Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Primärkultur / Co-Kultur von Maus-Eierstockgewebe, mit Eierstöcke von neugeborenen Mäusen und individuelle Eibläschen von präpubertären Mäusen. Die Kulturtechniken unterstützt Entwicklung in einer hoch physiologischer Weise ermöglicht Untersuchung der Wirkung von äußeren Mitteln an den Eierstöcken und der Wechselwirkungen zwischen Follikeln.
Abstract
Die Säugereierstocks der Follikel, die jeweils Follikel bestehend aus einer einzelnen Eizelle durch somatische Granulosazellen umgeben, zusammen innerhalb eines Basalmembran umschlossen. Eine endliche Pool der Follikel wird während der Embryonalentwicklung, bei der Eizellen in Meiosehemmung bilden eine enge Verbindung mit abgeflachten Granulosazellen und bildet Primordialfollikel gelegt. Mit oder kurz nach der Geburt, enthalten Säugetier die Eierstöcke ihre lebenslange Versorgung mit Primordialfollikel, von dem Zeitpunkt an gibt es einen stetigen Freisetzung von Follikel in den wachsenden follikulären Pool.
Der Eierstock ist besonders geeignet, um die Entwicklung in vitro, mit Follikel wächst in einem sehr physiologische Art und Weise in der Kultur. Diese Arbeit beschreibt die Kultur ganzer neonatalen Ovarien enthaltenden Primordialfollikeln und die Kultur einzelner Ovarialfollikel, ein Verfahren, das die Entwicklung der Follikel aus einem unreifen bis zur preovu unterstützen kannRegelungsstufe, nach dem ihre Eizellen in der Lage, die Befruchtung in vitro unterzogen werden. Die hier vorgestellte Arbeit nutzt Kultursystemen zu bestimmen, wie die Eierstöcke durch Exposition gegenüber externen Verbindungen betroffen. Wir beschreiben auch ein Co-Kultursystem, die Untersuchung der Wechselwirkungen, die zwischen den reifenden Follikel und der nicht-wachsenden Pool von Primordialfollikeln auftreten können.
Introduction
Die Säugetier-Eierstock der lebenslange Versorgung mit Eizellen einer Frau, die jeweils in einem Ovarialfollikel enthalten zusammen. Die Follikel sind vor der Geburt auf dem Rast gebildet, Ur-Phase: sobald die Follikel-Pool aufgebaut ist, gibt es einen kontinuierlichen und schrittweisen Bewegung der Follikel aus dem Ur in den wachsenden Follikel Pool. Da Follikel beginnen zu wachsen, entwickeln sie sich durch die primäre, sekundäre, präantralen und antralen Stufen, bis sie die präovulatorischen oder Graaf, Stadium zu erreichen. Nur Oozyten aus Follikeln präovulatorischen haben die volle Entwicklungskompetenz, in der Lage, die embryonale Entwicklung zu tige Unterstützung, wenn befruchtet.
Der Eierstock ist seit langem bekannt, um in einer hoch physiologischer Weise in vitro zu entwickeln. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, jedes Ovarialfollikel die erforderlich sind, um eine Eizelle aus dem unreifen Stadium (an welcher Stelle es nicht in der Lage, seine Reifeteilung abgeschlossen ist) bis hin zu T-Zellen unterstützt, die in ihmer entwicklungs zuständigen Stufe (an welcher Stelle es voll unterstützen die Beendigung der Meiose, die Befruchtung und die Entwicklung der resultierenden Embryo tige).
Die physiologische Natur des Eierstocks Entwicklung in vitro hat die breite Verwendung von Eierstock Kulturtechniken geführt. Folglich wird in-vitro-Verfahren sind verwendet worden, um die Regulation der Entwicklung Ovar, Eierstock- Pathologie (zum Beispiel, dass der polyzystischen Ovarien, PCOS), zu prüfen, wie die Eierstöcke / Oozyten durch Chemikalien beeinflusst, und auch mit dem konkreten Ziel untersuchen Erhalt befruchtungs Eizellen aus primordialen Follikeln. Bisher hat die letztere erreicht nur mit Maus Ovarialgewebe 1, obwohl Kulturtechniken unter Verwendung von großen Follikeln Säugetieren, einschließlich Menschen, haben sich in den letzten Jahren 2,3 verbessert.
Wir beschreiben hier verschiedene Kulturmethoden mit der Maus Eierstockgewebe. Die erste method verwendet Ganz neonatalen Mauseierstöcken, und unterstützt die Bildung und die frühe Entwicklung der Primordialfollikel 4. Das zweite System unterstützt das Wachstum von einzelnen, intakten Follikeln vom späten präantralen zum preovulatory Stufe; mit dieser Technik können Follikel einzeln paar 5,6 kultiviert werden, oder. Schließlich beschreiben wir eine Co-Kultursystem, die Kombination der ersten beiden Techniken in einer Methode, die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen wachsenden und primordialen Eierstockfollikeln 7 erlaubt.
Kultur einzelner intakt Eibläschen ermöglicht Follikelwachstum, um der täglichen Follikel Messungen während der Kulturzeit bestimmt werden, während die Mittelanalyse ermöglicht Untersuchung der Follikel / Eierstock Hormonproduktion. Weitere Tissue Analysen können durch eine Sammlung von Follikel oder Eierstockgewebe am Ende der Kultur erreicht werden kann, für die histologische / immunhistologische Analysen oder für die Weiterverarbeitung beispielsweise zu erhalten,mRNA oder Proteinen.
Protocol
Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter Lizenz von der britischen Home Office (Projektlizenznummer PPL 60/1726 und 60/4026) durchgeführt.
Hinweis: Haus Tiere gemäß UK gesetzlichen Anforderungen in einem 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit Photoperiode. Verhaltenstierversuche mit Wildtyp-Mäusen C57BL6J, Tau-GFP-Mäuse, die ubiquitäre Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 8 und Thy1-YFP Mäusen mit gelegentlichen Ausdruck gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in einer Untergruppe von neuronalen Zellen 9 haben: sowohl transgenen Linien wurden auf einem C57BL6J Hintergrund gezüchtet.
1. Arbeitsbedingungen und die Vorbereitung der Instrumente
- Führen Sie alle Medienherstellung, Gewebe Dissektionen und Kulturarbeit in einer Sterilbank, um die Sterilität zu gewährleisten: diese die Anforderungen der Beigabe von Antibiotika in Medien vermeidet.
- Immer erlauben Medien / Kulturplatten / Embryo Gerichte ins Gleichgewichtfür mindestens 1 Stunde in einem 37 ° C-Ofen (dissection Medium / Embryo Geschirr) oder 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator (Kulturmedium und Platten), vor der Verwendung.
- Genießen Glaspipetten in 0,1% Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) für etwa eine Stunde, und dann trocknen lassen. Ziehen Pipetten in der Flamme eines Bunsenbrenners, Biegen der Glas wie Sie dies tun, um fein gezeichneten gebogenen Glaspipetten zu produzieren. Nachdem die Pipette gezogen wird, machen einen sauberen Schnitt mit einem Glasschneider. Ofen bei 160 ° C sterilisieren etwa 45 min.
HINWEIS: Im Kaufhaus in dieser Glaspipetten werden benötigt, um die Eierstöcke und die Follikel zu übertragen.
2. Herstellung von Dissection und Kultur Medien
- Bereiten Dissektion Medium.
- Man löst 3 mg / ml BSA in Leibowitz L15 Medium und durch einen 0,2 & mgr; m Poren, 25 mm Durchmesser Filter sterilisieren.
- Neonatal Eierstock Kultur.
- Medium für neonatale Eierstock Kultur vorzubereiten, machen 1 ml Medium für Bildung und Kulturh Ovar, die kultiviert wird. Man löst 3 mg / ml BSA in α-Minimal Essential Media (& agr; MEM), und durch einen 0,2 & mgr; m Poren, 13 mm Durchmesser filtersterilisieren in ein steriles Röhrchen.
- Um Platten für neonatale Eierstock Kultur vorzubereiten, 1 ml der Neugeborenen-Eierstock Kulturmedium in jede Vertiefung (ein Eierstock pro Vertiefung) einer 24-Well-Platte. Mit einer sterilen Uhrmacher Pinzette, legen Sie eine Polycarbonatmembran über dem Medium in jedem Well, glänzende Oberfläche auf. UV sterilisieren Membranen vor der Verwendung.
- Follikel-Kultur.
- Medium für Follikel Kultur vorzubereiten, zu ergänzen, α-Minimal Essential Media mit 1 IU / ml rekombinantes humanes Follikel-stimulierendes Hormon, 5 ug / ml Ascorbinsäure und 5% v / v Serum von erwachsenen weiblichen Mäusen erhalten. Filter sterilisiert durch einen 0,2 & mgr; m Poren, ø 13 mm-Filter in ein steriles Röhrchen.
- Filter sterilisieren Silikonöl durch einen 0,45 & mgr; m Poren, Durchmesser 25 mm Filter, in ein steriles Röhrchen.
- Um pla vorbereitentes, werden 30 & mgr; l Tröpfchen der Follikel Kulturmedium in jede Vertiefung einer nicht-Gewebekultur behandelten 96-Well-Mikrotiter-Rund-Well-Platte, die nur die obere Reihe jeder Platte (damit Follikel in neuen Zeilen pro Tag über bewegt werden Die Kulturzeit). Sorgfältig überlagern Medium mit 70 ul sterilisiertes Silikonöl, bis mittlere Verdunstung zu verhindern.
- Follikel-Ovar Co-Kultur.
- Bereiten Medium für Eierstock-Follikel-Co-Kultur wie für Follikel Kultur in Schritt 2.3.1, aus denen 1 ml Medium für jeden Follikel-Eierstock Co-Kultur aufgebaut.
- Zur Herstellung von Platten, 1 ml Medium in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. Mit einer sterilen Uhrmacher Pinzette, legen Sie eine Nucleopore Membran oben auf dem Medium in jedem Well, glänzende Oberfläche auf. UV sterilisieren Membranen vor der Verwendung.
3. Neonatal Ovar Dissection und Kultur
- Zeigen 1 ml Dissektion Medium in jedem sterilen Glas Embryo Gericht. <li> Cull neonatalen Maus Jungtieren zwischen postnatalen Tag 0 und 5 Jahren, Keulung durch Enthauptung nach britischen Innenministeriums Vorschriften.
- Fassen Sie die Haut, welche die Bauchwand unter Verwendung eines Paares von feinen Sezierung einer Pinzette und machen einen großen Einschnitt in der Haut und Körperwand. Ziehen Sie die Schnittführung, so dass die gesamte Unterleib ausgesetzt ist. Die Blase ist in der Regel in diesem Stadium angeschwollen und punktiert werden, um Dissektion einfacher.
- Bewegen Sie den Mut, aus dem Weg mit Uhrmacher Pinzette. Folgen der Uterushörner von der Harnblase bis zu der Niere auf jeder Seite. Der Eierstock ist knapp unterhalb der Niere an der Spitze der Gebärmutter und wird als Cloud-ähnliche Struktur unter einem Binokular angezeigt.
- Fassen Sie den Eierstock vorsichtig mit Uhrmacher Zangen, und verwenden Sie eine Schere, um ihre Anbringung an der Gebärmutter zu durchtrennen. Übertragen Sie das Paar Eierstöcke in Embryo Schalen mit vorgewärmten Dissektion Medium.
- Führen Sie die Fein Dissektion der Eierstöcke unter Dissektionsmikroskop auf einem beheizten stage (37 ° C). Verwenden Sie Insulin Nadeln zu schneiden Sie die Bursasack und überschüssiges Material einschließlich der Eileiter, bis nur noch der Eierstock bleibt.
- Übertragen Sie jede Eierstock in die Vertiefung einer Kulturplatte in Schritt 2.2.2 oben hergestellt, mit einem fein gezeichneten gebogenen Glaspipette, ein Eierstock oben auf jeder Membran (siehe 1A). Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
- Ändern Sie jeden zweiten Tag das Medium. Mit einer Pipette auf 50% des Mediums in jeder Vertiefung für vorge vergast frisches Medium austauschen: Platz am Rand des Brunnens mittel die Pipettenspitze zu vermeiden, die Membran zu stören.
- Pflegen Kulturen für bis zu 6 Tage.
- Am Ende der Kultur, Gefriert Medium und zu beheben oder Einfrieren Eierstöcke nach einer kurzen Waschung in PBS, je nach Bedarf.
- Fix Ovarien in Bouins Fixativ für 90 min für die histologische Analyse, oder in 10% neutral gepuffertem Formalin für 90 min für immunhistologische Analysen. Schnellfrosteierstöcken, indem Gewebe inein Polypropylenrohr, indem das Röhrchen in Trockeneis für 5-10 Minuten vor dem Einfrieren bei -70 ° C für die nachfolgende Protein oder mRNA-Extraktion.
4. Follikel Dissection und Kultur
- Cull 19-23 Tage alte weibliche Mäuse und zu isolieren, die Eierstöcke. Befeuchten Sie das Fell mit 70% Ethanol, bevor Sie irgendwelche Einschnitte. Halten Sie die Haut mit glatten Enden Zangen und machen einen großen Bauchschnitt mit Dissektion Schere, durchdringt sowohl die Haut und die Körperwand.
- Bewegen Sie den Darm aus dem Weg mit einem feineren Satz von Dissektionsinstrumente und suchen Sie die Gebärmutter. Folgen der Gebärmutter bis Ovars, der unterhalb der Niere auf jeder Seite befindet.
- Gently Greifen der Eierstock mit einem Paar Uhrmacher Zangen, trennen Eierstöcke Befestigung an der Gebärmutter mit feinen Sezierung Schere. Vermeiden Sie sammeln zu viel von der Eierstock-Fettpolster. Sammeln Sie die Eierstöcke und die Überführung in ein Embryo Schalen mit vorgewärmten Dissektion Medium.
- Rebewegen Sie den Eierstock Bursa mit Insulin Nadeln wegschneiden die Bursasack und überschüssiges Material einschließlich der Eileiter, bis nur noch der Eierstock bleibt. Etwa die zu halbieren jedes Ovar mit Insulin Nadeln.
- Jede Eierstock-Hälfte vorsichtig in ein individuelles Uhrenglas, das 1 ml Dissektion Medium zu übertragen. Cover jede Uhrglas mit einem Glasobjektträger um die Verdampfung des Mediums zu verhindern und Sterilität zu gewährleisten.
- Shop Uhrengläser mit Ovar Hälften in einem 37 ° C heißen Ofen, bis sie benötigt, aber die Durchführung der nächsten Sektion Schritt so schnell wie möglich. Verwerfen Gewebe auf diese Weise für mehr als eine Stunde gelagert.
- Über Uhrglas, die einen Eierstock die Hälfte auf eine 37 ° C erhitzt Mikroskoptisch in einer Sterilbank. Rund sezieren Eierstock in große Stücke mit zwei Insulin-Nadeln, um spät vorge Antralfollikeln identifizieren wie folgt: diese werden 2-3 Schichten von Granulosazellen enthalten und einen Durchmesser von etwa 180 bis 200 & mgr; m.
- Manuelles sezieren jegliche identified Follikel mit einem Insulin Nadel und eine 30 x 0,25 mm Akupunkturnadel, die in einem Nadelhalter befestigt ist. Seien Sie vorsichtig, um die meisten der umliegenden Stroma zu entfernen, aber um eine Beschädigung der Basalmembran der Follikel (siehe Abbildung 1B).
- Verwenden Sie einen fein gezeichneten gebogenen Glaspipette sorgfältig über seziert Follikel in einen Auffang Uhrglas, die vorgewärmte Dissektion Medium. Achten Sie darauf, Follikel innerhalb der dünnen Kalibers Abschnitt Pipette halten, um nicht zu verlieren Follikel.
- Messen Follikel genau mit einem kalibrierten Okular-Strichplatte in einem Binokular ausgestattet.
- Wählen Follikel für die Kultur, wenn sie 190 ± 10 um im Durchmesser messen. Weitere wählen nur gesund, Kugel Follikel für Kultur; diese werden durchlässig sein, ohne dunkle atretischen Bereichen und eine intakte Basalmembran, zusammen mit etwas befestigt thekalen Gewebe: werfen Sie alle Follikel, die nicht passen diese Beschreibung. Es wurde eine Ausbeute von 10-15 Follikel pro Eierstock ist gut.
- Verwenden Sie einen fein gezeichneten gebogenen Glaspipette, um eine einzelne Follikel in die Vertiefung einer Platte erfunden, wie in Schritt 2.3.3 zu übertragen. Vorsichtig die Follikel im Boden der Vertiefung (und nicht in der oberen Ölschicht). Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
- Kultur Follikel für bis zu 6 Tagen, bewegen Follikel in einen Brunnen mit frischem Medium jeden Tag.
- Bereiten Sie die nächste Zeile in der 96-Well-Platte wie in Plattenherstellung in Schritt 2.3.3. Rückstellplatte in den Inkubator für mindestens eine Stunde, um ein Gleichgewicht zu ermöglichen. Übertragen Follikel an die frische Brunnen des Mediums, mit einem fein gezeichneten Glaspipette.
- Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt in der Kultur Follikel für zwei Tage, bevor sie in frisches Medium belassen werden, legen jedes Follikel in einem Minimum von 60 & mgr; l (anstatt 30 & mgr; l) Tröpfchen von Follikel Kulturmedium.
- Um Daten über das Wachstum der Follikel zu sammeln, messen Follikel täglich, mit einem eyepiece Strichplatte in einem Binokular ausgestattet. Die Ölschicht wird Messungen Follikeldurchmesser verzerren, so erarbeiten die Kalibrierungskoeffizienten für das Set-up.
- Am Ende der Kultur, Einfrieren Medium und fixieren oder Gefriert Gewebe für eine anschließende Analyse, wie in Schritt 3.10 oben.
- Follikelstimulierendes Follikel Co-Kultur.
- Kultur zwei Follikel zusammen, um Wechselwirkungen zwischen Follikel zu untersuchen. Kultur wie oben, jedoch legen zwei Follikel Seite-an-Seite, in Kontakt sind, in einem Brunnen.
- Platzieren 100 ul Tröpfchen Follikel Kulturmedium in jede Vertiefung einer nicht-Gewebekultur behandelten 96-Well-Mikrotiter-Flach-Well-Platte überlagert Medium mit 100 & mgr; l sterilisiertes Silikonöl. Follikel an die frische Brunnen wie in Schritt 4.13 oben übertragen Sie nicht, sondern beauftragen Sie einen feinen Gel-Spitze des Mediums ändern 50% jeden zweiten Tag.
- Um Gewebe Ursprung innerhalb der Co-Kultur zu identifizieren, Follikel Kokultur jeweils von einem anderen genetischen Quelle, beispielsweise one aus dem Eierstock eines Wildtyp-Maus, und das andere aus dem Eierstock einer Maus mit ubiquitären Expression von GFP. Bei der Verwendung von GFP oder YFP Gewebe minimieren Exposition von Gewebe, um so viel wie möglich Licht, während der Kultur, und durch die Fixierung / Verarbeitungsschritte danach.
HINWEIS: Es ist normal, dass sich die beiden Follikel in einem einzigen, "Zwei-Follikel" Einheit wachsen (siehe Abbildung 1C).
5. Follikel-Eierstock-Co-Kulturen
- Sezieren Eierstöcke und Follikel wie in den Abschnitten 3 und 4 oben.
- Platzieren einer neonatalen Ovar auf einer Membran, einer Platte, wie in Schritt 2.4.2 oben hergestellt. Vorsichtig einen einzigen Follikel in Kontakt mit einem Pol der neonatalen Eierstock, mit einer fein ausgezogenen gekrümmten Glaspipette. Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für bis zu 5 Tage.
- Um zwischen dem Ursprungsgewebe innerhalb der Co-Kultur zu unterscheiden, verwenden Eierstöcke und Follikel aus zwei verschiedenen sources, beispielsweise eine von einer Wildtyp-Maus und einer von einer Maus mit ubiquitären Expression von GFP.
- Ersetzen 500 ul Medium täglich, wie in Schritt 3.8 vor, jedoch unter Verwendung von Follikel-Kulturmedium. Während Co-Kultur, die Follikel wird oft vom Ovar (1D) eingekapselt.
- Am Ende der Kultur, Einfrieren Medium und fixieren oder Gefriert Gewebe für eine anschließende Analyse, wie in Schritt 3.10 oben.
6. Fixierung, Immunzytochemie und Imaging von kultivierten Gewebe
- Am Ende der Kultur, waschen Gewebe in PBS und Transfer zum 100 ul (Follikel) oder 1 ml (Eierstock) von 10% neutral gepuffertem Formalin, und befestigen Sie 1 Stunde lang auf Eis. Bewegen sich durch 3 Waschungen mit 1x PBS bei 4 ° C.
- Für Immunzytochemie auf Follikel Übertragung zwischen den Wells einer 96-Well-Mikrotiter-Rund-Well-Platte mit einer fein ausgezogenen gekrümmten Glaspipette, wobei jede Vertiefung mit verschiedenen Waschungen oder Behandlungen.
- Für Immunzytochemie auf ovaries (oder Eierstock-Follikel-Co-Kulturen), Einbettung in 4% Agarose-Gel und Abschnitt 50 um unter Verwendung einer vibrotome. Schwimmer Abschnitte in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen zu Waschungen oder Behandlungen anzuwenden, das Entfernen mit einer Pipette.
- Für die Bildgebung: übertragen Agarose Abschnitte Flachglasobjektträger und montieren mit Montageträger; oder Übertragung Follikel (oder Follikel Follikel-Komplexe), um den Hohlraum Glasobjektträger und montieren mit nicht-härtendes Eindeckmittel. Bild Proben mit einem konfokalen Mikroskop.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt Bilder der Eierstöcke und der Follikel zu Beginn und während der Kulturverfahren.
Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse von Neugeborenen Eierstöcke (hier, Eierstöcke von neugeborenen Welpen) auf reproduktionstoxische Stoffe während Kultur ausgesetzt. Neonatal Ovarien wurden 6 Tage am Tag 2 der Kultur kultiviert wird, und auf ein Chemotherapeutikum ausgesetzt, Cisplatin oder Doxorubicin. Am Ende der Kultivierung wurden die Eierstöcke befestigt, für die Histologie verarbeitet und Ovarien dann untersucht, um die Anzahl von gesunden und ungesunden Eierstockfollikeln 4 bestimmen. Alternativ kann eine schnelle Beurteilung der frühen wachsenden Follikel aus der Kultur von Eierstock-Fragmente erhalten werden, unter Verwendung der Eierstöcke einer Maus, einer Eizelle, fluoreszierenden Markierung 10 exprimieren.
In der Kultur der einzelnen Follikel, Follikelwachstum kann durch tägliche Messungen während der Cul ermittelt werdentur Periode, Fig. 3 zeigt repräsentative Ergebnisse der Follikelwachstum in Gegenwart oder Abwesenheit der Gonadotropin Hormone kultiviert follikelstimulierendes Hormon (FSH) und luteinisierendes Hormon (LH) 5.
Follikelstimulierendes Follikel oder Follikel-Ovar Cokultur verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen den Follikeln zu untersuchen. In Abhängigkeit von dem Gewebe und Verarbeitung, können Bilder mit Hellfeld-, Fluoreszenz- oder konfokalen Mikroskopen erhalten werden, Fig. 4 zeigt repräsentative Ergebnisse von Bildern von solchen Co-Kulturen, einer Prüfung der verschiedenen in Follikel-Follikel Kommunikation beteiligten Zelltypen, einschließlich Endothel- und neuronalen Zellen 7.
Abbildung 1: (A) Mikroskopische Aufnahme eines Neugeborenen Eierstock von einer Maus am Tag der Geburt erhalten, platziert auf einer Polycarbonatmembran. (B): Mikroskopische Aufnahme von frisch präpariert gesunde Ovarialfollikel, mit den meisten der umliegenden Stroma-Gewebe seziert entfernt. (C) Mikrophotographien der Co-Kultur von zwei Follikel im Laufe der ersten drei Tage der Kultur, welche den engen Kontakt zwischen den beiden Follikel als Kultur Erlös (Ci entwickelt: am ersten Tag der Kultur; Cii: zweiten Tag der Kultur; CIII : dritten Tag der Kultur). Nach zwei Tagen der Kultur von Spears et al wiedergegeben. 11 (D) Mikroskopische Aufnahme cokultiviert präantralen Follikel und Neugeborenen Eierstock. Bild zeigt die Follikel immer vom Ovar gekapselt. Pfeil zeigt präantralen Follikel. Bild von Dr. Federica Lopes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2 "src =" / files / ftp_upload / 52.458 / 52458fig2.jpg "/>
Figur 2: Wirkung der Chemotherapeutika Cisplatin und Doxorubicin neonataler kultivierten Ovarien Cisplatin und Doxorubicin Beides führt zu Verlust von Follikel Gesundheit und einer Verringerung Follikel Zahlen.. (A) Cisplatin; (B) Doxorubicin: (i) Prozentsatz der ungesunden Follikel (clear); und (ii) der Anzahl der Follikel (schattiert) in jedem Eierstock. Bars bezeichnen Mittelwert ± SEM; n = 5 für alle Gruppen, Sterne bezeichnen signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle (* p <0,05, ** p <0,01 *** p <0,001). Von Morgan et al wiedergegeben. 4
Abb. 3: Die Wachstumsraten der Follikel zu unterschiedlichen Gonadotropin Umgebungen ausgesetzt Werte sind Mittelwerte ± SEM (n ≥16 für jede Gruppe). Pfeil zeigt den Beginn antral Bildung in allen Gonadotropin Gruppen. Von Murray et al wiedergegeben. 5
Abbildung 4: Bilder aus der Follikel Follikel und Eierstock-Follikel-Co-Kulturen, welche Follikel Follikel Wechselwirkungen (A) konfokale mikroskopische Aufnahme eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Follikel und eine Wildtyp (WT) Follikel nach der Co-Kultur (. hier weiß dargestellt GFP-Expression), mit Prozessen von der gezeigten GFP Follikel, die sich über dem WT Follikel. (B) Querschnitt durch eine GFP / WT Follikel komplexen folgenden Co-Kultur, die zeigen, dass GFP-Prozessen (grün) von der benachbarten Follikel liegen neben der Basalmembran des WT Follikel. (C) Neonatal WT Eierstock nach Kultur mit einem Pre-antralen GFP-exprimierenden Follikel, die zeigen, dass GFP-Zellen und zelluläre Prozesse (grün) haben migriertdurch die Eierstock interstitum des Neugeborenen Eierstock. (D) GFP / WT Follikel Komplex, Endothelzellen, durch Expression von endothelialer Zellmarker CD31 (rot) dargestellt. (E) GFP / WT Follikel Komplex, der Nervenzellen, durch Expression von neuronalen Marker Tubulin beta III gezeigt (siehe hier als rot oder gelb, wenn doppelt markierten mit GFP, grün). (F) YFP / WT Follikel Komplex, in dem YFP bezieht sich auf von einem Thy1-YFP-Maus, die gelegentlich Expression gelb fluoreszierendes Protein Follikel (YFP: gelb) in einer Untergruppe von neuronalen Zellen 9, die zeigen, dass Neuronen aus dem YFP Follikel erstrecken. Bars 50 um (A, B, D), 100 um (C, E, F), 100 um (Einschub in A), 10 um (Einschub in C), 15 & mgr; m (siehe Einschub in D). Von Campbell et al reproduziert werden. 7 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieses fi sehenAbbildung.
Discussion
Wir beschreiben hier verschiedene Kultursysteme, die genutzt werden, um die Entwicklung der Maus Eibläschen in vitro zu unterstützen, unter Verwendung von Voll Neugeborenen Eierstöcke nur die frühesten Follikelstadien, individuelle präantralen Eibläschen und auch Co-Kulturen der beiden Gewebe enthalten werden.
Kultur der Neugeborenen Maus Eierstöcke unterstützt frühen Eierstockentwicklung, insbesondere Follikelwachstum Initiierung bis zur sekundären Follikel Bühne. Ein Bereich von Alter von neugeborenen Mäusen können für diese Kulturen verwendet werden, je nach den Entwicklungsstadien von Interesse. Wenn die Eierstöcke von neugeborenen Mäusen erhalten wird Follikelbildung sein im Gange, aber noch nicht abgeschlossen: Kultur wird fort Follikelbildung gefolgt von Follikelwachstum zumindest teilweise zu unterstützen. Alternativ (zu welcher Zeit Follikel Bildung ist bereits) Verwendung von Ovarien von Mäusen etwa vier bis fünf Tage alten Kultur der Ergebnisse in einer größeren Anzahl von ursprünglichen und wachsende follikel 12. Vorteilhafte Aspekte der hier beschriebenen speziellen Verfahren umfassen die Verwendung von schwimmenden Polycarbonatmembranen, die größer ist die Sauerstoffversorgung des Gewebes, und die Kultur in einem sehr basischen Medium, das nur aus & agr; MEM und BSA zu ermöglichen, wobei die Verwendung von nicht definierten Zusatzstoffen wie Serum. Kultur ganzer Ovarien scheint nicht unterstützt Entwicklung jenseits der sekundären Follikel Stufe mit anschließender Entwicklung eine Änderung der Technik, wie beispielsweise die Zerlegung von Follikel-Granulosazellen Komplexe aus der kultivierten neonatalen Ovar 1 erfordern.
Späteren Stadien der Follikel-Entwicklung in vitro durch Sezieren individuelle, intakte Ende vorge Antralfollikel, der präovulatorischen Phase Kultur unter Beibehaltung ihrer dreidimensionalen Struktur gezüchtet werden können entwickelt werden. Die Verwendung von intakten Follikel für diese Kulturtechnik hält die Beziehung zwischen den verschiedenen Komponenten, wie follikuläre in vivo auftritt. This Kultursystem kann verwendet werden, um Eizellen, die Befruchtung und die anschließende Entwicklung des Embryos unterstützen kann erhalten werden.
Befruchtungs Oocyten können aus Maus neonatalen Ovarien Verwendung einer anfänglichen Kulturprotokoll viel wie hier beschrieben, gefolgt von einer zweiten Stufe, während der Oozyten-Granulosazellen Komplexe in vitro 1 gezüchtet, erhalten werden. Andere Systeme ziemlich heute häufig verwendet werden, umfassen Kultur Follikel oder Eierstockgewebe, das in einem Material, wie Alginat Hydrogels eingekapselt wurde, zu unterstützen (siehe beispielsweise Tagler et al. 13). Das Schwergewicht der Verfahrensentwicklung ist es nun, Kulturtechniken für die Eierstöcke und die Follikel größeren Säugetieren zu verbessern, mit dem langfristigen Ziel der Gewinnung befruchtungs Oozyten von Primordialfollikeln aus einer Reihe von Spezies, einschließlich Menschen.
Zu einem beliebigen Zeitpunkt, Säugereierstöcke enthalten Follikel in einer Reihe von Entwicklungsstadien, mit Zusans zwischen Follikel beeinflussen deren Regulation. Dieser Aspekt der Funktion der Eierstöcke ist wenig bekannt und schwer zu in vivo zu untersuchen. Die hier beschriebene endgültige Methode verwendet Co-Kultur-Systeme, um die Entwicklung von verschiedenen Stadien der Follikel in vitro zu unterstützen. Bei Bedarf können eine oder beide Gewebe können in vivo oder in vitro vor der Co-Kultur vorbehandelt werden. Co-Kultur-Systeme, wie dies eine ideale Weise, in der Follikel-Follikel-Wechselwirkungen zu untersuchen, zum Beispiel, wie wächst Antralfollikeln beeinflussen Primordialfollikel Becken, Aspekte ovarian Biologie, die schwierig erwiesen haben bis jetzt untersucht.
Ganze Eierstock Kulturtechniken sind relativ einfach, auch wenn sorgfältig seziert und wird benötigt, um ein versehentliches Gewebeschäden zu vermeiden. Dissektion der einzelnen Follikel ist eine spezialisierte Technik und erfordert wiederholte Praxis vor Follikel an der richtigen Stufe kann aus dem Eierstock intakt und unbeschädigt seziert werden. Es ist kritischsorgfältig sezieren einzelne Follikel oder Schäden während der Präparation Protokoll aufrechterhalten können in Follikel-Tod während der anschließenden Kulturzeitraums führen. Wo Follikel werden direkt in die Vertiefung der Mikrotiterplatten ist es wichtig, nur nicht-Gewebekultur-behandelten Kunststoffe, zu minimieren Plattieren unten von Thekazellen auf die Kunststoff: bei der Gewebekultur behandelten Kunststoffprodukte verwendet wird, wird die Follikel zum Befestigen Boden der Vertiefung und Bruch, wie sie wachsen. Für alle Co-Kulturarbeit muss das Gewebe direkt in Kontakt miteinander gebracht werden.
Die vorstehend zur Verwendung in der Follikel Kulturtechnik detailliert Medium enthält den Zusatz von Mausserum. Es ist möglich, die Maus-Serum mit fetalem Rinderserum ersetzt, sondern nur gelegentlich Chargen solcher Seren voll unterstützen Follikelentwicklung zu der präovulatorischen Phase mit Chargenprüfung erforderlich, um geeignete Quellen zu identifizieren. Batch-Prüfung von FSH ist auch ratsam, die Internationale Units, mit dem FSH Korrelat Follikelwachstum in vitro untersucht nur grob. Wenn Follikelrupturen routinemäßig während des Kulturzeitraums auftritt, sollten Sie sie ersetzen Lager Ascorbinsäure mit einer frischen Charge.
Die Techniken erfordern nicht besonders spezialisierte Ausrüstung außer Sezieren Mikroskope und Gewebekultur-Inkubatoren, obwohl die Verwendung einer Steril und guter steriler Technik ermöglichen die Eibläschen, in Abwesenheit von Antibiotika als in den hier beschriebenen Verfahren kultiviert werden. Dies kann hilfreich sein, um jede mögliche nachteilige Wirkung von Antibiotika auf den Oozyten zu vermeiden, insbesondere wenn sie folgende Kultur befruchtet werden. Wo es nicht möglich ist, in einer sterilen Umgebung zu arbeiten, ist es ratsam, Antibiotika zur Präparation und Kulturmedien hinzuzufügen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
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