Summary
इस प्रोटोकॉल नवजात चूहों और prepubertal चूहों से अलग-अलग डिम्बग्रंथि के रोम से अंडाशय का उपयोग करते हुए, माउस डिम्बग्रंथि ऊतक के प्राथमिक संस्कृति / सह संस्कृति का वर्णन है। संस्कृति तकनीक अंडाशय पर बाह्य एजेंटों के प्रभाव की जांच की अनुमति देता है, एक अत्यधिक शारीरिक ढंग से विकास का समर्थन है, और डिम्बग्रंथि के रोम के बीच बातचीत की।
Abstract
स्तनधारी अंडाशय डिम्बग्रंथि के रोम से बना है, दैहिक granulosa कोशिकाओं से घिरा हुआ एक भी डिम्बाणुजनकोशिका से मिलकर प्रत्येक कूप, एक तहखाने झिल्ली के भीतर एक साथ संलग्न। रोम के एक परिमित पूल meiotic गिरफ्तारी में oocytes मौलिक रोम के गठन, चपटा granulosa कोशिकाओं के साथ एक निकट सहयोग के लिए फार्म जब भ्रूण के विकास के दौरान नीचे रखी है। द्वारा या शीघ्र ही जन्म के बाद, स्तनधारी अंडाशय बिंदु से आगे बढ़ रहा है कूपिक पूल में रोम की एक सतत जारी है जिसमें से मौलिक रोम के अपने जीवनकाल की आपूर्ति, होते हैं।
अंडाशय के रोम संस्कृति में एक अत्यधिक शारीरिक ढंग से बढ़ रही है, के साथ इन विट्रो में विकास के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी है। इस काम के मौलिक रोम युक्त पूरे नवजात अंडाशय की संस्कृति, और व्यक्तिगत डिम्बग्रंथि के रोम के संस्कृति, preovu के माध्यम से एक अपरिपक्व से रोम के विकास का समर्थन कर सकते हैं जो एक विधि का वर्णनlatory मंच है, जिसके बाद उनके oocytes इन विट्रो में निषेचन से गुजरना करने में सक्षम हैं। यहाँ रेखांकित काम अंडाशय बाहरी यौगिकों के लिए जोखिम से प्रभावित है कि कैसे निर्धारित करने के लिए संस्कृति सिस्टम का उपयोग करता है। हम भी बढ़ रही रोम और मौलिक रोम के गैर-बढ़ पूल के बीच होती है कि बातचीत की जांच की अनुमति देता है जो एक सह संस्कृति प्रणाली, का वर्णन है।
Introduction
स्तनधारी अंडाशय oocytes की एक महिला के जीवन की आपूर्ति, एक डिम्बग्रंथि कूप के भीतर निहित प्रत्येक से बना है। रोम विश्राम में जन्म से पहले का गठन कर रहे हैं, मौलिक चरण: कूप पूल की स्थापना की है एक बार, बढ़ती कूप पूल में मौलिक से रोम की एक सतत और क्रमिक आंदोलन है। रोम विकसित करने के लिए शुरू के रूप में वे preovulatory, या Graafian, मुकाम तक पहुंचा है, जब तक वे, प्राथमिक, माध्यमिक, preantral और फिर antral चरणों के माध्यम से विकसित करना। Preovulatory रोम से केवल oocytes निषेचित, तो अवधि के लिए भ्रूण के विकास का समर्थन करने में सक्षम पूर्ण विकास क्षमता है।
अंडाशय में लंबे समय के लिए इन विट्रो में एक अत्यधिक शारीरिक तरीके से विकसित करने के लिए जाना जाता रहा है। इस वजह से यह भीतर अपरिपक्व अवस्था से एक oocyte टी के माध्यम से (जिस पर यह अपने अर्धसूत्रीविभाजन पूरा करने में असमर्थ है प्वाइंट) का समर्थन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक डिम्बग्रंथि कूप को होने की संभावना हैवह विकासात्मक सक्षम मंच (जिस पर यह पूरी तरह से अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और कार्यकाल के लिए जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण के विकास के पूरा समर्थन कर सकते हैं बिंदु)।
इन विट्रो में अंडाशय विकास के शारीरिक प्रकृति अंडाशय संस्कृति तकनीक का व्यापक उपयोग करने के लिए प्रेरित किया है। नतीजतन, इन विट्रो तरीकों (उदाहरण के लिए कि पॉलीसिस्टिक डिम्बग्रंथि सिंड्रोम, पीसीओ का), रसायनों के संपर्क से प्रभावित हैं कैसे अंडाशय / oocytes की परीक्षा है, और भी के व्यावहारिक उद्देश्य के साथ अंडाशय विकास, डिम्बग्रंथि विकृति के नियमन की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है मौलिक डिम्बग्रंथि के रोम से fertilizable oocytes प्राप्त करने के। मानव सहित बड़े स्तनपायी, से रोम का उपयोग करते हुए संस्कृति तकनीक, बहुत हाल के वर्षों 2,3 में सुधार हुआ है, हालांकि तारीख करने के लिए, बाद केवल माउस डिम्बग्रंथि ऊतक एक का उपयोग कर हासिल किया गया है।
हम यहाँ माउस डिम्बग्रंथि ऊतक का उपयोग कर कई संस्कृति विधियों का वर्णन। पहले methoडी पूरे नवजात माउस अंडाशय का उपयोग करता है, और मौलिक रोम 4 के गठन और प्रारंभिक विकास का समर्थन करता है। दूसरी प्रणाली preovulatory चरण के लिए देर से preantral से व्यक्तिगत बरकरार डिम्बग्रंथि के रोम के विकास का समर्थन करता है; इस तकनीक का उपयोग, रोम व्यक्तिगत रूप से सुसंस्कृत, या जोड़ों 5,6 में किया जा सकता है। अंत में, हम बढ़ रही है और मौलिक डिम्बग्रंथि के रोम 7 के बीच बातचीत की जांच की अनुमति देता है कि एक विधि में पहले दो तकनीकों के संयोजन, एक सह संस्कृति प्रणाली का वर्णन।
व्यक्तिगत बरकरार डिम्बग्रंथि के रोम के संस्कृति के माध्यम से विश्लेषण कूप / अंडाशय हार्मोन उत्पादन की जांच की अनुमति देता है, जबकि कूप विकास, संस्कृति की अवधि के दौरान दैनिक कूप माप से निर्धारित किया जा करने की अनुमति देता है। इसके अलावा ऊतक विश्लेषण ऊतकीय / immunohistological विश्लेषण के लिए या उदाहरण प्राप्त करने के लिए बाद के प्रसंस्करण के लिए, संस्कृति के अंत में रोम या डिम्बग्रंथि ऊतक का एक संग्रह के द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैmRNA या प्रोटीन।
Protocol
सभी जानवर काम ब्रिटेन के गृह मंत्रालय द्वारा लाइसेंस के तहत संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार (परियोजना लाइसेंस नंबर पीपीएल 60/1726 और 60/4026) में प्रदर्शन किया गया था।
नोट: घर पशुओं एक 14 घंटा रोशनी में ब्रिटेन के कानूनी आवश्यकताओं और 10 घंटा अंधेरे photoperiod के अनुसार। जंगली प्रकार C57Bl6J चूहे, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) 8, और neuronal कोशिकाओं 9 के एक सबसेट में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के सामयिक अभिव्यक्ति के साथ Thy1-YFP चूहों की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति है कि ताउ-GFP के चूहों का उपयोग जानवरों पर आचरण प्रयोगों: दोनों ट्रांसजेनिक लाइनों एक C57Bl6J पृष्ठभूमि पर नस्ल थे।
1. काम की परिस्थितियों और साधनों की तैयारी
- बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में सभी मीडिया तैयारी, ऊतक dissections, और संस्कृति काम करते हैं: इस मीडिया के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा की आवश्यकता से बचा जाता है।
- हमेशा मीडिया / संस्कृति प्लेट्स / भ्रूण व्यंजन संतुलित करने की अनुमति देते हैंका उपयोग करने से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में कम से कम एक घंटा, (विच्छेदन मध्यम / भ्रूण व्यंजन) या 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर (मध्यम संस्कृति और प्लेट), के लिए।
- एक घंटे के आसपास के लिए गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के 0.1% समाधान में कांच pipettes लेना, और फिर सूखने के लिए छोड़ दें। सूक्ष्मता से तैयार की घुमावदार गिलास pipettes निर्माण करने के लिए, यदि आप ऐसा करने के रूप में कांच झुकने, एक लेम्प बर्नर की लौ में pipettes खींचो। पिपेट खींच लिया है, के बाद एक ग्लास कटर के साथ एक साफ काट कर। ओवन लगभग 45 मिनट के लिए 160 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ।
नोट: ये कांच pipettes की एक दुकान अंडाशय और रोम को हस्तांतरण करने की जरूरत होगी।
विच्छेदन और संस्कृति मीडिया के 2. तैयारी
- विच्छेदन मध्यम तैयार करें।
- Leibowitz l15 मध्यम और फिल्टर में 3 मिलीग्राम / एमएल बीएसए एक 0.2 माइक्रोन ताकना, 25 मिमी व्यास फिल्टर के माध्यम से बाँझ भंग।
- नवजात अंडाशय संस्कृति।
- नवजात अंडाशय संस्कृति के लिए मध्यम तैयार करने के लिए पूर्वी वायु कमान के लिए माध्यम की एक मिलीलीटर बनानेसुसंस्कृत किया जाएगा कि एच अंडाशय। 3 मिलीग्राम / α-मिनिमल आवश्यक मीडिया में मिलीलीटर बीएसए (αMEM) और फिल्टर एक बाँझ ट्यूब में एक 0.2 माइक्रोन ताकना, 13 मिमी व्यास फिल्टर के माध्यम से बाँझ भंग।
- नवजात अंडाशय संस्कृति के लिए प्लेटें तैयार एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से अच्छी तरह से (प्रति एक अंडाशय) में नवजात अंडाशय संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए। बाँझ घड़ीसाज़ संदंश का प्रयोग, प्रत्येक अच्छी तरह से, चमकदार सतह ऊपर में मध्यम के शीर्ष पर एक पॉली कार्बोनेट झिल्ली जगह है। यूवी उपयोग करने से पहले झिल्ली बाँझ।
- कूप संस्कृति।
- कूप संस्कृति के लिए मध्यम तैयार करने के लिए, एक आइयू / एमएल पुनः संयोजक मानव कूप उत्तेजक हार्मोन, 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एस्कॉर्बिक एसिड और 5% वी / वी सीरम के साथ पूरक α-मिनिमल आवश्यक मीडिया वयस्क मादा चूहों से प्राप्त की। फिल्टर एक बाँझ ट्यूब में एक 0.2 माइक्रोन ताकना, 13 मिमी व्यास फिल्टर के माध्यम से बाँझ।
- फिल्टर एक बाँझ ट्यूब में, एक .45 माइक्रोन ताकना, 25 मिमी व्यास फिल्टर के माध्यम से सिलिकॉन तेल बाँझ।
- पीएलए तैयार करने के लिएटीईएस, एक गैर टिशू कल्चर से प्रत्येक कुएं में कूप संस्कृति के माध्यम से 30 μl बूंदों जगह (रोम प्रत्येक दिन भर में नई पंक्तियों में स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक थाली में से केवल शीर्ष पंक्ति का उपयोग करते हुए, 96 अच्छी तरह से microtiter दौर अच्छी तरह से थाली में इलाज संस्कृति की अवधि)। ध्यान से मध्यम वाष्पीकरण को रोकने के लिए, निष्फल सिलिकॉन तेल के 70 μl के साथ मध्यम उपरिशायी।
- कूप अंडाशय सह संस्कृति।
- प्रत्येक कूप-अंडाशय सह संस्कृति की स्थापना की जा रही है के लिए माध्यम की एक मिलीलीटर बना रही है, ऊपर चरण 2.3.1 में कूप संस्कृति के लिए के रूप में कूप-अंडाशय सह संस्कृति के लिए मध्यम तैयार करें।
- , प्लेटें तैयार करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। बाँझ घड़ीसाज़ संदंश का प्रयोग, प्रत्येक अच्छी तरह से, चमकदार सतह ऊपर में मध्यम के शीर्ष पर एक Nucleopore झिल्ली जगह है। यूवी उपयोग करने से पहले झिल्ली बाँझ।
3. नवजात अंडाशय विच्छेदन और संस्कृति
- प्रत्येक बाँझ कांच भ्रूण डिश में विच्छेदन माध्यम से 1 मिलीलीटर रखें। <ली> चुनना नवजात माउस पिल्ले ब्रिटेन के गृह मंत्रालय के नियमों के अनुसार कत्ल से मुर्गियों को मारने, प्रसव के बाद दिन में 0 और 5 के बीच आयु वर्ग के।
- ठीक विच्छेदन संदंश की एक जोड़ी का उपयोग पेट की दीवार को कवर त्वचा समझ और त्वचा और शरीर की दीवार में एक बड़ा चीरा बनाते हैं। पूरे पेट संपर्क में है ताकि चीरा खोलने खींचो। मूत्राशय आमतौर पर इस स्तर पर engorged है और विच्छेदन आसान बनाने के लिए हवा निकाल दी जा सकती है।
- घड़ीसाज़ संदंश का उपयोग जिस तरह से बाहर हिम्मत ले जाएँ। प्रत्येक पक्ष पर गुर्दे को मूत्राशय से गर्भाशय सींग का पालन करें। अंडाशय से गर्भाशय के शीर्ष पर सिर्फ गुर्दे के नीचे स्थित है और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक बादल की तरह संरचना के रूप में दिखाई देगा।
- घड़ीसाज़ संदंश के साथ धीरे अंडाशय समझ, और गर्भाशय को अपने लगाव तोड़ कैंची का उपयोग करें। पूर्व गर्म विच्छेदन मध्यम युक्त भ्रूण बर्तन में अंडाशय की जोड़ी स्थानांतरण।
- एक गर्म स्टेशन पर एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे अंडाशय के ठीक विच्छेदन के लिए बाहर लेजीई (37 डिग्री सेल्सियस)। केवल अंडाशय रहता है, जब तक ब्रुसलरोग थैली और फैलोपियन ट्यूब सहित किसी भी अतिरिक्त सामग्री दूर ट्रिम करने के लिए इंसुलिन सुइयों का उपयोग करें।
- (चित्रा 1 ए देखें) एक पतले तैयार की घुमावदार गिलास पिपेट, प्रत्येक झिल्ली के शीर्ष पर एक अंडाशय का उपयोग करते हुए, ऊपर चरण 2.2.2 में तैयार एक संस्कृति की थाली के कुएं में प्रत्येक अंडाशय स्थानांतरण। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति।
- हर दूसरे दिन मध्यम बदलें। झिल्ली को परेशान करने से बचने के लिए माध्यम की अच्छी तरह से किनारे पर जगह विंदुक टिप: पूर्व मार डाला ताजा माध्यम के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक में मध्यम के 50% का आदान-प्रदान करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें।
- 6 दिन के लिए संस्कृतियों को बनाए रखने।
- संस्कृति के अंत में, मध्यम फ्रीज और ठीक है या आवश्यकता के रूप में, पीबीएस में एक संक्षिप्त धोने के बाद अंडाशय फ्रीज।
- 90 ऊतकीय विश्लेषण के लिए न्यूनतम, या immunohistological विश्लेषण के लिए 90 मिनट के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में लिए Bouin लगानेवाला में अंडाशय को ठीक करें। स्नैप में ऊतक रखकर अंडाशय फ्रीजबाद में प्रोटीन या mRNA निकासी के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर ठंड से पहले 5-10 मिनट के लिए सूखी बर्फ में ट्यूब डाल एक polypropylene ट्यूब,।
4. कूप विच्छेदन और संस्कृति
- 19-23 दिन पुराने मादा चूहों चुनना और अंडाशय अलग। किसी भी चीरों करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ फर गीले। कुंद एंडेड संदंश का उपयोग त्वचा चुटकी और त्वचा और शरीर दीवार दोनों के माध्यम से मर्मज्ञ, विच्छेदन कैंची के साथ पेट में एक बड़े चीरा बनाते हैं।
- विच्छेदन उपकरणों की एक महीन सेट का उपयोग कर रास्ते से बाहर आंत ले जाएँ और गर्भाशय का पता लगाने। हर तरफ गुर्दे के नीचे स्थित है जो अंडाशय को गर्भाशय का पालन करें।
- धीरे घड़ीसाज़ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग अंडाशय लोभी, ठीक विच्छेदन कैंची से गर्भाशय के अंडाशय लगाव तोड़। डिम्बग्रंथि वसा पैड के बहुत ज्यादा इकट्ठा करने से बचें। अंडाशय लीजिए और पूर्व गर्म विच्छेदन मध्यम युक्त एक भ्रूण बर्तन में स्थानांतरित।
- फिर सेकेवल अंडाशय रहता है, जब तक ब्रुसलरोग थैली और फैलोपियन ट्यूब सहित किसी भी अतिरिक्त सामग्री दूर ट्रिम करने के लिए इंसुलिन सुइयों का उपयोग डिम्बग्रंथि बर्सा चाल है। मोटे तौर पर इंसुलिन सुइयों का उपयोग कर प्रत्येक अंडाशय को आधा।
- ध्यान से 1 मिलीलीटर विच्छेदन मध्यम युक्त एक व्यक्ति घड़ी गिलास में प्रत्येक अंडाशय से डेढ़ हस्तांतरण। मध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए और बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए एक गिलास स्लाइड के साथ हर घड़ी गिलास को कवर।
- स्टोर घड़ी की जरूरत तक एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में अंडाशय आधा युक्त चश्मे, लेकिन जैसे ही संभव के रूप में अगले विच्छेदन कदम बाहर ले जाने के लिए। एक घंटे से भी अधिक के लिए इस रास्ते में संग्रहीत ऊतक त्यागें।
- एक लामिना का प्रवाह हुड में एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म खुर्दबीन चरण के लिए एक अंडाशय आधा युक्त स्थानांतरण घड़ी गिलास। मोटे तौर पर इस प्रकार के रूप में देर से पूर्व antral के रोम की पहचान करने के क्रम में, दो इंसुलिन सुइयों का उपयोग बड़े टुकड़ों में अंडाशय काटना: इन granulosa कोशिकाओं के 2-3 परतों होते हैं और चारों ओर 180-200 मीटर के व्यास होगा।
- मैन्युअल किसी भी मैं बाहर काटनाएक इंसुलिन सुई और एक सुई धारक में सुरक्षित किया गया है कि एक 30 एक्स 0.25 मिमी एक्यूपंक्चर सुई का उपयोग dentified के रोम। आसपास के स्ट्रोमा के सबसे निकालने के लिए, लेकिन रोम के बेसल लामिना हानिकारक से बचने के लिए सावधान रहें (चित्रा 1 बी देखें)।
- ध्यान से पूर्व गर्म विच्छेदन मध्यम युक्त एक इकट्ठा करने घड़ी गिलास में विच्छेदित रोम स्थानांतरित करने के लिए एक पतले तैयार की घुमावदार गिलास पिपेट का प्रयोग करें। रोम खोने से बचने के लिए पिपेट की पतली कैलिबर अनुभाग के भीतर रोम रखने के लिए सावधान रहें।
- उपाय के रोम सही रूप में एक विदारक माइक्रोस्कोप में लगाया एक calibrated ऐपिस graticule इस्तेमाल करते हैं।
- वे व्यास में 190 ± 10 माइक्रोन के लिए उपाय केवल यदि संस्कृति के लिए चयन करें रोम। इसके अलावा संस्कृति के लिए केवल स्वस्थ, गोलाकार के रोम का चयन करें; इन अंधेरे atretic क्षेत्रों के बिना, पारदर्शी हो, और कुछ संलग्न thecal ऊतक के साथ साथ, एक अक्षुण्ण बेसल लामिना होगा: इस वर्णन फिट नहीं है कि किसी भी रोम त्यागें। 1 के बीच की एक उपजअंडाशय प्रति 0-15 रोम अच्छा है।
- ऊपर चरण 2.3.3 के रूप में बना हुआ एक थाली के कुएं में एक भी कूप स्थानांतरित करने के लिए एक पतले तैयार की घुमावदार गिलास पिपेट का प्रयोग करें। ध्यान से अच्छी तरह से नीचे (और नहीं ऊपरी तेल की परत में) में कूप जगह है। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति।
- अप करने के लिए 6 दिनों के लिए संस्कृति के रोम, हर दिन एक अच्छी तरह से युक्त ताजा माध्यम में रोम घूम रहा है।
- ऊपर चरण 2.3.3 में थाली तैयारी में के रूप में 96 अच्छी तरह से थाली में अगली पंक्ति तैयार करें। संतुलन अनुमति देने के लिए, कम से कम एक घंटे के लिए इनक्यूबेटर थाली लौटें। एक पतले खींचा गिलास पिपेट का उपयोग, मध्यम की ताजा कुओं में रोम स्थानांतरण।
- संस्कृति में किसी भी बिंदु पर रोम ताजा माध्यम में आने से पहले दो दिनों के लिए नहीं छोड़ा जा सकता हैं, तो 60 μl (बजाय 30 μl) कूप संस्कृति के माध्यम से बूंदों की एक न्यूनतम में प्रत्येक कूप जगह है।
- , कूप विकास पर डेटा इकट्ठा एक ey का उपयोग कर, दैनिक रोम को मापने के लिएepiece graticule एक विदारक माइक्रोस्कोप में लगाया। तेल की परत कूप व्यास की माप बिगाड़ना है, तो सेट अप के लिए अंशांकन गुणांक बाहर काम करेंगे।
- संस्कृति के अंत में, मध्यम फ्रीज और ठीक है या इसके बाद के संस्करण कदम 3.10 के रूप में, बाद के विश्लेषण के लिए ऊतक फ्रीज।
- कूप कूप सह संस्कृति।
- संस्कृति दो रोम एक साथ, रोम के बीच बातचीत की जांच करने के लिए। संस्कृति के रूप में ऊपर है, लेकिन एक अच्छी तरह से में, संपर्क में, दो के रोम पक्ष द्वारा साइड जगह है।
- एक गैर टिशू कल्चर से प्रत्येक कुएं में कूप संस्कृति के माध्यम से 100 μl बूंदों रखें निष्फल सिलिकॉन तेल के 100 μl के साथ मध्यम overlaying, 96 अच्छी तरह से microtiter फ्लैट अच्छी तरह से थाली इलाज किया। ऊपर चरण 4.13 के रूप में नए सिरे से कुओं में रोम हस्तांतरण, लेकिन इसके बजाय हर दूसरे दिन माध्यम के 50% को बदलने के लिए एक ठीक जेल टिप का प्रयोग न करें।
- सह संस्कृति के भीतर ऊतक मूल की पहचान करने के लिए, सह संस्कृति उदाहरण ओ के लिए एक अलग आनुवंशिक स्रोत से प्रत्येक के रोमएक जंगली प्रकार माउस के अंडाशय, और GFP की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति के साथ एक माउस के अंडाशय से एक दूसरे से पूर्वोत्तर के। GFP या YFP के ऊतक का उपयोग करते हैं, तो संस्कृति के दौरान, जितना संभव हो उतना हल्का करने के लिए ऊतक के जोखिम को कम, और उसके बाद निर्धारण / प्रसंस्करण कदम के माध्यम से।
नोट: दो के रोम एक एकल, 'दो-कूप' इकाई में एक साथ विकसित करने के लिए सामान्य है (चित्रा 1C देखें)।
5. कूप अंडाशय सह संस्कृतियों
- से ऊपर धारा 3 और 4 के रूप में अंडाशय और रोम बाहर काटना।
- ऊपर चरण 2.4.2 के रूप में तैयार की गई एक थाली, एक झिल्ली के शीर्ष पर एक नवजात अंडाशय रखें। ध्यान से एक पतले तैयार की घुमावदार गिलास पिपेट का उपयोग, नवजात अंडाशय में से एक पोल के साथ संपर्क में एक भी कूप जगह है। ऊपर से 5 दिनों के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति।
- सह-संस्कृति के भीतर ऊतक मूल के बीच अंतर बहुत अलग दो से अंडाशय और रोम का उपयोग करने के क्रम मेंurces, उदाहरण के एक जंगली प्रकार माउस से एक है, और GFP की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति के साथ एक माउस से एक के लिए।
- ऊपर चरण 3.8 में के रूप में दैनिक मध्यम के 500 μl बदलें, लेकिन कूप संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर। सह संस्कृति के दौरान, कूप अक्सर अंडाशय (चित्रा -1) द्वारा समझाया जाता है।
- संस्कृति के अंत में, मध्यम फ्रीज और ठीक है या इसके बाद के संस्करण कदम 3.10 के रूप में, बाद के विश्लेषण के लिए ऊतक फ्रीज।
6. फिक्सेशन, immunocytochemistry और सुसंस्कृत ऊतक की इमेजिंग
- संस्कृति के अंत में, पीबीएस में ऊतक धोने और 100 μl (कूप) या 10% तटस्थ बफर formalin के 1 मिलीलीटर (अंडाशय) करने के लिए स्थानांतरण, और बर्फ पर 1 घंटे के लिए तय कर लो। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस के तीन washes के माध्यम से ले जाएँ।
- रोम पर immunocytochemistry के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त अलग washes या उपचार के साथ, एक पतले तैयार की घुमावदार गिलास पिपेट का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से microtiter दौर अच्छी तरह से थाली के कुओं के बीच हस्तांतरण।
- Ovari पर immunocytochemistry के लिएतों (या अंडाशय-कूप सह संस्कृतियों), एक vibrotome का उपयोग कर 50 माइक्रोन से कम 4% agarose जेल और अनुभाग में एम्बेड। 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में नाव वर्गों एक विंदुक के साथ हटाने, washes या उपचार लागू करने के लिए।
- इमेजिंग के लिए: फ्लैट गिलास स्लाइड के लिए agarose वर्गों हस्तांतरण और मध्यम बढ़ते के साथ माउंट; या हस्तांतरण के रोम (या कूप-कूप परिसरों) गुहा गिलास स्लाइड के लिए और बढ़ते मध्यम गैर सख्त साथ माउंट। एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर छवि नमूनों।
Representative Results
चित्रा 1 के शुरू में अंडाशय और रोम की छवियों से पता चलता है, और संस्कृति प्रक्रियाओं के दौरान।
चित्रा 2 नवजात अंडाशय के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है (यहाँ, नवजात पिल्ले से अंडाशय) संस्कृति के दौरान प्रजनन विषैले पदार्थ के संपर्क में। नवजात अंडाशय संस्कृति के दिन 2 पर, सिसप्लैटिन या डॉक्सोरूबिसिन या तो छह दिनों के लिए सुसंस्कृत, और एक कीमोथेरेपी दवा से अवगत कराया गया। संस्कृति के अंत में, अंडाशय, तय किया गया ऊतक विज्ञान के लिए कार्रवाई की है, और अंडाशय तो स्वस्थ और अस्वस्थ डिम्बग्रंथि के रोम चार की संख्या निर्धारित करने के लिए जांच की। वैकल्पिक रूप से, जल्दी से बढ़ रोम के एक और अधिक तेजी से मूल्यांकन एक oocyte-विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर 10 को व्यक्त करने के लिए एक माउस से अंडाशय का उपयोग कर, डिम्बग्रंथि टुकड़े की संस्कृति से प्राप्त किया जा सकता है।
व्यक्ति के रोम के संस्कृति के दौरान, कूप विकास आसानी से संस्कृति के दौरान दैनिक माप से पता लगाया जा सकता हैसंरचना अवधि। तीन हार्मोन (FSH) और luteinizing हार्मोन (एलएच) 5 उत्तेजक कूप gonadotrophin हार्मोन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सुसंस्कृत रोम के विकास के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है।
कूप कूप या कूप-अंडाशय सह संस्कृति के रोम के बीच बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊतक और प्रसंस्करण पर निर्भर करता है, छवियों उज्ज्वल क्षेत्र, प्रतिदीप्ति या confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 4 endothelial और neuronal कोशिकाओं सहित कूप-कूप संचार में शामिल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, जांच, इस तरह के सह संस्कृतियों से छवियों के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है 7।
चित्रा 1: जन्म दिन पर एक माउस से प्राप्त एक नवजात अंडाशय (ए) सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ रखा एक polycarbonate झिल्ली पर। आसपास के स्ट्रोमल ऊतक के सबसे दूर विच्छेदित साथ (बी) सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ हौसले की, स्वस्थ डिम्बग्रंथि कूप विच्छेदित। (सी) संस्कृति आय (सीआई के रूप में दो रोम के बीच विकसित कि निकट संपर्क दिखा संस्कृति के पहले तीन दिनों में दो डिम्बग्रंथि के रोम के सह संस्कृति के photomicrographs,: संस्कृति के पहले दिन, सीआईआई: संस्कृति के दूसरे दिन; Ciii : संस्कृति के तीसरे दिन)। स्पीयर्स एट अल से reproduced। सह सुसंस्कृत preantral कूप और नवजात अंडाशय के 11 (डी) सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ संस्कृति के दो दिनों के बाद। छवि कूप अंडाशय से समझाया बनने से पता चलता है। तीर preantral कूप से पता चलता है। डॉ फ़ेडेरिका लोपेज से छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2: सिसप्लैटिन कीमोथेरेपी दवाओं के प्रभाव और डॉक्सोरूबिसिन नवजात सुसंस्कृत अंडाशय पर Cisplatin और कूप स्वास्थ्य की हानि और कूप की संख्या में कमी करने के लिए दोनों के नेतृत्व Doxorubicin।। (ए) Cisplatin; (बी) डॉक्सोरूबिसिन: (i) के अस्वस्थ रोम (स्पष्ट) का प्रतिशत; और रोम (ii) कुल संख्या प्रत्येक अंडाशय में (छायांकित)। बार्स + SEM मतलब निरूपित; एन = 5 सभी समूहों के लिए, सितारों को नियंत्रित करने के रिश्तेदार महत्वपूर्ण मतभेद निरूपित (* पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001)। मॉर्गन एट अल से reproduced। 4
चित्रा 3:। ग्रोथ अलग gonadotrophin वातावरण के संपर्क में रोम की दरों मान ± SEM (प्रत्येक समूह के लिए एन ≥16) मतलब कर रहे हैं। तीर अंतरा के शुरू इंगित करता हैसभी gonadotrophin समूहों में एल गठन। मरे एट अल से reproduced। 5
चित्रा 4: कूप-कूप और अंडाशय-कूप सह संस्कृतियों से छवियाँ, कूप-कूप बातचीत दिखा रहा है (ए) के एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) कूप और सह संस्कृति के बाद एक जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) कूप के confocal माइक्रोग्राफ (। गुम्मट कूप से अधिक तक दिखाया GFP के कूप से प्रक्रियाओं के साथ GFP अभिव्यक्ति सफेद में यहाँ दिखाया गया है)। (बी) के सह-संस्कृति निम्नलिखित एक GFP / गुम्मट कूप जटिल के माध्यम से क्रॉस-सेक्शन, गुम्मट कूप के बेसल लामिना से सटे आसपास के कूप झूठ से कि GFP प्रक्रियाओं (हरा) दिखा। (सी) नवजात गुम्मट अंडाशय एक पूर्व antral GFP- व्यक्त, कूप कि GFP कोशिकाओं और सेलुलर प्रक्रियाओं (हरा) दिखा चले गए साथ संस्कृति निम्नलिखितनवजात अंडाशय के डिम्बग्रंथि इंटरस्टिटम के माध्यम से। (डी) GFP / गुम्मट कूप जटिल endothelial सेल मार्कर CD31 (लाल) की अभिव्यक्ति के द्वारा दिखाए गए endothelial कोशिकाओं, युक्त। Neuronal मार्कर बीटा ट्यूबिलिन III की अभिव्यक्ति के द्वारा दिखाया neuronal कोशिकाओं युक्त (ई) GFP / गुम्मट कूप जटिल (लाल के रूप में यहाँ देख सकते हैं, या पीले रंग के रूप में डबल लेबल GFP के साथ, हरी अगर)। न्यूरॉन्स YFP कूप से विस्तार दिखा रहा है कि neuronal कोशिकाओं 9 के एक सबसेट में: (पीला YFP) YFP पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सामयिक अभिव्यक्ति है कि एक Thy1-YFP माउस से कूप को संदर्भित करता है, जहां (एफ) YFP / गुम्मट कूप जटिल,। बार्स 50 माइक्रोन (ए, बी, डी), 100 माइक्रोन (सी, ई, एफ), 100 माइक्रोन (ए में इनसेट), 10 माइक्रोन (सी में इनसेट), 15 माइक्रोन (डी में इनसेट)। कैम्पबेल एट अल से reproduced। 7 इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंgure।
Discussion
हम यहाँ भी केवल जल्द से जल्द कूप चरणों, व्यक्तिगत preantral डिम्बग्रंथि के रोम और दो ऊतकों के सह संस्कृतियों युक्त पूरे नवजात अंडाशय का उपयोग करते हुए, इन विट्रो में माउस डिम्बग्रंथि के रोम के विकास का समर्थन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि विभिन्न संस्कृति प्रणालियों का वर्णन है।
नवजात माउस अंडाशय की संस्कृति जल्दी डिम्बग्रंथि विकास, माध्यमिक कूप चरण के लिए विशेष रूप से कूप विकास दीक्षा का समर्थन करता है। नवजात चूहों की उम्र की एक श्रृंखला के हित के विकास के चरणों पर निर्भर करता है, इन संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंडाशय नवजात चूहों से प्राप्त कर रहे हैं, कूप गठन चल लेकिन अभी तक नहीं पूरा हो जाएगा: संस्कृति में कम से कम आंशिक रूप से कूप विकास द्वारा पीछा जारी रखा कूप गठन का समर्थन करेंगे। वैकल्पिक रूप से, उम्र के चार से पांच दिनों चारों ओर चूहों से अंडाशय के उपयोग के मौलिक और बढ़ती folli की एक बड़ी संख्या की संस्कृति में परिणाम (जिसके द्वारा समय कूप गठन के पहले से ही पूरा हो गया है)cles 12। यहाँ वर्णित विशिष्ट तकनीक का लाभकारी पहलुओं ऐसे सीरम के रूप में अपरिभाषित additives के उपयोग से परहेज है, केवल αMEM और बीएसए से मिलकर एक बहुत ही बुनियादी माध्यम में अधिक से अधिक ऊतक के oxygenation, और संस्कृति की अनुमति देते हैं, जो अस्थायी पॉली कार्बोनेट झिल्ली, का उपयोग शामिल है। पूरे अंडाशय की संस्कृति ऐसी सुसंस्कृत नवजात अंडाशय एक से कूप-granulosa सेल परिसरों के विच्छेदन के रूप में तकनीक में परिवर्तन, आवश्यकता के बाद के विकास के साथ, माध्यमिक कूप मंच से परे विकास का समर्थन करने के लिए प्रतीत नहीं होता।
कूप विकास के बाद के चरणों उनके तीन आयामी संरचना को बनाए रखने whilst संस्कृति में preovulatory चरण के लिए विकसित किया जा सकता है, जो व्यक्ति बरकरार देर पूर्व antral के रोम, बाहर विदारक द्वारा इन विट्रो में विकसित किया जा सकता है। विवो में होता है के रूप में इस संस्कृति तकनीक के लिए बरकरार रोम के उपयोग के विभिन्न कूपिक घटकों के बीच के रिश्ते को बनाए रखता है। थीसंस्कृति प्रणाली निषेचन और बाद में भ्रूण के विकास का समर्थन कर सकते हैं कि oocytes प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Fertilizable oocytes भी डिम्बाणुजनकोशिका-granulosa सेल परिसरों विट्रो एक में बड़े हो रहे हैं, जिसके दौरान एक दूसरे चरण के द्वारा पीछा यहाँ वर्णित के रूप में ज्यादा एक प्रारंभिक संस्कृति प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए माउस नवजात अंडाशय से प्राप्त किया जा सकता है। काफी बार आज इस्तेमाल अन्य प्रणालियों का समर्थन प्रदान करने के लिए इस तरह के alginate हाइड्रोजेल के रूप में एक सामग्री में समझाया गया है कि रोम या डिम्बग्रंथि ऊतक की संस्कृति, शामिल हैं (उदाहरण के लिए, देखते हैं, Tagler एट अल। 13)। विधि विकास का ध्यान ज्यादा अब मानव सहित प्रजातियों में से एक सीमा से मौलिक रोम से fertilisable oocytes प्राप्त करने के लिए लंबी अवधि के लक्ष्य के साथ, अंडाशय और बड़े स्तनधारियों के रोम के लिए संस्कृति तकनीक में सुधार है।
किसी भी एक समय में, स्तनधारी अंडाशय interactio साथ, विकास के चरणों की एक श्रृंखला में रोम होते हैंउनके विनियमन को प्रभावित करने के रोम के बीच एनएस। डिम्बग्रंथि समारोह के इस पहलू बुरा समझा जाता है और मुश्किल विवो में जांच करने के लिए। यहाँ वर्णित अंतिम विधि इन विट्रो में रोम के विभिन्न चरणों के विकास का समर्थन करने के लिए सह संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करता है। यदि आवश्यक हो, एक या दोनों के ऊतकों से पहले सह संस्कृति विवो में या इन विट्रो में पूर्व में इलाज किया जा सकता है। इस जैसे सह संस्कृति प्रणालियों से बढ़ कैसे उदाहरण के लिए, कूप-कूप बातचीत की जांच करने के लिए, जिसमें एक आदर्श तरीका प्रदान करते हैं, antral के रोम मौलिक कूप पूल प्रभावित है, मुश्किल साबित किया है कि डिम्बग्रंथि के जीव विज्ञान के पहलुओं को अब तक की जांच करने के लिए।
सावधान विच्छेदन आकस्मिक ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए आवश्यक है, हालांकि पूरे अंडाशय संस्कृति तकनीक, काफी स्पष्ट हैं। व्यक्ति के रोम के विच्छेदन सही स्तर पर रोम अंडाशय बरकरार और undamaged से बाहर विच्छेदित किया जा सकता से पहले दोहराया अभ्यास की आवश्यकता होती है एक विशेष तकनीक है। यह जटिल हैध्यान से व्यक्ति के रोम बाहर काटना, या विच्छेदन प्रोटोकॉल के दौरान निरंतर क्षति बाद में संस्कृति की अवधि के दौरान कूप मौत में परिणाम कर सकते हैं। टिशू कल्चर इलाज किया plasticware के लिए किया जाता है, तो रोम को जोड़ना होगा: रोम से microtiter प्लेटों के कुएं में सीधे कहाँ रखा है, यह प्लास्टिक पर thecal कोशिकाओं के नीचे चढ़ाना कम करने के लिए, केवल गैर टिशू कल्चर में इलाज प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है अच्छी तरह के आधार और टूटना रूप में वे विकास। सभी सह संस्कृति काम के लिए, ऊतकों सीधे एक दूसरे के साथ संपर्क में रखा जाना चाहिए।
कूप संस्कृति तकनीक में इस्तेमाल के लिए ऊपर विस्तृत मध्यम माउस सीरम के अलावा भी शामिल है। यह भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ माउस सीरम को बदलने के लिए संभव है, लेकिन बैच परीक्षण उपयुक्त स्रोतों की पहचान करने के लिए आवश्यक के साथ इस तरह सीरा की केवल सामयिक बैचों पूरी तरह से, preovulatory चरण के लिए कूप विकास का समर्थन करेंगे। FSH के बैच के परीक्षण के अंतर्राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के रूप में, यह भी सलाह दी जाती हैएफएसएच इन विट्रो में कूप विकास के लिए केवल कुदरती तौर सहसंबंधी मूल्यांकन किया है जिसके द्वारा टीएस। कूप टूटना नियमित संस्कृति की अवधि के दौरान होती है, तो एक ताजा बैच के साथ शेयर एस्कॉर्बिक एसिड की जगह पर विचार करें।
तकनीक, विदारक माइक्रोस्कोप और टिशू कल्चर इन्क्यूबेटरों के अलावा अन्य विशेष रूप से विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है एक लामिना का प्रवाह हुड और अच्छा बाँझ तकनीक का उपयोग डिम्बग्रंथि के रोम यहाँ वर्णित विधि के रूप में, एंटीबायोटिक दवाओं के अभाव में संवर्धित किया जा करने की अनुमति है। यह वे संस्कृति निम्नलिखित निषेचित किया जा रहे हैं, खासकर यदि oocytes पर एंटीबायोटिक दवाओं के किसी भी संभावित हानिकारक प्रभाव से बचने के लिए, सहायक हो सकता है। यह एक बाँझ वातावरण में काम करने के लिए संभव नहीं है, जहां यह विच्छेदन और संस्कृति मीडिया के लिए एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने के लिए सलाह दी जाती है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
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