Abstract
Förlossningsasfyxi, som orsakar hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE), står för 0.660.000 dödsfall i världen varje år, ungefär en fjärdedel av världens 2,9 miljoner neonatala dödsfall. Djurmodeller av HIE har bidragit till förståelsen av patofysiologin i HIE, och har visat att dynamisk process som förekommer i hjärnskada på grund av perinatal asfyxi. Sålunda har djurstudier föreslog en tidsfönster för post-insult behandlingsstrategier. Hypotermi har testats som en behandling för HIE i pdiglet modeller och därefter visat sig effektiv i kliniska prövningar. Variationer av modellen har tillämpats i studiet av adjunktiva neuroprotektiva metoder och Nasse studier av xenon och melatonin har lett till klinisk fas I och II studier 1,2. Den smågris HIE modellen används vidare för nyfödda resuscitation- och hemodynamiska studier samt i undersökningar av cerebral hypoxi på cellnivå. Emellertid är det en tekniskt utmanandemodell och variationer i protokollet kan leda till antingen för lätt eller för svår hjärnskada. I den här artikeln visar vi de tekniska förfaranden som är nödvändiga för att etablera en stabil smågris modell av neonatal HIE. Först nyfödda smågris (<24 timmar gammal, median vikt 1500 g) sövdes, intuberades, och övervakas i en uppställning som är jämförbar med den som finns i en neonatal intensivvårdsavdelning. Global hypoxi-ischemi induceras genom att sänka inandningssyrefraktionen att uppnå global hypoxi, ischemi genom hypotension och en platt spår amplitud integrerad EEG (AEEG) indikerar cerebral hypoxi. Överlevnad främjas genom att justera syresättning enligt AEEG respons och blodtryck. Hjärnskada kvantifieras genom histopatologi och magnetisk resonanstomografi efter 72 timmar.
Introduction
Perinatal asfyxi är en akut och ofta oförutsett tillstånd associerade med hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE). Det övergripande målet med detta protokoll är att visa en smågrisarnas överlevnad modell för perinatal hypoxisk-ischemisk encefalopati. Denna modell kan användas för att undersöka effekten av olika grader av hypoxi-ischemi på neonatal hjärnan och experimentella behandlingar på neuropatologi, magnetisk resonanstomografi och spektroskopi (MRI och MRS) och biomarkörer i kroppsvätskor, såsom blod, cerebrospinalvätska och urin . Modellen har också visat sig vara användbara för att undersöka det kardiovaskulära systemet, andningssystemet, njure och lever, vilka alla påverkas på globala hypoxi-ischemi.
Perinatal asfyxi är ett resultat av nedsatt syretillförsel intrapartal eller i dess omedelbara post-partum period. Intrapartal hypoxiska händelser står för 0.660.000 dödsfall i världen varje år, ungefär en fjärdedel av världens 2,9 million neonatala dödsfall under 2012 3. År 2010 1,15 miljoner barn uppskattades ha utvecklat neonatal encefalopati efter förlossningsasfyxi 4. HIE definieras som encefalopati hos spädbarn födda efter 34 graviditetsveckor sker i 1-3 / 1000 levande födda 5 i den industrialiserade världen och upp till 8,5 / 1000 levande födda i utvecklingsländer 4. Risken för död är 10-60%, och risken för neurologiska handikapp i överlevande 30-100% 6,7. 50.200.000 funktionshinder justerade levnadsår (DALY) tillskrivs intrapartal hypoxiska händelser 4. För närvarande är den enda behandling än stödjande för HIE är efter hypoxisk hypotermi. Således framsteg inom diagnostik och behandlingsstrategier är avgörande för att förbättra förvaltningen av HIE 8.
Förbättringar i prognosen efter perinatal asfyxi och förvaltning av neonatal hjärnskada bygger på att öka kunskapen om mekanismerna bakom sjukdoms end möjliga behandlingar. Djurmodeller av HIE är särskilt användbara som olika kliniska händelser kan leda till HIE och förekomsten i en enskild födelse centrum är låg 5. En experimentuppställning där påverkan av biologisk variation kan minimeras, är viktigt när man testar nya prognostiska och diagnostiska verktyg och behandlingsstrategier. En djurmodell bör närma den kliniska situationen så nära som möjligt och därmed bidra till förståelsen av de patologiska mekanismerna bakom den inducerade skadan och den dynamiska process som krävs i sjukdomen och det är resultatet 9. Djurmodeller av neonatal HIE har inkluderat ett antal arter, inklusive gnagare, lamm och svin. I jämförelse har det nyfödda spädgris högre likhet med en human nyfödda med avseende på storlek, hjärt-kärlsystemet 10 och hjärna mognad vid tidpunkten för leverans 11,12. Övervakning, instrumentering och utvärdering av resultatet i smågris modellen liknar that används i klinisk vård av barn med HIE. Följaktligen finns det en hög grad av översättning till vård av nyfödda från denna modell.
Smågrisar modeller av perinatal hypoxi och HIE används av många grupper och varierar i ett antal områden 13. Enligt syftet med försöket, måste uppmärksamhet ägnas åt valet av läkemedel, metod för att inducera hypoxi-ischemi, metod för att styra förolämpning varaktighet och svårighetsgrad, efter förolämpning återupplivning och omsorg, och resultatet utvärdering. För att undvika en snedvridning en randomiserad studie design bör alltid användas i interventionsstudier.
Den metod som används vid induktion av hypoxisk-ischemisk skada är viktigt. Globalt hypoxi som leder till HIE resulterar ofta i ett misslyckande i flera organ inbegriper hjärnan, hjärtat, lungorna, njurarna och levern. Beroende på resultaten utvärderas, bör modeller från HIE baseras på globala hypoxi och ischemi i stället förlita sig på fokal ischemi, t ex., Genom ligering av bilotid artärer 14. En nyligen papper appliceras en kombination av hypoxi (FiO 2 12%) och halspulsådern kompression medan det genomsnittliga arteriella blodtrycket> 40 mm Hg 2 bibehållande. En annan grupp inducerad global hypoxi med 8% O2 tills negativt basöverskott> 20 mmol / l eller genomsnittligt arteriellt blodtryck (MABP) <15 mm Hg, och avlivades djuren vid 4 h 15. Hypoxi har också titreras genom hjärtminutvolym (till 30-40% av baslinjen), MABP (till 30-35 mm Hg) och arteriell pH (6,95-7,05) 16.
Modeller av global hypoxi-ischemi titreras genom AEEG undertryckande liknande den som presenteras i denna rapport har visat encefalopati som är kliniskt, elektrofysiologiskt och neuropatologiskt jämförbar med tillstånd finns i asphyxiated sikt spädbarn 17,18.
Graden av HIE inducerad är viktigt. En användbar djurmodell för HIE måste också göra det möjligt att testa nya diagnostiska procedurer och behandlingsalternativ. För att möjliggöra detta bör modellerna inducerar måttlig HIE där det finns en behandling potential som svår hjärnskada med liten eller ingen behandling potential skulle vara mindre relevanta när man utvärderar nya behandlingar. Tolerans till hypoxi varierar kraftigt mellan försöksdjuren. Tidigare studier har visat att man kan uppnå en jämnare hjärnskada och att fler djur överlever 17,19 genom individualisering av hypoxi enligt varje Nasses cerebral svar utvärderas av amplitud integrerad elektroencefalografi (AEEG) snarare än att använda ett värde set FiO 2 hela hypoxisk händelse. Varaktigheten av AEEG undertryckande korrelerar till graden av hjärnskada, med några histopatologiska förändringar på <20 min AEEG undertryckande och allvarliga kramper ökar i> 45 min AEEG undertryckande. En nyligen genomförd granskning av neuroprotektiva behandlingar för HIE identifierat behovet av överlevnad modeller möjliggör beteendeutfallsmåttderna i djurmodeller 20.
Det finns många fördelar med det presenterade HIE Nasse modell. Den är baserad på en art där resultaten är i hög grad sannolikt att översätta till den mänskliga fysiologin. Globala hypoxi-ischemi modeller multiorgansvikt och titrering av hypoxi-ischemi genom AEEG framkallar en konsekvent grad av hjärnskada med överlevnads kliniskt relevanta resultat så att biomarkörer, MRI och beteende kan utvärderas på relevanta tidpunkter.
Nasse modeller av perinatal asfyxi och HIE har inte bara bidragit avsevärt till aktuell inblick i HIE patofysiologi, men har också framgångsrikt föregås kliniska prövningar, i slutändan resulterar i nya behandlingar hos människor. Nasse modellstudier har spelat en nyckelroll i upprättandet hypotermi som behandling för HIE 21, och används i neonatal återupplivning forskning 22. Olika grupper har använt smågris modeller när de utför forskning inom asfyxi och HIE, end studier omfattar hypotermi 23, alfa-melanocytstimulerande hormon 24, hjärtstillestånd 25, tyrosinhydroxylasaktivitet 26, upprepad hypoxisk exponering 27, NMDA-receptoraktivitet 14 och nära-infrarödspektroskopi 28.
Den smågris modell HIE presenteras i denna rapport är tekniskt utmanande att arbeta med, som mindre justeringar under loppet av förfarandet kan leda till antingen för lätt eller för svår hjärnskada 29,2. Vi fann att den befintliga litteraturen saknade tillräcklig detalj för att reproducera tidigare publicerade modeller. Således, här visar vi varje steg av de tekniska förfaranden som är nödvändiga för att upprätta en griskulting 72 timmar överlevnad modell i denna rapport, gör det möjligt för forskare att etablera denna avancerade modell för studier av HIE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det nuvarande protokollet godkändes av det danska djurförsöksInspektionen. Alla försöksdjur sövdes hela förfarandena. Reproduktion av detta protokoll skall utföras i enlighet med nationella etik och riktlinjer för djurskydd och godkännas av lokala etiska kommittéer.
1. Djur
- Danska lantras smågrisar <24 timmar gammal väger ca 1.500 - 2.000 g.
2. Anestesi och underhåll vätskor
- Förbered den utrustning som behövs för anestesi (Figur 1): En mask för Sevofluranadministration, spritkompresser, perifer venkateter, gummiband, sprutor med koksaltlösning, propofol (5 mg / kg), fentanyl (10 mikrogram / kg) och prokain bensylpenicillin (15.000 IE / kg).
- Inducera anestesi genom att leverera 1-2% sevofluran genom en andningsmask.
- Utvärdera anestesidjupet genom att bedöma för palpebral och återkallande reflexe-filer. När säker på att Nasse är djupt sövd, perkutant infoga en perifer venkateter i öronvenen.
- För att bekräfta öppenhet hos den perifera intravenös kateter, spola katetern med 1-2 ml steril 0,9% saltlösning. Administrera bolusinjektioner av propofol (5 mg / kg) och fentanyl (10 pg / kg). Efter bolusinjektion administration spola venkateter en andra gång med hjälp av 1-2 ml steril 0,9% saltlösning.
- Placera sprutor med propofol (10 mg / ml) och fentanyl (10 | ig / ml) i två separata sprutinfusionspumpar. Anslut iv rören från de två sprutpumpar till en trevägskran sammanfogning infusioner till en enda linje som är ansluten till den intravenösa katetem. Börja kontinuerlig intravenös infusion av propofol (4-12 mg / kg / h) och fentanyl (10 | ig / kg / h). När kontinuerliga infusioner kör, inte ge ytterligare bolusinjektioner av propofol och fentanyl.
- Behandlingen med den sevofluran gasen Anesthesia.
- Spruta prokain bensylpenicillin (15.000 IE / kg) subkutant eller intramuskulärt enligt lokala riktlinjer för antibiotikaprofylax. Upprepa dagligen. Videon visar subkutan administrering, som hos smågrisar har visat sig leda till högre plasmakoncentration och längre halveringstid jämfört med im administrering.
- Applicera ögon smörjmedel salva för att förhindra uttorkning av ögonen. Dra det undre ögonlocket försiktigt för att bilda en fickliknande öppning. Pressa en liten mängd salva inuti fickan. Nära ögat för att distribuera salva. Kontrollera torrhet timme och återanvända efter behov.
- Initiera en kontinuerlig hastighet infusion av 5% dextros / 0,45% NaCl-IV vid 10 ml / kg / h. Reducera hastigheten till 5 ml / kg / h under och efter hypoxi. Justera infusionshastigheten för att upprätthålla blodsockernivåer mellan 2-10 mmol / L.
Figure 1. Utrustning för anestesi och intubering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Intubation och Ventilation
- Förbered den utrustning som behövs för intubering (Figur 1): rokuroniumbromid (1 mg / kg) för muskelavslappning, ett rep sele (binda båda ändarna av samma 4 mm nylonrep tillsammans för att bilda en cirkel såsom visas i fig 1) för öppning munnen, en bomullspinne och veterinärmedicinska laryngoskopet med rakt blad, xylokain spray (100 mg / ml), olika storlek endotrakeala tuber med manschetten (storlek 3,0 mm, 2,5 mm, 2,0 mm), 500 ml självuppblåsande påse (påsventil mask) för ventilation, 2 ml spruta för manschetten inflationen, och stetoskop.
- Intuberas genom att följa stegen nedan:
- Placera Nasse i ryggläge stöder halsen från varje sida för att säkra en rak laryngeala passalvia för intubation.
- Uppskatta hur lång endotrakealtuben genom att mäta från spetsen på nosen till sternala skåran (typiskt cirka 13 cm).
- Placera rep sele runt överkäken (nedåt) och håll underkäke och tungan uppåt för att hålla munnen öppen.
- Administrera rokuroniumbromid (1 mg / kg) iv för att inducera muskelavslappning.
- Använd laryngoskop att lyfta tungan uppåt.
- Använd bomullspinne för att frigöra smågris långa struplocket, som kan vara antingen retroverted i matstrupen eller fångas bakom den mjuka gommen.
- Advance laryngoskop att hålla struplocket lyfte mot tungan basen möjliggör full utsikt över arytenoid brosk och stämband.
- Applicera xylokain spray (100 mg / ml) topiskt i struphuvudet för att förhindra laryngeala spasmer.
- Advance endotrakealtub genom stämbanden. Använd en roterande rörelse för att underlätta passage av de smala luftrör brosk. Förväg röret according till den i förväg uppmätt avstånd och ansluta till en självuppblåsande påse (påsventil mask) för manuell ventilation. För att minska friktionen under intubation spraya distala 1/3 av endotrakealtuben med xylokain spray.
- För att bekräfta rätt endotrakealtub placering: observera för någon indikation på andningssvårigheter, ausculate bröstet lyssna efter bilaterala luftfarts inträde i båda lungorna, visuellt bekräfta förekomsten av kondens i proximala aspekten av endotrakealtub, och kontrollera förekomsten av slutet tidvatten kol dioxid med en kolorimetrisk detektor koldioxid eller genom utandnings CO2 behandlingen av mekanisk ventilator om det finns. Normal Sluttidal koldioxid är cirka 5%. Ett värde över 2% tillsammans med en normal-framträdande vågform kommer att bekräfta att endotrakealtuben är i luftstrupen.
- Pumpa endotrakealtuben manschetten för att förhindra aspiration. Cuff inflationstrycket bör vara mindre än 25 cm H2O för att undvika ischemisk skada till den omgivande vävnaden. Håll endotrakealtub på plats, linda en bit tejp runt ett rör, slut käken och fortsätta tejpning runt nosen för att fästa röret på plats. Dra försiktigt på röret för att säkerställa att den hålls på plats.
- Anslut endotrakealtub till mekanisk ventilator.
- Justera ventilator inställningar: volymstyrd ventilation, tidalvolym (TV): 10 ml / kg [eller toppinandningstryck (PIP) 15 cm med tryckstyrd ventilation]. Slutexpiratorisk tryck (PEEP): 5 cm. I: E-förhållande 1: 2. Andningsfrekvens: 35 (justera hastigheten för att upprätthålla end-tidal CO2 mellan 4,5-5,5 kPa).
4. Övervakning och Body Fluid Provtagning
Figur 2. Utrustning för övervakning.ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förbered den utrustning som behövs för att övervaka (Figur 2): tejp, sterila smörjmedel, prob för kontinuerlig mätning rektal temperatur, elektrokardiogram (EKG) elektroder, pulsoximeter, rakkniv, och EEG-elektroder.
- Placera mättnads sonden på ett bakben, smörj rektal temperatursond och infoga 6 cm i ändtarmen, placera överliggande strålningsvärmare och / eller uppvärmd uppblåsbar luftmadrass för att bibehålla den rektala temperaturen vid den fysiologiska nivån av 38,5-39 ° C och plats EKG elektroder.
- Placera Nasse i liggande läge för att raka delar av 1 cm x 1 cm för placering av subkutana nålen EEG elektroder; en framför varje öra, och referenselektroden i mittlinjen strax bakom ögonen. Rengör elektrodstället med en alkoholservett, sedan in nålelektroden subkutant. Säker elektroder med tejp och retur Nasse till liggande potidpunkten.
- Slå på AEEG bildskärm.
OBS: Amplituden integrerad EEG består av en tät spår med övre och undre marginaler. Lägre och övre marginaler i den här modellen är typiskt 15-50 μV, ofta högre än den hos spädbarn. Under hypoxi är det viktigt att notera att artefakt från EKG kan falskt höja AEEG spår. Bolus läkemedel (propofol eller fentanyl) kan också övergående undertrycka AEEG spår och bör undvikas om möjligt under försöket. Administrering av läkemedel och kliniska händelser bör märkas för att underlätta tolkningen av AEEG spår.
- Förbered den utrustning som behövs för att placera navel katetrar för centrala artärblodtrycksmätning och blodprovstagning (Figur 3): sterila handskar, steril drapering, skalpell, spritkompresser, sterila våtservetter, navel venkateter (5 Fr), navelartärkateter (3,5 Fr ), sutur set med pincett, böjda mikro pincett, sax, nål hållare och sutur (t.ex. storlek 3-0), transparent lim plåster, 5 ml sprutor för blodprovstagning.
Figur 3. Utrustning för navel linjer och blodprovstagning. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
- Sterilisera och drapera området runt naveln. Använd en skalpell för att skära av navelsträngen så nära huden som möjligt. Om detta inte utsätta navelsträngen fartyg i sövda Nasse, klippa navel huden 2 mm under navelsträngen för att exponera fartygen. Identifiera de två små navel artärer och en större navelsträngsvenen (Figur 4).
- Använd böjda mikro pincett för att vidga artären (Figur 4) och sätt i navelartärkateter(3,5 Fr). Uppskattning instickslängd i cm till 3 x vikt (kg) + 10 (empirisk formel som baseras på korrekt placering i fallande aorta ovan njurartärerna på obduktion).
- Placera en andra 5 Fr kateter 5 cm i navelsträngsvenen (Figur 4). Kontrollera intravaskulär kateter placering av blod avkastning. Säkra katetrar genom att placera en handväska sträng sutur runt naveln, passera sutur slutar runt vart och ett av navel katetrar och knyt en knut. Täck katetrar med transparent lim dressing.
- Samla blodprov vid fördefinierade tidpunkter: 1) omedelbart före hypoxi, 2) 30 min in hypoxisk förolämpning 3) i slutet av 45 min hypoxisk förolämpning 4) 2 timmar efter hypoxisk förolämpning. Beroende på syftet med försöket andra tidpunkter för blodprov kan väljas.
- Använd blodgas analys från blodprover som tagits under hypoxi att kontrollera förändringar blodgaser som orsakas av hypoxi-ischemi (tabell 1). Observera att smågrisar har låg hemoglobin ent födelse (ca 8 g / dl) och kan bli anemisk från täta blodprovstagning. Dra mindre än 2 ml blod / kg kroppsvikt per oavgjort, mindre än 5 ml blod / kg kroppsvikt inom 24 timmar och följa lokala riktlinjer för blodprovstagning. Tecken på anemi inkluderar minska hematokrit och takykardi.
- Anslut arteriell linje till en monitor för fortsätter intraarteriell blodtrycksmätning (MABP). Använd venkateter för vätska och läkemedelsadministrering.
Figur 4. Umbilical fartyg. Navelvenen (höger) och en av två navelartärerna (vänster). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Hypoxi
- Vänta 60 minuter efter avslutad kontroll. Framkalla hypoxi genom att byta till en 4% O 2 N2-gas-blandningen. Övervaka vitala parametrar och AEEG nära och fortsätta hypoxi under 45 minuter.
- När AEEG spår är platt (övre marginal <7 μV), justera syresättning genom att förändra den inspirerade syrefraktionen (FiO 2) och genomsnittluftvägstrycket till den högsta FiO 2 upprätthålls ett plant spår AEEG enligt flödesschemat som visas i fig 5. Sikta på MABP under 70% av baslinjen under minst 10 minuter och om det behövs lägre FiO 2 för att säkerställa hypotension och ischemi. Den beskrivna nivå av hypotoni har tidigare visats av andra 19,13,30 att alstra relevanta hypoxisk-ischemisk hjärnskada.
- Vid allvarlig hypotension (MABP <25 mm Hg) behandlar stegvis enligt följande: kort öka FiO 2 med 1-5%, saltlösning bolusdos (10 ml / kg), infusion av dopamin (5-20 mikrogram / kg / min), och infusion av noradrenalin (20 ng-1 | j, g / kg / min).
- Vid anfall som varar> 10 min (kloniska, tonic or myokloniska anfall, typiskt fokal eller vilket indikeras av plötsliga förändringar i AEEG amplitud) behandlar stegvis med (vilket gör 30 minuter innan du fortsätter till nästa injektion): långsam bolus av fenobarbital iv 20 mg / kg, upprepa fenobarbital iv 20 mg / kg, och midazolam IV 0,5 mg / kg.
- Om kramper utvecklas och är inte svarar på läkemedelsbehandling dödshjälp indikeras.
Figur 5. Hypoxi-ischemi flödesschema. Flödesschema som visar justeringar i syresättning (F i O 2 och P aw) enligt AEEG svar. Medelluftvägstryck (P aw) justerades genom att ändra PIP / TV (lägre PIP ger lägre P aw) och andningsfrekvens (lägre RR ger lägre P aw). Target AEEG = övre marginal på spår <5 μV och lägre marginal av spår> 3 μV (genomsnitt 4 μV). Målhjärtfrekvens (HR) => 80. Mål medelarteriellt blodtryck (MABP) = MABP> 25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. 72 timmar överlevnad
- Övervaka smågris tätt efter hypoxisk förolämpning, och gradvis minska andelen infusion av propofol och fentanyl. Extubera vid den punkt där djuret andas frivilligt.
- Under överlevnadsperiod, hålla smågrisar vid en djuranläggning med 24 tim klocka av personal utbildad i intensivvård och övervakning. Administrera iv glukos infusioner 20 ml / kg 2-3 timme. Vid 26-48 timmar efter hypoxi-ischemi partiell flaskmatning kan inledas. Aspiration till luftstrupen och lungorna kan ske genom flaskmatning om kräkreflexen är inte närvarande.
- Om det är relevant för experimentet, utvärdera neurologiska status med poängsystem som utvecklats av Thoresen et al., Beskrivs idetalj i den ursprungliga publikationen 17.
7. Utfall Utvärdering
- Efter 72 timmar, bedöva och ventilera igen som beskrivs i avsnitt 2 och 3. Utför MR-undersökning med relevanta avbildningsmetoder såsom beskrivits av Munkeby et al 31 och andra 2.
- Vid slutet av experimentet euthanize smågrisar med en letal dos av pentobarbital (5 g / kg i.v.).
- Förbered hjärnan för undersökning i enlighet med målet för experimentet.
- För hjärnan histologi på formalinfixerade vävnads:.. Använda hjärtperfusion med 4% paraformaldehyd i PBS, följt av dissektion och efter fixering i paraformaldehyd såsom beskrivits av Robertson et al 2, Chakkarapani et al 1 eller Liu et al 18 eller ta bort hjärnan och fördjupa sig i 4% paraformaldehyd såsom beskrivits av Andresen et al. 32
- För analys kräver snäpp frusen vävnad (t.ex. RNAanalys eller enzymaktivitetsanalyser 33). Ta bort hjärnan, dissekera ut hjärnan områden av intresse och snap-frysa vävnads block av högst 1 cm x 1 cm i flytande kväve såsom beskrivits av Munkeby et al 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekterna av hypoxi-ischemi på hjärnan som inträffar under den inducerade insult dokumenteras genom registrering AEEG spår. En representativ AEEG kontur visas i fig 6.
Figur 6. Representativa AEEG spår. Låg amplitud på grund av hypoxi-ischemi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De extrema värden på pH, basöverskott och laktat under hypoxi registreras tillsammans med hjärtfrekvens och blodtryck. Klinisk neurologi poäng genomförs 17. Data från ett försöksdjur med en varaktighet av 38 min av låg amplitud AEEG och en förolämpning som leder till HIE med lågt pH och relativ hypotoni, visas i tabell 1.
| AEEG <7uV (min) | pH låg under förolämpning | Basöverskott låg under förolämpning | Laktat hög under förolämpning | MABP baslinje | MABP hög | MABP låg | HR hög | HR-låg |
| 37,5 | 6,93 | -19,80 | 19 | 48 | 72 | 33 | 219 | 162 |
Tabell 1. Representativa fysiologiska data. För en spädgris med 38 min av AEEG <7 μV extremvärdena för pH, basöverskott, laktat, hjärtfrekvens (HR) och blodtryck (MABP) inom 45 min av hypoxi är listade.
MRI på 72 timmar kan avslöja skador beroende på villkoren som används. Figur 7 visar en T2 viktade MRI-bild med hypoxisk-ischemisk skada.
Figur 7. Representant T2 viktade MRI bilden. T2-wighted bild i axialplanet, 72 timmar efter hypoxi-ischemi. Normal signalintensiteten inom mesencephalon, pons och förlängda märgen. Diffusa onormal signalstyrka hela den vita substansen i båda halvkloten. T2-viktad MRT visar skador som motsvarar diffusa ischemisk infarkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
H & E-färgning visar nervskada som kan ses på hematoxylin och eosin fläcken. Olika grupper har publicerat olika poängsystem för att kvantifiera graden av histologiska skada på antingen en 0,5 intervallskala av 0-4 17 eller en skala från 0-9 för 5 olika hjärnregioner med en maximal skada poäng 45 13.
Figur 8. Representativa histopatologi. Ljusmikroskopbild med hematoxylin och eosin fläcken. Skadade neuroner är eosinofil med en liten kärna (pilar). Bilden togs vid 200x förstoring. Skala bar = 50 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Förväntat utfall från modell: Tidigare publicerade studier med jämförbara modeller har resulterat i ca 20% döda smågrisar, 10% utan skador och 70% överlevande med hjärnskada 19. Dessa studier korrelerar väl med våra resultat. Multi organskada manifest från 1) laktat acidos 2) anuri (njurskada) 3) hypotension (ischemisk hjärtskada) och kan kontrolleras visuellt och histopatologi av organ efter slakt. I denna modell, hjärtsvikthar visats genom ökning av hjärt troponin T och ischemiska skador på hjärt undersökning 18. Kliniska tecken på encefalopati kan kvantifieras av neurologisk scoring och innefatta förändringar i andning, medvetande, orientering, promenader, tonen, aktivitetsnivå, suger, vokalisering och närvaron av patologiska rörelser som beskrivs av andra 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av dess komplexitet, kan den beskrivna modellen endast genomföras i anläggningar som är ackrediterade och erfarna i djurförsök. Godkännande av lokala etikkommittéer måste erhållas före initiering av experimenten, och optimal djurskydd måste garanteras vid alla tidpunkter. Eftersom modellen är baserad på överlevnaden av testdjuren, är det viktigt att en steril miljö upprätthålls under invasiva förfaranden för att förhindra infektioner.
Valet av anestesi är viktigt eftersom de flesta om inte alla anestetiska läkemedel har potentiella neuroskyddande egenskaper. Skillnader i resultat mellan tidigare publicerade modeller kan ha varit delvis beror på skillnader i bedövningsmedel som används, såsom halotan eller propofol 17,19. Detta är en punkt som sällan berörs i litteraturen, som anestesi inte kan uteslutas och det finns en brist på bevis som skulle vara tillämplig på denna modell. Vår pragmatiska metod är att använda så få different bedövningsmedel som möjligt, är att sevofluran används endast en kort stund, sedan på propofol och fentanyl är genomsyrade hela tiden. I våra experiment medicinering piller påverkar AEEG gående, samtidigt som vistas inom angivna gränser för kontinuerlig infusion inte. Vid testning av neuroprotektiva behandlingar partiskhet undviks genom att använda en randomiserad studie design.
Det mest kritiska steget i modellen är inrättandet av hypoxisk-ischemisk skada, eftersom det primära målet är att förmå en måttlig till svår hypoxisk-ischemisk skada, medan samtidigt säkerställa djurens överlevnad. Den unika kvaliteten på denna HIE modell är förmågan att tillgodose olika biologiska svar på hypoxi från djur till djur. Titrering av syre leverans till högsta möjliga fraktionen resulterar i en deprimerad AEEG (<7 μV), gör det möjligt för justeringar i enlighet med varje enskild piglet's tolerans mot hypoxi, vilket säkerställer en hög överlevnadsgrad i kombination med maximal neurological skada 19. Varaktigheten av platta spår AEEG under 45 min av hypoxi bör jämföras med graden av histopatologisk skada för utvärdering och optimering av skadornas svårighetsgrad. Andra forskare som använder modellen, har liknande graderade hypoxisk-ischemisk skada från mild till svår beroende på hur länge AEEG förtryck. Som anfall i den här modellen har tidigare visat sig korrelera med svårighetsgraden av hjärnskada på histopatologi 17 med lite behandling potential, rekommenderar vi en nivå av hypoxi-ischemi svårighetsgrad inte producerar anfall.
De flesta studier som använder smågris HIE modellen inkluderar 10 min av låg MABP (MABP <70% av baslinjen) 19. Björkman et al., fann att om syrgastillförsel varierat under hypoxi, graden av hjärnskada var oberoende av tid MABP var under 35 mm Hg 19. Pilotförsök utförs vid fastställandet av nuvarande HIE modellen, visade att sustained hypotension där MABP var lägre än 25 mm Hg var förknippad med svår hjärnskada och permanent platt spår AEEG. Således måste omedelbar reaktion på svår hypotension säkerställas för att undvika omfattande hjämischemi följt av hjärnan död.
Efter hypoxisk period är också kritisk. Många tidigare studier har reoxygenated studie djur genom användning av 100% syre, vilket är känt för att förvärra hjärnskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Warm-touch-pediatric blanket | Covidien | 5030840 | |
| Adhesive Apertrue Drape | Barrier | 915447 | |
| Utility Drape (sterile) 75x80 cm | Barrier | 800530 | |
| Neoflon | BD - Luer | 391350 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 | |
| Endotracheal tube 2.5 mm | Covidien | 111-25 | |
| Endotracheal tube 3.0 mm with cuff | Unomedical | MM61110030 | |
| Endotracheal tube 3.5 mm with cuff | Unomedical | MM61110035 | |
| Anesthesia machine | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode | Cephalon | ACCE120550 | |
| ECG - electrodes | medtronic | 3010107-003 | |
| ECG-electrodes for MR | philips | ACCE120550 | |
| Arterial blood sampler - aspirator | Radiometer medical ApS | 956552 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch) | Covidien | 8888160341 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch) | Covidien | 8888160333 | |
| Suture set (size 3-0) | Covidien | 8886 623341 | |
| BD Spinal needle 0.7x38mm | BD needles | 405254 | |
| Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen | Air Liquide | made on order | |
| NeuroMonitor (CFM) system | Natus Medical Incorporated | OBM70002 |
References
- Chakkarapani, E., et al. Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs. Annals of. 68, 330-341 (2010).
- Robertson, N. J., et al. Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model. Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).
- Lawn, J. E., et al. Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival. Lancet. 384, 189-205 (2014).
- Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990. Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).
- Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early human development. 86, 329-338 (2010).
- Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants. Early human development. 25, 135-148 (1991).
- Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term. The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).
- Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy. Seminars in feta., & neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).
- Yager, J. Y., Ashwal, S. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).
- Buckley, N. M. Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development. Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).
- Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain research. 919, 122-131 (2001).
- LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs. Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).
- Andresen, J. H., et al. Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets. J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).
- Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Thoresen, M., et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatric research. 40, 738-748 (1996).
- Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs. Pediatric research. 70, 352-356 (2011).
- Bjorkman, S. T., et al. Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery. Brain research. 1100, 110-117 (2006).
- Robertson, N. J., et al. Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant. The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).
- Jacobs, S. E., et al. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311 (2013).
- Andresen, J. H., et al. Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine. Neonatology. 93, 36-44 (2008).
- Karlsson, M., et al. Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia. Pediatric research. 64, 74-78 (2008).
- Kovacs, J., et al. Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs. Peptides. 22, 1049-1053 (2001).
- Varvarousi, G., et al. Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model. Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).
- Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia. Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).
- Cote, A., Barter, J., Meehan, B. Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets. Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).
- Tichauer, K. M., et al. Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen. Pediatric research. 65, 301-306 (2009).
- Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest. Resuscitation. 35, 69-75 (1997).
- Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs. Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).
- Munkeby, B. H., et al. A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging. Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).
- Andresen, J. H., et al. Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart. J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).
- Munkeby, B. H., et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets. Pediatric research. 56, 783-790 (2004).
