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. Entübasyon ve Havalandırma
- Entübasyon için gerekli ekipman (Şekil 1) hazırlayın: açılması için roküronyum bromür (1 mg / kg) kas gevşemesi için, bir halat sapan (Şekil 1'de gösterildiği gibi aynı 4 mm naylon halat iki ucunu kravat birlikte bir daire oluşturacak şekilde) ağız, pamuklu bir düz bıçak Xylocaine sprey (100 mg / ml), manşon olan çeşitli büyüklükte endotrakeal tüpler, 500 mi kendinden şişen torba (3.0 mm, 2.5 mm, 2.0 mm tipleri) (torba valf bezi ve veteriner larengoskop uçlu havalandırma, manşet enflasyon ve stetoskop için 2 ml şırınga için) maske.
- Aşağıdaki adımları izleyerek entübe:
- Her taraftan boynunu destekleyen yatar pozisyonda yerleştirin piglet düz bir laringeal pas güvenlientübasyon için adaçayı.
- Sternal çentik (genellikle yaklaşık 13 cm) burun ucundan ölçerek endotrakeal tüpün uzunluğu tahmin edin.
- Üst çene etrafında Yeri halat sapan (aşağı bakan) ve açık ağzı tutmak için yukarı alt çene ve dil tutun.
- Kas gevşemesini teşvik etmek için rokuronyum bromür (1 mg / kg), iv uygulayın.
- Yukarı dilini kaldırmak için laringoskop kullanın.
- Pamuk ya da yemek borusuna retrovert veya yumuşak damak arkasında yakalanmış olabilir Piglet uzun epiglottis, ücretsiz bez uçlu kullanın.
- Aritenoid kıkırdaklar ve ses tellerinin tam görünüm sağlayan dil kökünde karşı kaldırdı epiglottis tutmak için laringoskop Advance.
- Laringeal spazmları önlemek için larinks topikal xylocaine spreyi (100 mg / ml) uygulayın.
- Ses tellerinin sayesinde endotrakeal tüp ilerletin. Dar trakea kıkırdaklarının geçişini yardımcı olmak için bir dönme hareketi kullanın. Peşin tüp maille Hesapönceden ölçülmüş mesafe rding ve manuel ventilasyon için kendi kendine şişen torba (poşet valf maske) bağlanın. Xylocaine spreyi ile endotrakeal tüpün distal 1/3 sprey entübasyon sırasında sürtünmeyi azaltmak için.
- Doğru endotrakeal tüp yerleştirme onaylamak için: nefes almada zorluk herhangi bir endikasyon için gözlemlemek, her iki akciğerde içine ikili hava girişi için dinleme göğüs ausculate, görsel endotrakeal tüpün proksimal yönünde yoğunlaşma varlığını teyit ve end tidal karbon varlığını doğrulamak kolorimetrik karbondioksit dedektörü ile veya varsa mekanik ventilatöre bağlı ekspiratuar CO 2 okuma ile dioksit. Normal end tidal karbondioksit% 5 civarında olduğunu. Bir normal görünümlü dalga ile birlikte% 2 üzerinde bir değer endotrakeal tüp trakea olduğunu teyit edecektir.
- Aspirasyonu önlemek için endotrakeal tüp şişirin. Olmalıdır Kol hava basıncı en az 25 cm iskemik hasarı engellemek için H2O çevredeki dokuya. Yerinde endotrakeal tüpü tutarak, tüpün etrafında bant parçası rüzgar, çene kapatın ve yerine tüp sabitlemek için burnu etrafında bantlama devam edin. Yavaşça yerinde kalmasını sağlamak için tüp çekin.
- Mekanik ventilatöre endotrakeal tüp bağlayın.
- Ventilatör ayarlarını yapma: hacim kontrollü ventilasyon, tidal volüm (TV): 10 ml / kg [veya tepe inspiratuar basıncı 15 cm basınç kontrollü ventilasyon ile (PIP)]. Pozitif ekspirasyon sonu basınç (PEEP): 5 cm. I: E oranı 1: 2. Solunum hızı: 35 (4.5-5.5 kPa arasındaki end-tidal CO 2 korumak için hızını ayarlamak).
4. İzleme ve Vücut Sıvısı Örnekleme
Izlemek için 2. Ekipman rakam.ank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Sürekli rektal sıcaklık ölçümü, elektrokardiyografi (EKG) elektrotlar, pulse oksimetre, jilet ve EEG elektrotları için yapışkan bant, steril yağlayıcı, sonda: izleme (Şekil 2) için gerekli ekipman hazırlayın.
- Bir arka bacak üzerine yerleştirin doygunluk probu, rektal sıcaklık probu yağlayın ve rektum içine 6 cm yerleştirin 38,5-39 ° C fizyolojik düzeyde rektal sıcaklığı korumak için havai radyant ısıtıcı ve / veya ısıtılmış şişme hava yatağı yerleştirin ve yer EKG elektrotlar.
- Derialtı iğne EEG elektrotları yerleştirilmesi için 1 cm x 1 cm alanlarını tıraş yüzüstü pozisyonda piglet yerleştirin; Her kulağın önünde tek ve sadece gözlerinin arkasında orta hatta referans elektrot. Alkollü bir bezle temizleyin elektrot sitesini, daha sonra iğne elektrot deri altına yerleştirin. Sırtüstü po yapışkan bant ve dönüş domuz yavrusu ile güvenli elektrotlarlan de.
- AEEG monitörü açın.
NOT: EEG entegre genlik üst ve alt kenar boşlukları ile yoğun bir iz oluşur. Bu modelde Alt ve üst kenar boşlukları genellikle bebeklerde görülen genellikle daha yüksektir 15-50 mV vardır. Hipoksi sırasında EKG o eser yanlış aEEG iz yükseltebilir, dikkat etmek önemlidir. Bolus ilaçlar (propofol veya fentanil) da geçici aEEG iz baskılayabilir ve deney sırasında mümkünse kaçınılmalıdır. Ilaç ve klinik olayların İdaresi aEEG izi yorumlanmasını kolaylaştırmak için işaretlenmiş olmalıdır.
- Steril eldiven, steril örtü, neşter, alkol bezlerden, steril mendil, göbek ven kateteri (5 Fr), umbilikal arter kateteri (3.5 Fr: merkezi arteriyel kan basıncı takibi ve kan örneklemesi (Şekil 3) için göbek kateterleri yerleştirmek için gerekli olan ekipman hazırlayın ), dikiş forseps, kavisli mikro forseps, makas, iğne tutucu ve sütür (setiÖrneğin, boyut 3-0), şeffaf yapışkan yama, kan örneklemesi için 5 ml şırınga.
Göbek hatları ve kan örneklemesi için 3. Ekipman rakam. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Sterilize ve göbek çevresi asmak. Mümkün olduğunca cilde yakın göbek bağını kesmek için bir neşter kullanın. Bu anestezi Piglet umbilikal damarların maruz etmezse, damarları ortaya çıkarmak için göbek cilde göbek kordonu altında 2 mm kesti. Iki küçük göbek arterler ve daha büyük bir göbek ven (Şekil 4) belirleyin.
- Arter (Şekil 4) dilate ve umbilikal arter kateter eklemek için kavisli mikro forseps kullanın(3.5 Fr). 3 x ağırlık cm Tahmin ekleme uzunluğu (kg) + 10 (otopsi renal arterlerin üzerinde inen aorta doğru yerleştirme dayalı ampirik formülü).
- İkinci 5 Fr kateter göbek ven içine 5 cm (Şekil 4) yerleştirin. Kan dönüşü ile intravasküler kateter yerleştirme doğrulayın. Göbek etrafında bir çanta-string sütür koyarak Güvenli kateterler, dikiş göbek kateterleri her etrafında biter geçmesine ve bir düğüm. Yapışkanlı örtü ile kateterler örtün.
- Önceden belirlenmiş zaman noktalarında kan örnekleri toplamak: 45 dakika hipoksik hasara 4) hipoksik saldırıdan sonra 2 st sonunda hipoksik hasara 3) içine 1) derhal hipoksi önce 2) 30 dakika. Kan örnekleri için deney diğer zaman noktaları amacına bağlı olarak seçilebilir.
- Hipoksi-iskemi (Tablo 1) yol açtığı kan gazı değişiklikleri doğrulamak için hipoksi esnasında alınan kan örneklerinden arter kan gazı analizi kullanın. Domuz yavrusu düşük hemoglobin a sahip olduğunu unutmayınt doğum ve (8 g / dL civarında) sık kan örnekleme anemik hale gelebilir. 24 saat içinde beraberlik başına en az 2 ml kan / kg vücut ağırlığı, en az 5 ml kan / kg vücut ağırlığı çekiniz ve kan örneklemesi için yerel yönergelere uygun. Anemi belirtileri hematokrit ve taşikardi azalan içerir.
- Intra-arteriyel kan basıncı izleme (MABP) devam için bir monitöre arteriyel hattı bağlayın. Sıvı ve ilaç uygulaması için venöz hattını kullanın.
4. Göbek damarları Şekil. Umbilikal ven (sağda) ve iki göbek arterler (solda) birini. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
5. hipoksi
- Izleme tamamladıktan sonra 60 dakika bekleyin. % 4 O 2 geçerek hipoksi øndükle 2 gaz karışımı. Yakından hayati parametreleri ve aEEG izlemek ve 45 dk hipoksi devam ediyor.
- AEEG iz (üst kenar boşluğu <7 mV) düz sonra, ilham oksijen fraksiyonu (FiO 2) değiştirerek oksijenasyonu ayarlayın ve Şekil 5'te gösterilen akış şemasına göre aEEG düz bir iz muhafaza yüksek FiO 2 seviyesine ortalama hava yolu basıncı. En az 10 dakika süreyle bazal% 70 altında MABP için Amaç ve alt FiO 2 gerekirse hipotansiyon ve iskemi sağlamak. Hipotansiyon tarif edilen seviyesi daha önce ilgili hipoksik iskemik beyin yaralanması meydana getirmek için diğer 19,13,30 tarafından gösterilmiştir.
- Ciddi hipotansiyon durumunda (MABP <25 mm Hg) aşağıdaki şekilde kademeli olarak tedavi: kısa bir süre için% 1-5 FiO 2 geliştirmek, tuzlu su, bolus (10 ml / kg), dopamin infüzyonu (5-20 ug / kg / dk), ve noradrenalinin (20 ng-1 ug / kg / dak) infüzyonu.
- > 10 dakika süren nöbetler halinde (klonik, tonik or miyoklonik nöbetler, genellikle fokal veya aEEG genliği ani değişiklikler) tarafından belirtildiği gibi () aşağıdaki enjeksiyon geçmeden önce 30 dakika izin ile adım adım tedavi: fenobarbital iv 20 mg / kg tekrarlayın fenobarbital iv 20 mg / kg yavaş bolus ve midazolam iv 0.5 mg / kg'dır.
- Nöbetler gelişebilir ve ilaç tedavisi ötanazi yanıt vermeyen iseniz gösterilir.
Oksijenasyonda ayarlamaları gösteren Şekil 5. hipoksi-iskemi akış şeması. Akış aEEG yanıta göre (F i O 2 ve P aw). Havayolu basıncı (P aw) Ortalama PIP / TV (düşük PIP alt P aw verir) ve solunum hızı değiştirilerek ayarlandı (düşük RR alt P aw verir). AEEG = Üst iz marjı <5 mV ve iz alt marjı> 3 uV (ortalama 4 mV) hedefleyin. HedefKalp atım hızı (KAH) => 80. Hedef ortalama arteriyel kan basıncı (MABP) = MABP> 25. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
6. 72 saat sağkalım
- Hipoksik hakaret sonra yakından piglet Monitör ve yavaş yavaş propofol ve fentanil infüzyon oranlarını azaltmak. Hayvan gönüllü nefes edildiği noktada Tüpü.
- Yaşam süresi boyunca, yoğun bakım ve izleme eğitimli personel tarafından 24 saat seyretmek ile bir hayvan tesisinde domuz yavrusu tutun. Iv glukoz infüzyonları 20 ml yönetme / saatlik 2-3 kg. Hipoksi-iskemi kısmi şişe beslenme sonrası 26-48 saat sonra başlatılabilir. Öğürme refleksi mevcut değilse trakea ve akciğerlere aspirasyon biberonla besleme yoluyla oluşabilir.
- Deney ile ilgili ise, Thoresen ve ark tarafından geliştirilen puanlama sistemi kullanılarak nörolojik durumlarını değerlendirmek., TarifOrijinal yayında 17 ayrıntı.
7. Sonuç Değerlendirmesi
- 72 saat sonra, uyutmak ve 2. bölümde açıklanan ve 3. Munkeby ark 31 ve diğerleri 2 tarafından açıklandığı gibi MR ilgili görüntüleme yöntemleri ile tarama gerçekleştirin tekrar havalandırın.
- Deneyin sonunda pentobarbitalin letal dozu ile domuz yavrusu euthanize (5 g / kg, iv).
- Deneyin amaca göre muayene için beyin hazırlayın.
- Formalin sabit doku beyin histoloji için.:. Robertson ve diğ 2 tarafından tarif edildiği gibi paraformaldehid diseksiyon ve sonrası sabitleme ardından PBS içinde% 4 paraformaldehit ile kardiyak perfüzyon, kullanım Chakkarapani ark 1 veya Liu ve diğerleri, 18 ya da beyin kaldırmak Andresen ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi ve% 4 paraformaldehid içinde bırakın. 32
- Analiz için Snap-dondurulmuş doku gerektiren (örneğin, RNAAnaliz veya enzim aktivitesi deneyleri, 33). ilgi beyin bölgelerini teşrih, beyin çıkarın ve ek dondurularak azami 1 cm'lik doku blokları sıvı azot içinde x 1 cm Munkeby ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
kaynaklı hakaret sırasında meydana beyinde hipoksi-iskemi etkileri aEEG izini kaydedilerek belgelenmiştir. Temsili aEEG izi, Şekil 6'da gösterilmiştir.
Şekil 6. Temsilcisi aEEG iz. Nedeniyle hipoksi-iskemi Düşük genlik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
hipoksi sırasında pH baz fazlalığı ve laktat uç değerler kalp hızı ve kan basıncı ile birlikte kaydedilir. Klinik Nöroloji skorlama 17 yürütülür. Düşük genlikli aEEG ve düşük pH değeri ve bağıl hipotansiyona HIE giden bir hasara 38 dakikalık bir süresi olan bir deneysel hayvana ilişkin verileri, Tablo 1 'de gösterilmiştir.
| aEEG <7uV (dakika) | boşaltım sırasında pH değeri, düşük | Hakaret sırasında baz fazlalığı düşük | Hakaret sırasında Laktat yüksek | MABP temel | Yüksek MABP | Düşük MABP | Yüksek İK | İK düşük |
| 37.5 | 6.93 | -19,80 | 19 | 48 | 72 | 33 | 219 | 162 |
Tablo 1. Temsilcisi fizyolojik veriler. AEEG 38 dakika <pH baz fazlalığı, laktat, kalp hızı (HR) ve hipoksi 45 dakika içinde kan basıncı (MABP) 7 mV aşırı değerlere sahip bir domuz yavrusu için listelenmiştir.
72 saatte MR. Kullanılan usuller bağlı yaralanma ortaya 7 hipoksik iskemik hasarı ile MR görüntüsü ağırlıklı bir T2 göstermektedir edebilir.
Aksiyel planda Şekil 7. Temsilcisi T2 ağırlıklı MR görüntüsü. T2 tartılı görüntü, 72 saat sonrası hipoksi-iskemi. Mesencephalon, pons ve medulla oblongata içinde normal sinyal yoğunluğu. Her iki yarımkürede de beyaz cevher boyunca anormal sinyal yoğunluğu Diffüz. T2 ağırlıklı MR iskemik enfarktüsü yaygın karşılık gelen lezyonlar gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
H & E boyama hematoksilen ve eozin leke görüldüğü gibi nöronal hasarı gösterir. Farklı gruplar 0-4 17 0.5 aralık ölçeği veya 45 13 maksimum yaralanma skoru ile 5 farklı beyin bölgeleri için 0-9 bir ölçekte birinin üzerine histolojik hasarın derecesini ölçülmesi için çeşitli skorlama sistemleri yayınladı.
Şekil 8. Temsilcisi histopatoloji. Hematoksilen ve eozin boyası ile Işık mikroskobu görüntüsü. Hasarlı nöronlar küçük çekirdeğe (oklar) ile eozinofilik bulunmaktadır. Görüntü 200x büyütmede ele geçirildi. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Modelden Beklenen sonuç: karşılaştırılabilir modelleri kullanarak önce yayınlanmış çalışmalar yaklaşık% 20 ölü domuz yavrusu,% 10 hayır yaralanma ve% 70 beyin hasarı 19 hayatta sonuçlandı. Bu çalışmalar bizim bulgular ile iyi bir korelasyon. Çoklu organ yaralanması 1 ile tezahür) laktat asidoz 2) anüri (böbrek hasarı) 3) hipotansiyon (iskemik kalp hasarı) ve görsel inceleme ve organların histopatolojik olarak doğrulanmış olabilir post mortem. Bu modelde, kardiyak fonksiyon bozukluğuKalp muayenesinde 18 kardiyak troponin T ve iskemik lezyonlarında artış ile ortaya konmuştur. Ensefalopati klinik belirtileri nörolojik skorlama ile miktarı ve diğerleri 17 tarafından açıklandığı gibi solunum değişiklikleri, bilinç, oryantasyon, yürüyüş, sesi, aktivite düzeyi, emme, seslendirme ve patolojik hareketlerin varlığı dahil edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nedeniyle karmaşıklığına, açıklanan model sadece akredite tesislerde uygulanabilir ve hayvan araştırmalarında deneyimli. Yerel etik komiteler tarafından onaylanması öncesinde deneylerin başlamasından alınmalı ve optimum hayvan refahı her zaman sağlanmalıdır. Model test hayvanlarının hayatta kalma dayanmaktadır gibi, steril bir ortam enfeksiyonları önlemek için invazif prosedürler esnasında muhafaza edilmesi önemlidir.
tüm anestezik ilaçların potansiyel nöro-koruyucu özelliklere varsa anestezi seçimi çok önemlidir. Daha önce yayınlanmış modelleri arasında sonuç farklılıklar, halotan ya da propofol 17,19 olarak kullanılan anestezik farklılıklar, kısmen bağlı olabilir. Anestezi ihmal edilemez gibi bu literatürde nadir değindiği bir nokta ve bu model için geçerli olacağını delil yetersizliği vardır. Bizim pragmatik yaklaşım birkaç Farkli olarak kullanmaktırmümkün olduğunca t anestezikler, o sevofluran ancak o zaman propofol ve fentanil sürekli infüzyon üzerinde kısaca kullanılır olmasıdır. Sürekli infüzyon için belirlenen limitler dahilinde kalmak değil iken bizim deneylerde ilaç bolus, geçici aEEG etkiler. Nöroprotektif tedavi test ederken önyargı bir randomize tasarımı kullanılarak önlenir.
birincil hedefi hayvan hayatta kalmasını sağlamak, aynı zamanda ederken ciddi hipoksik-iskemik hasara ılımlı ikna etmek gibi modelin en kritik adım, hipoksik iskemik hakaret kurulmasıdır. Bu HIE modelinin benzersiz kalite hayvandan hayvana hipoksiye farklı biyolojik yanıtlar uyum kabiliyetidir. Depresif aEEG (<7 uV) sonuçlanan mümkün olan en yüksek fraksiyon oksijen teslim Titrasyon, böylece maksimum nörologla ile birlikte yüksek hayatta kalma oranı sağlayarak, hipoksiye her piglet's toleransına göre ayarlamalar için izin verirical yaralanma 19. hipoksi 45 dakika boyunca düz bir iz aEEG süresi değerlendirilmesi ve hasarına optimizasyonu için histopatolojik yaralanma derecesi ile karşılaştırılmalıdır. Modeli kullanılarak Diğer araştırmacılar, benzer aEEG bastırma süresine bağlı olarak hafif ya da şiddetli hipoksik iskemik hakaret dereceli var. Bu modelde nöbetler daha önce küçük bir tedavi potansiyeli ile histopatolojik 17 beyin hasarı şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilmiştir gibi, biz hipoksi-iskemi şiddeti nöbetleri üreten değil bir seviyede öneririz.
Piglet HİE modelini kullanarak çalışmaların çoğu düşük MABP (MABP <bazal% 70) 19 10 dk sayılabilir. Bjorkman ve diğerleri. Oksijen teslim hipoksi sırasında değiştiği takdirde, beyin hasarının derecesi süresi MABP döneminde bağımsız olduğu bulunmuştur aşağıda 35 mm Hg 19 idi. Pilot deneyler mevcut HIE modeli kurarken, o sustaine ortaya gerçekleştirilenMABP Hg ağır beyin hasarı ve kalıcı düz iz aEEG ile ilişkili daha düşük 25 mm idi d hipotansiyon. Böylece, şiddetli hipotansiyon anında tepki beyin ölümü ardından yoğun beyin iskemi önlemek için dikkat edilmelidir.
Post-hipoksik dönemi de önemlidir. Bir çok önceki çalışmalar, beyin hasarı alevlenmesine bilinen,% 100 oksijen kullanımı ile çalışma hayvanlar reoxygenated var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Warm-touch-pediatric blanket | Covidien | 5030840 | |
| Adhesive Apertrue Drape | Barrier | 915447 | |
| Utility Drape (sterile) 75x80 cm | Barrier | 800530 | |
| Neoflon | BD - Luer | 391350 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 | |
| Endotracheal tube 2.5 mm | Covidien | 111-25 | |
| Endotracheal tube 3.0 mm with cuff | Unomedical | MM61110030 | |
| Endotracheal tube 3.5 mm with cuff | Unomedical | MM61110035 | |
| Anesthesia machine | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode | Cephalon | ACCE120550 | |
| ECG - electrodes | medtronic | 3010107-003 | |
| ECG-electrodes for MR | philips | ACCE120550 | |
| Arterial blood sampler - aspirator | Radiometer medical ApS | 956552 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch) | Covidien | 8888160341 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch) | Covidien | 8888160333 | |
| Suture set (size 3-0) | Covidien | 8886 623341 | |
| BD Spinal needle 0.7x38mm | BD needles | 405254 | |
| Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen | Air Liquide | made on order | |
| NeuroMonitor (CFM) system | Natus Medical Incorporated | OBM70002 |
References
- Chakkarapani, E., et al. Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs. Annals of. 68, 330-341 (2010).
- Robertson, N. J., et al. Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model. Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).
- Lawn, J. E., et al. Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival. Lancet. 384, 189-205 (2014).
- Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990. Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).
- Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early human development. 86, 329-338 (2010).
- Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants. Early human development. 25, 135-148 (1991).
- Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term. The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).
- Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy. Seminars in feta., & neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).
- Yager, J. Y., Ashwal, S. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).
- Buckley, N. M. Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development. Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early human development. 3, 79-83 (1979).
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).
- Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain research. 919, 122-131 (2001).
- LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs. Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).
- Andresen, J. H., et al. Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets. J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).
- Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Thoresen, M., et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatric research. 40, 738-748 (1996).
- Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs. Pediatric research. 70, 352-356 (2011).
- Bjorkman, S. T., et al. Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery. Brain research. 1100, 110-117 (2006).
- Robertson, N. J., et al. Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant. The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).
- Jacobs, S. E., et al. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311 (2013).
- Andresen, J. H., et al. Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine. Neonatology. 93, 36-44 (2008).
- Karlsson, M., et al. Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia. Pediatric research. 64, 74-78 (2008).
- Kovacs, J., et al. Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs. Peptides. 22, 1049-1053 (2001).
- Varvarousi, G., et al. Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model. Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).
- Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia. Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).
- Cote, A., Barter, J., Meehan, B. Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets. Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).
- Tichauer, K. M., et al. Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen. Pediatric research. 65, 301-306 (2009).
- Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest. Resuscitation. 35, 69-75 (1997).
- Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs. Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).
- Munkeby, B. H., et al. A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging. Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).
- Andresen, J. H., et al. Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart. J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).
- Munkeby, B. H., et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets. Pediatric research. 56, 783-790 (2004).
