Summary
이 프로토콜은 신생아 마우스와 사춘기 쥐에서 개별 난소에서 난소를 사용하여, 마우스 난소 조직의 주요 문화 / 공동 문화를 설명합니다. 배양 기술은 난소에 외인성 제제의 효과의 조사를 가능하게하여 생리 고도로 개발을 지원하고, 난포 사이의 상호 작용.
Abstract
포유 동물의 난소는 난포로 구성되어, 체세포 과립 세포에 의해 둘러싸여 하나의 난자로 구성된 각각의 뿌리는, 기저막 내에서 함께 동봉. 여포의 유한 풀은 감수 체포에 난자가 원시 난포를 형성, 평탄화 된 과립 막 세포와 긴밀한 관계를 형성 배아 발달 동안에 규정된다. 또는 출생 직후, 포유류의 난소 지점은 이후 성장 난포 풀에 난포의 꾸준한 출시가있는 원시 난포의 수명의 공급을 포함.
난소는 난포 문화에 매우 생리적으로 성장하여, 체외에서 개발에 특히 의무입니다. 이 작품은 원시 난포를 포함하는 전체 신생아 난소의 문화, 개인 난포의 문화, preovu까지 미성숙에서 난포의 개발을 지원할 수있는 방법을 설명latory 단계는, 이후 자신의 난자는 체외에서 수정을받을 수 있습니다. 여기에 설명 된 작품은 난소 외부 화합물에 노출에 의해 영향을받는 방법을 결정하기 위해 문화 시스템을 사용합니다. 또한 성장 여포 및 여포 원시의 비 성장 풀 간의 상호 작용의 발생 수를 조사 공존 배양 시스템을 설명한다.
Introduction
포유 동물의 난소는 난자의 여성의 일생 공급, 난포에 포함 된 각 구성되어있다. 모공이 휴식에 이전 출생에 형성되고, 원시 단계 : 뿌리 풀이 설정되면, 성장 난포 풀에 원시에서 난포의 지속적인 점진적인 움직임이있다. 난포가 성장하기 시작하면 그들은 배란, 또는 Graafian, 단계에 도달 할 때까지, 그들은 1 차, 2 차 전동 난포하고 전 정부 단계를 통해 개발할 수 있습니다. 배란 난포에서 난자 만이 수정 된 경우, 용어 배아 발달을 지원할 수 전체 개발 능력을 보유하고 있습니다.
난소 긴 체외에서 높은 생리 방식으로 개발하는 것으로 알려져있다. 이는 그 안에 미성숙 단계로부터 난자를 t까지 (있는 그것의 감수 분열을 완료 할 수없는 점)을 지원하기 위해 필요한 셀을 포함하는 각 난소 여포 될 가능성그는 유능한 발달 단계 (있는 완전히 감수 분열, 수정 및 기간에 생성 된 배아 발달의 완료를 지원할 수있는 포인트).
생체 외 난소 개발 생리 특성상 난소 배양 기술이 널리 적용되고있다. 따라서, 체외 방법 (예를 들어 그 다낭성 난소 증후군, 다낭성 난소 증후군의), 화학 물질에 대한 노출에 의해 영향을 받는지 난소 / 난 모세포의 검사, 또한 실용적인 목적으로 난소 개발, 난소 병리의 조절을 조사하기 위해 사용되어왔다 원시 난포에서 fertilizable 난자를 얻을 수있다. 인간을 비롯한 대형 포유류에서 모낭을 이용한 배양 기술이 최근 몇 년 동안 상당히 개선 2,3- 않았지만 현재까지, 후자는 단지 마우스 난소 조직 하나를 사용하여 달성되었다.
우리는 여기에 마우스 난소 조직을 사용하여 여러 문화 방법을 설명합니다. 첫 번째 방식 운전 방식D는 전체 신생아 마우스 난소를 사용하고, 원시 난포 (4)의 형성과 초기 개발을 지원합니다. 두 번째 시스템은 배란 전 단계에 후반 전동 난포에서 개별 그대로 난포의 성장을 지원합니다 이 기술을 사용, 모공 개별적으로 배양, 또는 쌍 5,6에서 할 수있다. 마지막으로, 우리는 원시 성장 및 난포 (7) 사이의 상호 작용의 조사를 허용하는 방식으로 제 두 가지 기술을 조합, 공존 배양 시스템을 설명한다.
개별 그대로 난포의 문화 매체 분석 난포 / 난소 호르몬 생산의 조사를 허용하면서 난포 성장, 문화 기간 동안 매일 뿌리 측정에서 측정 할 수 있습니다. 또한, 조직 학적 분석 / 또는 면역 조직 학적 분석을 구하는 예에 대한 후속 처리를 위해, 배양의 마지막에 모낭 또는 난소 조직의 수집에 의해 달성 될 수있다의 mRNA 또는 단백질.
Protocol
모든 동물의 작업은 영국 홈 오피스의 라이센스하에 제도적 지침에 따라 (프로젝트 라이센스 번호 PPL 1천7백26분의 60과 4,026분의 60)에서 수행 하였다.
참고 : 주택의 동물을 14 시간 빛에 영국의 법적 요구 사항과 10 시간 어두운 광주에 따라. 야생형 C57Bl6J 마우스, 녹색 형광 단백질 (GFP) 8 및 신경 세포 (9)의 부분 집합에 노란색 형광 단백질 (YFP) 가끔 표정으로 Thy1-YFP 마우스의 유비쿼터스 표현이 타우-GFP 마우스를 사용하여 동물 행동 실험 : 모두 유전자 변형 라인은 C57Bl6J 배경에 자란.
1. 근로 조건 및 악기의 제조
- 멸균을 위해 층류 후드에서 모든 미디어 제제, 해부 조직, 문화 작업을 수행 :이 매체 항생제 첨가 요건을 회피한다.
- 항상 미디어 / 문화 판 / 배아 요리 평형 수사용하기 전에 37 ° C 오븐에서 1 시간 이상 (해부 매체 / 배아 종) 또는 37 ° C, 5 % CO 2 배양기 (문화 매체와 플레이트)에 대한.
- 약 1 시간에 대한 소 혈청 알부민 (BSA)의 0.1 % 용액을 유리 피펫 담근 후 건조 떠난다. 미세하게 그려진 곡선 유리 피펫을 생산, 이렇게 같이 유리 굽힘, 분젠 버너의 불꽃에 피펫을 당깁니다. 피펫 당기면 후, 유리 커터와 깨끗한 절단을합니다. 오븐 약 45 분 동안 160 ° C에서 살균.
참고 :이 유리 피펫의 상점은 난소와 난포를 전송하는 데 필요합니다.
해부와 문화 미디어 2. 준비
- 해부 매체를 준비합니다.
- Leibowitz를 L15 및 필터 매체의 3 ㎎ / ㎖ BSA가 0.2 μm의 세공, 직경 25mm 필터를 통해 살균 녹인다.
- 신생아 난소 문화.
- 신생아 난소 문화 매체를 준비하려면 EAC에 대한 매체의 1 mL로배양한다 시간 난소. 3 ㎎ / α-최소 필수 배지에서 ㎖의 BSA (αMEM) 및 필터 멸균 튜브에 0.2 μm의 세공, 직경 13mm 필터를 통해 살균 녹인다.
- 신생아 난소 문화 판을 준비하는 24 웰 플레이트의 각 웰 (물론 당 하나의 난소)에 신생아 난소 배지 1 ㎖를 추가합니다. 멸균 시계 집게 사용하여 각 아니라, 빛나는 표면습니다 매체의 상단에 하나의 폴리 카보네이트 막 배치합니다. UV는 사용 전에 멸균 멤브레인.
- 난포 문화.
- 여포 문화 매체를 준비하려면 1 IU / ml의 재조합 인간 난포 자극 호르몬, 5 ㎍ / ㎖의 아스 코르 빈산 5 % v / V를 혈청과 보충 α-최소 필수 미디어는 성인 여성 쥐에서 얻은. 필터 멸균 튜브에 0.2 μm의 세공, 직경 13mm 필터를 통해 살균.
- 필터 멸균 튜브에, 0.45 ㎛의 세공, 직경 25mm 필터로 실리콘 오일을 살균.
- 괞 찮아를 준비하려면TES, 비 - 조직 배양의 각 웰에 모낭 배양 배지 30 ㎕의 액 적을 장소 (모낭 매일 위에 새로운 행으로 이동 될 수 있도록 각 플레이트의 상단에만 열을 이용하여 96- 웰 마이크로 티터 둥근 웰 플레이트 취급 배양 기간). 배지를 조심스럽게 증발을 방지하기 위해, 멸균 된 실리콘 오일의 70 μL와 중첩 매체.
- 난포 난소 공동 문화.
- 각각의 난포 난소 공 배양을 설정하는 대한 매체의 1 ml의를 구성, 위의 단계 2.3.1에 뿌리 문화로 난포 난소 공동 문화 매체를 준비합니다.
- 플레이트를 제조하는 24- 웰 플레이트의 각 웰에 배지 1 ㎖를 추가한다. 멸균 시계 집게 사용하여 각 아니라, 빛나는 표면습니다 매체의 상단에 하나 Nucleopore 막 배치합니다. UV는 사용 전에 멸균 멤브레인.
3. 신생아 난소 해부와 문화
- 각 멸균 유리 배아 접시에 해부 매체의 1 ml에 놓습니다. <리> 발췌 신생아 마우스 새끼는 영국 홈 오피스 규정에 따라 잘린 컬링, 출생 후의 일 0에서 5 세 사이.
- 미세 해부 포셉 한 쌍을 사용하여 복벽을 덮고있는 피부를 잡고 피부와 신체 벽에 큰 절개를합니다. 전체 복부가 노출되도록 절개를 당겨서 엽니 다. 방광은 보통,이 단계에서 충혈되고 절개 쉽게하기 위해 천공 될 수있다.
- 시계의 집게를 사용하는 방식에서 용기를 이동합니다. 양쪽의 신장에 방광에서 위로 자궁 뿔을 따르십시오. 난소는 자궁의 상단에 바로 신장 아래에 위치 해부 현미경 구름 같은 구조로 표시됩니다.
- 시계 포셉으로 부드럽게 난소를 잡고 자궁의 첨부 파일을 절단 가위를 사용합니다. 예열 해부 배지를 함유하는 접시에 배아 난소의 쌍을 전송.
- 온수 역에 해부 현미경으로 난소의 미세 해부을 수행GE (37 ° C에서). 만 난소가 남을 때까지, 점액낭 주머니와 난관을 포함한 모든 여분의 재료를 다듬기 위해 인슐린 주사 바늘을 사용합니다.
- (도 1a 참조)를 미세하게 그려진 곡선 유리 피펫, 각각의 막 위에 난소 하나를 사용하여 상기 단계 2.2.2에서 제조 한 배양 플레이트의 각 웰에 난소 전송. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 문화.
- 격일로 매체를 변경합니다. 멤브레인을 방해하지 않도록 매체의 우물의 가장자리에 위치 피펫 팁 : 미리 가스 방출 신선한 매체 아니라 각 매체의 50 %를 교환 피펫을 사용합니다.
- 최대 6 일 동안 문화를 유지한다.
- 배양의 마지막에, 매체 동결 해결하거나 필요에 따라, PBS에서 간단한 세척 후에 난소 동결.
- (90) 조직 학적 분석을위한 분, 또는 면역 조직 학적 분석을위한 90 분 10 % 중성 포르말린에 대한 보우 인의 정착에 난소를 수정합니다. 스냅에 조직을 배치하여 난소를 동결이후 단백질 또는 mRNA의 추출을위한 -70 ℃에서 동결 전에 5-10 분 동안 드라이 아이스에 튜브를 배치하는 폴리 프로필렌 튜브.
4. 난포 해부와 문화
- 19-23일 세 여성 쥐를 추려과 난소을 격리 할 것. 어떤 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 모피를 젖은. 무딘 종단 집게를 사용하여 피부를 조이고 피부와 신체 벽을 모두 관통, 해부 가위로 복부에 큰 절개를합니다.
- 해부 악기의 미세한 세트를 사용하여 길에서 창자를 이동하고 자궁을 찾습니다. 양쪽의 신장 아래에있는 난소에 자궁을 따르십시오.
- 조심스럽게 시계 포셉의 쌍을 사용하여 난소를 잡고, 미세 해부 가위로 자궁 난소 첨부 파일을 절단. 난소 지방 패드의 너무 많이 수집하지 마십시오. 난소를 수집하고 예열 해부 매체를 포함하는 배아 요리로 전송합니다.
- 다시만 난소가 남을 때까지, 점액낭 주머니와 난관을 포함한 모든 여분의 재료를 다듬기 위해 인슐린 주사 바늘을 이용하여 난소 점액낭 이동합니다. 대략 인슐린 주사 바늘을 이용하여 각각의 난소를 이등분.
- 조심스럽게 해부 1 ml의 배지를 함유하는 개개의 시계 유리에 각각 난소 절반을 전송. 매체의 증발을 방지하고 불임을 보장하기 위해 유리 슬라이드 각각 시계 접시를 커버.
- 스토어 시계 필요할 때까지 37 ° C의 오븐에서 난소 반쪽을 함유하는 안경 있지만 가능한 빨리 다음 절개 공정을 수행한다. 시간 이상이 방법으로 저장 조직을 폐기하십시오.
- 층류 후드에서 37 ° C 가열 현미경 단계로 난소의 절반을 포함하는 전송 시계 유리. 대략 다음과 같이 미리 늦은 난포를 식별하기 위해, 두 인슐린 주사 바늘을 이용하여 큰 조각으로 난소 해부 : 이들은 과립 막 세포의 2-3 층을 포함하고 약 180-200 ㎛의 직경을 가질 것이다.
- 수동으로 난을 해부한 인슐린 바늘과 바늘 홀더에 고정 된 하나의 30 X 0.25 mm 침술 바늘을 사용 dentified 모공. 주변 기질의 대부분을 제거 할 수 있지만 모낭의 기저 얇은 판의 손상을 방지하기 위해주의해야합니다 (그림 1B 참조).
- 신중하게 예열 해부 매체를 포함하는 수집 시계 유리에 해부 모공을 전송하는 미세하게 그려진 곡선 유리 피펫을 사용합니다. 모낭 손실을 방지하기 위해 피펫의 얇은 구경 섹션에 모낭을 유지하기 위해주의해야합니다.
- 측정 여포 정확하게 해부 현미경에 장착 된 보정 계수 선 접안 렌즈를 사용.
- 그들은 직경이 190 ± 10 μm의를 측정 할 경우에만 문화를 선택 난포. 또한 문화 단지 건강, 구형 여포를 선택; 이러한 어두운 atretic 지역 않고, 반투명, 일부 부착 thecal 조직과 함께 그대로 기저판을해야합니다 :이 설명을 맞지 않는 모공을 폐기합니다. 1 사이의 수율난소 당 0-15 모공이 좋다.
- 위의 단계 2.3.3로 만든 접시의 우물에 하나의 난포를 전송하는 미세하게 그려진 곡선 유리 피펫을 사용합니다. 조심스럽게 우물의 바닥 (그리고 상위 오일 층)에 뿌리를 놓습니다. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 문화.
- 최대 6 일 동안 문화 여포는 매일 잘 포함 된 새로운 배지로 모공을 이동.
- 위의 단계 2.3.3에서 판 준비로 96 웰 플레이트의 다음 행을 준비합니다. 평형 수 있도록, 적어도 한 시간 동안 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 미세하게 그려진 유리 피펫을 사용하여, 매체의 신선한 우물에 모공을 전송합니다.
- 문화의 모든 지점에서 여포가 새로운 배지로 이동하기 전에 이틀 동안 남아있을 경우, 60 μL (오히려 30 μL) 뿌리 문화 매체의 방울의 최소 각 여포를 배치합니다.
- 난포 성장에 대한 데이터를 수집 도망을 사용하여, 매일 모공을 측정하려면epiece 계수 선은 해부 현미경에 장착. 유층 난포 직경의 측정을 왜곡 때문에 셋업에 대한 교정 계수를 해결할 것이다.
- 배양의 마지막에, 동결 배지 또는 상기 고정 단계에서와 같이 3.10, 후속 분석을 위해 조직을 동결.
- 난포 난포 공동 문화.
- 문화 개의 난포 함께, 모공 사이의 상호 작용을 조사합니다. 문화는 위와 같이하지만, 잘에, 접촉, 두 개의 난포를 나란히 배치합니다.
- 비 - 조직 배양의 각 웰에 모낭 배양 배지 100 ㎕ 방울 장소 멸균 실리콘 오일 100 ㎕ 매체에 오버레이 96- 웰 마이크로 티터 웰 평면 플레이트를 처리 하였다. 위의 단계 4.13에서와 같이 신선한 우물에 모낭을 전송하는 대신 매일 매체의 50 %를 변경하는 좋은 젤 팁을 사용하지 마십시오.
- 공 배양 내 조직 기원을 식별하기 위해, 공동 배양 O 예를 들어, 서로 다른 소스로부터 각각의 유전자를 난포야생형 마우스의 난소 및 GFP의 유비쿼터스 식으로 마우스의 난소에서 서로 NE. GFP 또는 YFP 조직을 사용하는 경우, 배양 중에, 가급적 조직의 빛의 노출을 최소화하고, 그 후 고정 / 처리 단계 내지.
주 : 두 모공 단일 '두 난포'단위로 함께 성장하는 것은 보통 (도 1C 참조).
5. 난포 난소 공동 문화
- 위의 3 항 및 4와 난소와 난포 아웃을 해부하다.
- 위의 단계 2.4.2에서와 같이 제조 판에, 멤브레인의 상단에 하나 신생아 난소를 놓습니다. 조심스럽게 미세하게 그려진 곡선 유리 피펫을 사용하여, 신생아 난소 중 하나 극과 접촉하는 하나의 뿌리를 놓습니다. 최대 5 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 문화.
- 상기 공동 내의 조직 배양 유래 구별 다르기 때문에 두에서 난소 여포를 사용하기 위해urces, 예를 야생형 마우스에서 하나, 그리고 GFP의 유비쿼터스 식으로 마우스에서 하나.
- 위의 단계 3.8에서와 같이 매일 매체의 500 μl를 교체하지만, 모낭 배양 배지를 사용하여. 공 배양 중에 모낭 종종 난소 (도 1D)에 의해 캡슐화된다.
- 배양의 마지막에, 동결 배지 또는 상기 고정 단계에서와 같이 3.10, 후속 분석을 위해 조직을 동결.
6. 고정, 면역 세포 배양 조직의 이미징
- 문화의 끝에서, PBS에서 조직을 씻고 100 μL (모낭) 또는 10 % 중성 포르말린 1 ㎖ (난소)로 전송하고, 얼음에 1 시간 동안 수정. 4 ° C에서 1X PBS의 3 세척을 통해 이동합니다.
- 모낭에 면역 세포의 경우, 각 웰에 포함 된 다른 세척 또는 트리트먼트, 미세하게 그려진 곡선 유리 피펫을 사용하여 96 웰 마이크로 타이 라운드 웰 플레이트의 우물 사이의 전송.
- ovari에 면역 세포 화학ES (또는 난소 여포 공동 - 배양 물)을 사용 vibrotome에서 50 μm의 4 % 아가 로즈 겔에 포함 섹션. 24 웰 플레이트의 우물에 떠 섹션은 피펫으로 제거, 세척 또는 치료를 적용합니다.
- 영상의 경우 : 평면 유리 슬라이드에 아가로 오스 섹션을 전송하고 매체를 장착 마운트; 또는 전송 여포 (또는 난포 난포 단지) 공동 유리 슬라이드 및 장착 매체가 아닌 경화로 마운트합니다. 공 초점 현미경을 사용하여 이미지의 표본.
Representative Results
도 1의 시작 부분과 난소 여포의 이미지를 나타내고 있으며, 배양 절차 동안.
그림 2는 신생아 난소의 대표적인 결과 표시 (여기를, 갓 태어난 새끼에서 난소) 문화 동안 생식 독성 물질에 노출. 신생아 난소 문화의 날 2, 시스플라틴 또는 독소루비신 중 6 일 동안 배양하고, 화학 요법 약물에 노출시켰다. 배양의 마지막에, 난소, 고정시키고 조직학을 위해 처리 한 난소는 건강에 해로운 난포 (4)의 수를 결정하기 위해 조사 하였다. 대안 적으로, 초기 성장 모낭보다 신속한 평가 난자 특정 형광 마커 (10)를 발현하는 마우스의 난소를 사용하여, 난소 단편의 배양 물로부터 얻을 수있다.
개별 모공의 문화 동안, 난포 성장은 쉽게 막힌 동안 매일 측정을 통해 확인 할 수있다스트럭처 기간. 3 호르몬 (FSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH)를 5 난포 자극 호르몬 gonadotrophin의 존재 또는 부재하에 배양 된 모낭의 성장의 대표적인 결과를 보여준다.
난포 소낭 또는 난소 여포 공 배양은 모낭의 상호 작용을 조사하기 위해 사용될 수있다. 조직 및 처리에 따라 이미지가 시야, 형광 또는 공 초점 현미경을 이용하여 얻어 질 수있다.도 4는 내피 및 신경 세포를 포함한 난포 난포 통신에 관련된 다양한 세포 유형을 검사하는 등의 공동 배양에서 이미지의 대표적인 결과를 나타낸다 7.
그림 1 : 출생의 날에 마우스에서 얻은 신생아 난소의 (A) 현미경 사진은, 배치 폴리 카보네이트 막에. 주변 간질 조직의 대부분은 멀리 해부와 (B) 현미경 사진은 갓의 건강한 난포를 해부. (C) 문화 진행 (CI로 두 여포 사이에 개발 밀착 보여주는 문화의 3 일 동안 두 개의 난포의 공동 문화의 현미경 사진 : 문화의 첫 날, CII : 문화의 두 번째 날을, CIII : 문화의 셋째 날). 스피어스 등 알에서 재현. 공 배양 전동 난포 난포 및 신생아 난소의 11 (D) 현미경 사진 문화 이틀 후. 이미지 난포가 난소에 의해 캡슐화되는 것을 보여줍니다. 화살표는 전동 난포 난포를 보여줍니다. 박사 페데리카 로페스의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : 시스플라틴 화학 요법 약물의 효과 및 독소루비신 신생아 배양 난소에 시스플라틴과 여포의 건강 손실과 여포 수의 감소에 모두 리드를 독소루비신.. (A) 시스플라틴; (B) 독소루비신 (ⅰ) 건강에 해로운 난포 (일반)의 백분율; 과 여포의 (II) 총 각 난소 (음영). 바 + SEM을 의미 나타낸다; N = 5 모든 그룹 별 제어하기가 상대적으로 유의 한 차이를 나타내는 (* P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). 모건 등 알에서 재현. 4
그림 3 :. 성장 다른 gonadotrophin 환경에 노출 모낭의 비율 값은 ± SEM (각 그룹 N ≥16) 평균 있습니다. 화살표 antra의 시작을 나타냅니다모든 gonadotrophin 그룹의 L 형성. 머레이 등 알에서 재현. (5)
그림 4 : 난포 난포 및 난소 - 난포 공동 문화의 이미지, 난포 난포 상호 작용을 보여주는 (A) 녹색 형광 단백질 (GFP) 여포와 공동 배양 한 후 야생형 (WT) 여포의 공 초점 현미경 (. WT 뿌리를 통해 연장 표시된 GFP 뿌리에서 프로세스와 GFP 발현 흰색에 여기에 표시). (B) 공동 문화 다음 GFP / WT 뿌리 복잡한 통해 크로스 섹션, WT 여포의 기저판에 인접한 인접 여포 거짓말에서 해당 GFP 프로세스 (녹색)를 표시합니다. (C) 신생아 WT 난소 사전 위전 정부 GFP 발현, 난포 그 GFP 세포와 세포 과정 (녹색)를 표시 이주한과 문화를 다음신생아 난소의 난소 interstitum을 통해. (D) GFP / WT 여포 단지는 내피 세포 마커 CD31 (적색)의 식으로 표시 내피 세포를 포함. 신경 세포 마커 베타 튜 불린 III의 표현으로 표시 신경 세포를 포함 (E) GFP / WT 뿌리 복잡한 (빨간색 여기를 참조, 또는 노란색으로 이중 표지 GFP와 함께, 녹색 경우). 신경 세포가 YFP 뿌리에서 연장 보여주는, 신경 세포 (9)의 부분 집합에 : (노란색 YFP) YFP 노란색 형광 단백질의 가끔 표현이있는 Thy1-YFP 마우스에서 모낭을 말한다 (F) YFP / WT 뿌리 복잡. 바 50 μm의 (A, B, D), 100 ㎛ (C, E, F), 100 ㎛ (A에 삽입), 10 μm의 (C에 삽입), 15 μm의 (D에 삽입). 캠벨 등 알에서 재현. 7 이 파이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오gure.
Discussion
여기서는 판매용 초기 난포 단계, 개별 전동 난포 난포 두 조직의 공동 배양 물을 함유하는 전체 신생아 난소하여 시험 관내 마우스 난포의 개발을 지원하는 데에 이용 될 수있는 다양한 배양 시스템을 설명한다.
신생아 마우스 난소의 문화는 조기 난소 개발, 보조 뿌리 단계까지 특히 난포 성장의 개시를 지원합니다. 신생아 마우스의 연령의 범위는 관심의 발달 단계에 따라, 이러한 문화 사용할 수 있습니다. 난소 신생아 쥐에서 얻은 경우, 여포 형성이 진행하지만 아직 완료됩니다 : 문화는 적어도 부분적으로 난포 성장에 따라 계속 여포 형성을 지원합니다. 또한, 시대의 네 - 투 - 오일 주위 마우스의 난소의 사용은 원시 성장 폴리 더 많은 수의 문화의 결과 (있는 시간 여포 형성은 이미 완료입니다)사이클 사용 (12). 여기에 설명 된 특정 기술의 유리한 측면은 혈청 정의되지 않은 첨가제를 전혀 사용하지 않는, 오직 αMEM 및 BSA 이루어진 매우 기본적인 매체에 큰 조직의 산소화 및 배양을 허용 부동 폴리 카보네이트 멤브레인의 사용을 포함한다. 전체 난소의 문화는 배양 된 신생아 난소 1 난포 과립 막 세포 복합체의 해부와 같은 기술의 변화를 필요로 후속 개발, 보조 뿌리 단계를 넘어 개발을 지원하지 않는 것 같습니다.
난포 개발의 후기 단계는 입체 구조를 유지하면서 배양 배란 단계로 성장 될 수있는 개별 그대로 늦은 예비 난포를 밖으로 해부하여 시험 관내에서 개발 될 수있다. 생체 내에서 발생할 때,이 배양 기법을위한 모낭 손상의 사용은 상이한 모낭 컴포넌트 간의 관계를 유지한다. 티S 배양 시스템은 후속 수정 및 배아 발달을 지원할 수 난자를 얻기 위해 사용될 수있다.
Fertilizable 난자는 난자 - 과립 막 세포 복합체 한 체외에서 배양하는 동안, 제 2 단계이어서 여기에 설명 된 많은 배양 개시 프로토콜을 사용하여 마우스의 난소로부터 신생아를 얻을 수있다. 상당히 자주 오늘날 사용되는 다른 시스템이 지원을 제공하기 알지네이트 하이드로 겔 같은 물질로 캡슐화 된 모낭 또는 난소 조직의 문화, 포함 (예를 들어, 참조, Tagler 등. 13). 방법 개발의 초점의 대부분은 현재 인간을 포함한 다양한 종으로부터 원시 낭에서 fertilisable 난자를 얻는 장기 목표로 난소 큰 포유류 모낭 배양을위한 기술을 개선하는 것이다.
어느 경우든지, 포유류 난소 interactio와, 발생 단계의 범위에 포함되어 모공자신의 규제에 영향을 미치는 모공 사이 NS. 난소 기능의 이러한 측면은 제대로 이해하고 어려운 생체 내에서 검사. 여기에서 설명하는 마지막 방법은 체외에서 모낭의 다른 단계의 개발을 지원하기 위해 공동 문화 시스템을 사용합니다. 필요한 경우, 하나 또는 둘 모두 이전에 조직의 공동 배양 생체 내 또는 시험관 내에서 사전 처리 될 수있다. 이와 같은 공동 문화 시스템은 성장하는 방법을 예를 들어, 난포 난포의 상호 작용을 조사하기에 이상적인 방법을 제공, 난포가 원시 난포 풀에 영향을 미치는 어려운 입증 난소 생물학의 측면은 지금까지 조사합니다.
조심 절개가 우발적 조직 손상을 방지하기 위해 요구되지만 전체 난소 배양 기술은 매우 간단하다. 개별 모낭의 해부 오른쪽 단계에서 난포가 난소 손상 및 손상으로부터 해부하기 전에 반복 연습을 필요로하는 전문 기술이다. 그것은 중요하다조심스럽게 개별 모낭을 해부하거나, 해부 프로토콜 중에 발생한 손상은 이후 문화 기간 동안 여포 사망을 초래할 수 있습니다. 조직 배양 처리 plasticware에 사용하는 경우, 모낭은 첨부 것이다 여포가 마이크로 타이 터 플레이트의 웰에 직접 배치되는 경우, 그것은 플라스틱에 thecal 셀 아래 도금 최소화하기 위하여, 단지 비 - 조직 배양 처리 된 플라스틱을 사용하는 것이 중요 잘베이스와 파열 그들은 성장. 모든 공 배양 작업, 조직은 서로 직접 접촉하도록 배치되어야한다.
모낭 배양 기술에 사용하기 위해 위에서 설명한 매체는 마우스 혈청의 추가를 포함한다. 그것은 소 태아 혈청과 마우스 혈청을 교체 할 수 있지만, 일괄 테스트가 적당한 공급원을 식별하기 위해 필요한 그러한 혈청 가끔 일괄 완전히 배란 여포 스테이지 개발을 지원한다. 난포 자극 호르몬 (FSH)의 배치 시험은 국제 유니으로도 좋습니다FSH는 생체 외에서 모낭 성장에만 대충 상관성을 평가한다하는 TS. 난포 파열 정기적으로 문화 기간 동안 발생하는 경우, 신선한 배치와 스톡 아스 코르 빈산 교체를 고려.
기술, 해부 현미경 및 조직 배양 인큐베이터 이외 특히 특수 장비를 필요로하지 않는 층류 후드 양호한 무균 기술의 사용은 난소가 여기에 설명 된 방법에서와 같이, 항생제의 부재 하에서 배양 될 수 있지만. 이것은 그들이 다음 기름지게 배양 할 경우 특히 난자에 항생제의 잠재적 인 악영향을 방지하기 위해 유용 할 수있다. 이 무균 환경에서 작동 할 수없는 곳에는 해부와 문화 매체에 항생제를 추가하는 것이 좋습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
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