Summary
Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell'effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici.
Abstract
L'ovaio mammiferi è composto di follicoli ovarici, ogni follicolo costituito da un unico ovocita circondato da cellule della granulosa somatiche, racchiusa all'interno di un insieme membrana basale. Un pool finito di follicoli è stabilito durante lo sviluppo embrionale, quando gli ovociti in arresto meiotico formano una stretta associazione con le cellule della granulosa appiattite, formando follicoli primordiali. Con o subito dopo la nascita, le ovaie dei mammiferi contengono fornitura del loro ciclo di vita dei follicoli primordiali, da quale punto in poi vi è un rilascio costante di follicoli in piscina follicolare in crescita.
L'ovario è particolarmente suscettibile di sviluppo in vitro, con follicoli in crescita in un modo altamente fisiologica in coltura. Questo lavoro descrive la cultura di intere ovaie neonatali contenenti follicoli primordiali, e la cultura dei singoli follicoli ovarici, un metodo in grado di sostenere lo sviluppo di follicoli da un immaturo fino alla preovufase normativo, dopo di che i loro ovociti sono in grado di sottoporsi a fecondazione in vitro. Il lavoro qui delineato utilizza sistemi di coltura per determinare come l'ovaio è influenzato da esposizione a composti esterni. Noi descriviamo anche un sistema di co-coltura, che permette di indagine delle interazioni che avvengono tra follicoli in crescita e la non crescente di follicoli primordiali.
Introduction
L'ovaio mammiferi si compone di fornitura a vita di una femmina di ovociti, ciascuno inserito in un follicolo ovarico. I follicoli sono formati prima della nascita al riposo, fase primordiale: una volta la piscina follicolo è stabilito, c'è un movimento continuo e graduale follicoli dalla primordiale nella piscina follicoli in crescita. Come follicoli iniziano a crescere, si sviluppano attraverso le fasi primarie, secondarie, preantrali e poi antrali, fino a raggiungere il preovulatorio, o di Graaf, stage. Solo ovociti da follicoli preovulatory hanno piena capacità di sviluppo, in grado di supportare lo sviluppo embrionale a termine, se fecondato.
L'ovaio è nota da tempo per sviluppare in modo altamente fisiologica in vitro. Ciò è probabilmente dovuto ad ogni follicolo ovarico contiene al suo interno le cellule necessarie a sostenere un ovocita dalla fase immaturo (a questo punto non è in grado di completare la sua divisione meiotica) fino alla tegli fase evolutivamente competente (a questo punto può supportare pienamente il completamento della meiosi, fecondazione e sviluppo dell'embrione risultante al termine).
La natura fisiologica dello sviluppo dell'ovaio in vitro ha portato l'ampio uso di tecniche di coltura ovariche. Di conseguenza, i metodi in vitro sono stati utilizzati per studiare la regolazione dello sviluppo dell'ovaio, patologia ovarica (ad esempio quello della sindrome dell'ovaio policistico, PCOS), esame di come ovaie / ovociti sono influenzati dall'esposizione a sostanze chimiche, e anche con l'obiettivo concreto di ottenere ovociti fertilizable di follicoli ovarici primordiali. Ad oggi, il secondo è stato raggiunto solo con il mouse tessuto ovarico 1, anche se le tecniche di coltura utilizzando follicoli di grandi mammiferi, compreso l'uomo, hanno notevolmente migliorato negli ultimi anni 2,3.
Descriviamo qui diverse metodi di coltura utilizzando il mouse tessuto ovarico. Il primo method utilizza intere ovaie neonatali di topo, e sostiene la formazione e lo sviluppo precoce di follicoli primordiali 4. Il secondo sistema supporta la crescita dei singoli, intatte follicoli ovarici dal tardo preantrali alla fase preovulatoria; Usando questa tecnica, follicoli possono essere coltivati singolarmente, o in coppia 5,6. Infine, si descrive un sistema di co-coltura, combinando le prime due tecniche in un metodo che permette di indagine delle interazioni tra crescita e follicoli ovarici primordiali 7.
Cultura dei singoli follicoli ovarici intatti permette la crescita del follicolo da determinare da misure follicolo al giorno nel periodo di coltura, mentre l'analisi di medio consente indagine follicolo / produzione di ormoni dell'ovaio. Ulteriori analisi tissutali possono essere raggiunti da un insieme di follicoli o tessuto ovarico a fine coltura, per analisi istologiche / immunoistologici o per successive lavorazioni per esempio per otteneremRNA o proteine.
Protocol
Tutto il lavoro degli animali è stato effettuato in conformità con le linee guida istituzionali su licenza dalla UK Home Office (numero di licenza del progetto PPL 60/1726 e 60/4026).
Nota: animali Casa in conformità con i requisiti legali del Regno Unito in una luce 14 ore e 10 ore fotoperiodo scuro. Condurre esperimenti su animali con topi C57Bl6J wild type, topi Tau-GFP che hanno espressione ubiquitaria di proteina verde fluorescente (GFP) 8, e Thy1-YFP topi con espressione occasionale di proteina fluorescente gialla (YFP) in un sottogruppo di cellule neuronali 9: sia linee transgeniche sono stati allevati su uno sfondo C57Bl6J.
1. Condizioni di lavoro e di preparazione degli strumenti
- Eseguire tutta la preparazione media, dissezioni tessuto, e il lavoro cultura in una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità: questo evita il requisito dell'aggiunta di antibiotici ai media.
- Consenti sempre media / piastre di coltura / stoviglie embrione equilibrareper almeno 1 ora, in un forno a 37 ° C (medio dissezione / piatti embrione) o 37 ° C, 5% CO 2 incubatore (terreno di coltura e piastre), prima dell'uso.
- Immergere pipette di vetro in soluzione allo 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) per circa un'ora, e poi lasciare asciugare. Tirate pipette nella fiamma di un becco Bunsen, piegando il vetro mentre lo fate, per la produzione di pipette di vetro curvato finemente disegnate. Dopo la pipetta è tirato, effettuare un taglio netto con un cutter vetro. Forno sterilizzazione a 160 ° C per circa 45 min.
NOTA: Un negozio di queste pipette di vetro sarà necessario trasferire ovaie e follicoli.
2. Preparazione di dissezione e di cultura media
- Preparare Dissection media.
- Sciogliere 3 mg / ml BSA in Leibowitz L15 medio e filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori 25 mm Filtro diametro.
- Neonatale Ovaio Cultura.
- Per preparare mezzo per la cultura ovaio neonatale, fare 1 ml di terreno per each dell'ovaio che saranno coltivate. Sciogliere 3 mg / ml BSA in α-Minimal Essential supporti (αMEM) e filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori da 13 mm filtro di diametro in una provetta sterile.
- Per preparare piatti per la cultura ovaio neonatale, aggiungere 1 ml di terreno di coltura neonatale ovaio in ogni pozzetto (un ovaio per pozzetto) di un 24-pozzetti. Utilizzando pinze sterili orologeria, posizionare una membrana di policarbonato sulla parte superiore del mezzo in ciascuna superficie ben, lucido. UV sterilizzare le membrane prima dell'uso.
- Cultura follicolo.
- Per preparare mezzo per la cultura follicolo, supplemento α-Minimal media Essential con 1 UI / ml ricombinante follicolo ormone stimolante, 5 mg / ml di acido ascorbico e il 5% v / v di siero ottenuti da topi femmina adulti. Filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori da 13 mm filtro di diametro in una provetta sterile.
- Filtro sterilizzare olio siliconico attraverso un filtro di diametro 0,45 micron pori, 25 mm, in una provetta sterile.
- Per preparare plaTES, mettere 30 gocce microlitri di follicolo terreno di coltura in ciascun pozzetto di una cultura non-tessuto trattato 96 pozzetti Micropiastra tutto bene, utilizzando solo la prima riga di ogni disco (per permettere follicoli di essere spostati in nuovi file ogni giorno oltre il periodo di coltura). Sovrapporre accuratamente media con 70 ml di olio di silicone sterilizzato, per prevenire evaporazione media.
- Follicolo-ovaio Co-cultura.
- Preparare mezzo per follicolo-ovaio co-cultura per la cultura follicolo al precedente punto 2.3.1, che costituiscono 1 ml di media per ogni co-coltura follicolo-ovaio in fase di realizzazione.
- Per preparare piastre, aggiungere 1 ml di terreno in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Utilizzando pinze sterili orologeria, posizionare una membrana Nucleopore sulla parte superiore del mezzo in ciascuna superficie ben, lucido. UV sterilizzare le membrane prima dell'uso.
3. neonatale Ovaia Dissection e Cultura
- Mettere 1 ml di terreno dissezione in ogni piatto embrione di vetro sterile. <li> Cull cuccioli neonati topo di età compresa tra 0 e postnatale giorno 5, abbattimento per decapitazione in base alle normative IT Home Office.
- Afferrare la pelle che ricopre la parete addominale con un paio di belle pinze dissezione e fare una grande incisione nella parete pelle e del corpo. Aprire il dell'incisione così l'intero addome è esposto. La vescica è solitamente gonfio in questa fase e può essere forato per rendere più facile la dissezione.
- Spostare le budella fuori del modo con pinze orologiai. Seguire le corna uterine dalla vescica fino al rene su ogni lato. L'ovario si trova appena al di sotto del rene nella parte superiore dell'utero e apparirà come una struttura cloud come sotto un microscopio da dissezione.
- Afferrare l'ovario delicatamente con una pinza orologiaio, e usare le forbici per recidere il suo attaccamento verso l'utero. Trasferire la coppia di ovaie in piatti di embrioni contenenti medio dissezione pre-riscaldato.
- Effettuare dissezione multa di ovaie al microscopio dissezione su una sta riscaldatage (37 ° C). Utilizzare aghi da insulina per tagliare via il sacco della borsa e il materiale in eccesso compreso le tube di Falloppio, fino a che solo l'ovaio rimane.
- Trasferire ciascun ovaio nel pozzetto di una piastra di coltura preparato al passo 2.2.2, usando una pipetta di vetro curvo finemente disegnato, un ovaio sopra l'membrana (Figura 1A). Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Cambiare la media ogni due giorni. Utilizzare una pipetta di scambiare 50% del mezzo in ogni pozzetto per pre-gasati fresco medio: luogo la punta della pipetta sul bordo del pozzo di mezzo per non disturbare la membrana.
- Mantenere le culture fino a 6 giorni.
- Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare ovaie dopo un breve lavaggio in PBS, come richiesto.
- Fissare ovaie nelle fissante di Bouin per 90 minuti per l'analisi istologica, o in 10% formalina tamponata neutra per 90 minuti per l'analisi immunoistochimica. Snap congelare ovaie mettendo in tessutoun tubo di polipropilene, ponendo la provetta in ghiaccio secco per 5-10 minuti prima del congelamento a -70 ° C per la successiva estrazione di proteine o di mRNA.
4. follicolo Dissection e Cultura
- Cull 19-23 giorni vecchi topi di sesso femminile e isolare le ovaie. Bagnare il pelo con il 70% di etanolo prima di effettuare qualsiasi incisioni. Pizzica la pelle con pinze ad attacco smussato e fare una grande incisione nell'addome con le forbici dissezione, penetrando attraverso sia la pelle e la parete del corpo.
- Spostare l'intestino fuori strada utilizzando una serie di strumenti di dissezione più fine e individuare l'utero. Seguire l'utero fino alla ovaio che si trova sotto il rene su ogni lato.
- Afferrare delicatamente il ovaio utilizzando un paio di pinze orologiaio, recidere l'attaccamento ovaie all'utero con belle forbici dissezione. Evitare di raccogliere troppo del cuscinetto adiposo ovarico. Raccogliere le ovaie e trasferire in un embrione piatti contenenti medio dissezione pre-riscaldato.
- Respostare la borsa ovarica con aghi di insulina per tagliare via il sacco della borsa e il materiale in eccesso compreso le tube di Falloppio, fino a che solo l'ovaio rimane. Circa dimezzare ogni ovaio utilizzando aghi da insulina.
- Trasferire accuratamente ciascun ovaio mezzo in un vetrino di orologio individuale contenente 1 ml di mezzo dissezione. Coprire ogni vetro d'orologio con un vetrino per evitare l'evaporazione del mezzo e per garantire la sterilità.
- Vetri da orologio Conservare contenenti metà ovariche in un forno a 37 ° C fino al momento dell'uso, ma eseguire la dissezione successivo passo appena possibile. Gettare il tessuto conservato in questo modo per più di un'ora.
- Vetro d'orologio Transfer contenente un mezzo ovaio a una fase microscopio riscaldata 37 ° C in una cappa a flusso laminare. Circa sezionare ovaio in grossi pezzi con due aghi di insulina, al fine di individuare follicoli pre-antrali fine come segue: esse conterranno 2-3 strati di cellule della granulosa e hanno un diametro di circa 180-200 micron.
- Sezionare manualmente qualsiasi ifollicoli dentified utilizzando un ago da insulina e un 30 x 0,25 millimetri ago di agopuntura che è stato fissato in un supporto dell'ago. Fare attenzione a rimuovere la maggior parte dello stroma circostante, ma non danneggiare la lamina basale di follicoli (vedere Figura 1B).
- Utilizzare una pipetta di vetro curvo finemente disegnati per trasferire accuratamente follicoli sezionati in un vetro da orologio raccolta contenente medio dissezione pre-riscaldato. Fare attenzione a tenere i follicoli all'interno della sezione di calibro sottile di pipetta per evitare di perdere i follicoli.
- Follicoli misurare con precisione utilizzando un reticolo oculare calibrato inserito in un microscopio da dissezione.
- Selezionare follicoli per la cultura solo se misurano 190 ± 10 micron di diametro. Ulteriori selezionare solo, follicoli sferici sani per la cultura; questi saranno trasparente, senza zone atresici scure, e hanno una lamina basale intatta, insieme ad alcuni tessuti durale allegato: scartare le follicoli che non si adattano a questa descrizione. Un rendimento compreso tra 10-15 follicoli per dell'ovaio è buono.
- Utilizzare una pipetta di vetro curvo finemente disegnato per trasferire un singolo follicolo nel pozzo di una piastra come al precedente punto 2.3.3. Posizionare accuratamente il follicolo nel fondo del pozzo (e non nello strato superiore dell'olio). Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Follicoli cultura per 6 giorni spostano follicoli in un mezzo fresco e contenente tutti i giorni.
- Preparare la riga successiva nella piastra a 96 così come in piastra preparazione al passo 2.3.3. Piastra di ritorno per l'incubatore per almeno un'ora, per raggiungere l'equilibrio. Trasferire follicoli nei pozzetti freschi di media, utilizzando una pipetta di vetro finemente disegnato.
- Se in qualsiasi punto della coltura follicoli devono essere lasciati per due giorni prima di passare in mezzo fresco, posizionare ogni follicolo in un minimo di 60 microlitri (anziché 30 ml) di mezzo di coltura goccioline follicolo.
- Per raccogliere i dati sulla crescita del follicolo, misurare i follicoli quotidiano, utilizzando un eyepiece reticolo montato in un microscopio da dissezione. Lo strato olio alterare le misurazioni del diametro del follicolo, quindi calcolare il coefficiente di calibrazione per il set-up.
- Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare tessuto per successive analisi, come nel precedente punto 3.10.
- Follicolo-follicolo Co-cultura.
- Cultura due follicoli insieme, per indagare le interazioni tra i follicoli. La cultura come sopra, ma posizionare due follicoli side-by-side, in contatto, in un pozzo.
- Mettere 100 gocce microlitri di follicolo terreno di coltura in ciascun pozzetto di una cultura non-tessuto trattato 96 pozzetti Micropiastra piatto ben, sovrapponendo media con 100 ml di olio di silicone sterilizzato. Non trasferire follicoli in pozzi freschi come al punto 4.13, ma invece di utilizzare una punta di gel bene a cambiare il 50% del terreno di ogni altro giorno.
- Per identificare origini tessuto all'interno della co-coltura, co-coltura follicoli ciascuna da una fonte genetico diverso, ad esempio one dall'ovaio di un tipo di mouse selvaggio, e l'altro dalle ovaie di un mouse con espressione ubiquitaria di GFP. Se si utilizza GFP o YFP tessuto, minimizzare l'esposizione del tessuto alla luce il più possibile, durante la coltura, e attraverso i passi fissaggio / elaborazione successivi.
NOTA: E 'normale per i due follicoli di crescere insieme in un unico, unità' a due follicolo '(vedi Figura 1C).
5. follicolo-ovaio co-culture
- Sezionare ovaie e follicoli fuori come nelle sezioni 3 e 4 di cui sopra.
- Inserire un ovaio neonatale in cima ad una membrana, in una piastra preparata come al precedente punto 2.4.2. Posizionare accuratamente un singolo follicolo in contatto con un polo dell'ovaio neonatale, utilizzando una pipetta di vetro curvo finemente disegnato. Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 5 giorni.
- Per distinguere tra l'origine tessuto all'interno della co-coltura, utilizzare ovaie e follicoli di due diversi cosìurces, ad esempio uno da un tipo di topo selvatico, e uno da un mouse con espressione ubiquitaria di GFP.
- Sostituire 500 ml di media al giorno, come al precedente punto 3.8, ma con terreno di coltura follicolo. Durante co-coltura, il follicolo spesso viene incapsulato dall'ovaio (Figura 1D).
- Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare tessuto per successive analisi, come nel precedente punto 3.10.
6. Fissazione, Immunocytochemistry e Imaging di Tissue Colta
- Alla fine della coltura, lavare tessuti in PBS e trasferimento 100 microlitri (follicolo) o 1 ml (ovaio) e 10% formalina tamponata neutra, e fissare per 1 ora su ghiaccio. Spostarsi attraverso 3 lavaggi di 1x PBS a 4 ° C.
- Per immunocitochimica su follicoli, trasferimento tra pozzetti di una 96 pozzetti Micropiastra andata bene con una pipetta di vetro curvo finemente disegnati, con ogni ben contenenti lavaggi o trattamenti diversi.
- Per immunocitochimica su Ovaries (o dell'ovaio follicolo-co-culture), incorporare nel 4% agarosio gel e la sezione a 50 micron con un vibrotome. Sezioni Float nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti di applicare lavaggi o trattamenti, rimuovendo con una pipetta.
- Per l'imaging: trasferire le sezioni agarosio alle diapositive di vetro piano e montare con mezzo di montaggio; o follicoli di trasferimento (o complessi follicolo-follicolo) a vetrini cavità e montare con non indurente mezzo di montaggio. Esemplari immagine utilizzando un microscopio confocale.
Representative Results
La figura 1 mostra le immagini di ovaie e follicoli all'inizio e durante le procedure di coltura.
La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi di ovaie neonatali (qui, ovaie di cuccioli appena nati) esposti a sostanze tossiche riproduttive durante la coltura. Ovaie neonatali sono stati coltivati per 6 giorni, ed esposti ad un farmaco chemioterapico, cisplatino o doxorubicina, il giorno 2 di cultura. Al termine della coltura, ovaie sono stati fissati, trattati per l'istologia e ovaie poi esaminati per determinare il numero di follicoli ovarici sani e non sani 4. In alternativa, una più rapida valutazione primi follicoli in crescita può essere ottenuta dalla coltura di frammenti ovarici, utilizzando ovaie da un topo che esprimono un marcatore fluorescente specifico ovocita 10.
Durante la cultura dei singoli follicoli, la crescita del follicolo può essere facilmente accertata mediante misurazioni al giorno nel culture periodo. La Figura 3 illustra risultati rappresentativi della crescita dei follicoli in coltura in presenza o assenza di ormoni gonadotropina ormone follicolo stimolante (FSH) e l'ormone luteinizzante (LH) 5.
Follicle follicolo o follicolo-ovaio co-coltura possono essere usati per studiare le interazioni tra follicoli. A seconda della lavorazione di tessuti e, le immagini possono essere ottenuti utilizzando in campo chiaro, fluorescenza o confocale. Figura 4 mostra i risultati rappresentativi di immagini da tali co-culture, esaminando vari tipi di cellule coinvolte nella comunicazione follicolo-follicolo, tra cui cellule endoteliali e neuronali 7.
Figura 1: (A) Micrografia di un ovaio neonatale ottenuto da un topo il giorno della nascita, collocato su una membrana di policarbonato. (B) Micrografia di appena sezionato sano follicolo ovarico, con la maggior parte del tessuto stromale circostante sezionati distanza. (C) Microfotografie di co-coltura di due follicoli ovarici nel corso dei primi tre giorni di cultura, che mostrano lo stretto contatto che si instaura tra i due follicoli come i proventi della cultura (CI: primo giorno della cultura; Cii: seconda giornata della cultura; Ciii : terza giornata della cultura). Tratto da Spears et al. 11 (D) Photomicrograph di co-coltura follicolo preantrali e dell'ovaio neonatale dopo due giorni di cultura. L'immagine mostra il follicolo diventando incapsulato dall'ovaio. Freccia mostra follicolo preantrali. Immagine da Dr Federica Lopes. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: Effetto dei farmaci chemioterapici cisplatino e doxorubicina su ovaie coltivate neonatali cisplatino e doxorubicina sia portano alla perdita della salute follicolo e una riduzione del numero dei follicoli.. (A) Cisplatino; (B) Doxorubicina: (i) Percentuale di follicoli malsani (chiari); e (ii) il numero totale di follicoli (ombreggiata) in ciascun ovaio. Bar denotano significare + sem; n = 5 per tutti i gruppi, stelle denotano significative differenze rispetto ai controlli (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). Tratto da Morgan et al. 4
Figura 3:. Crescita tassi di follicoli esposti a diversi ambienti di gonadotropine valori sono media ± SEM (n ≥16 per ogni gruppo). La freccia indica l'inizio di antraformazione l in tutti i gruppi di gonadotropina. Tratto da Murray et al. 5
Figura 4: Immagini dal follicolo-follicolo e ovaio follicolo-co-culture, mostrando interazioni follicolo-follicolo (A) al microscopio confocale di una proteina verde fluorescente (GFP) follicolo e una wild-type (WT) follicolo dopo la co-coltura (. espressione GFP qui in bianco), con i processi del follicolo GFP mostrato estende su follicolo WT. (B) Sezione attraverso un / complesso follicolo WT GFP dopo co-coltura, mostrando che i processi di GFP (green) dal adiacente follicolo menzogna adiacente alla lamina basale del follicolo WT. (C) neonatale WT ovaio in seguito la cultura con un pre-antrale sono migrati GFP che esprimono follicolo, mostrando che le cellule GFP e dei processi cellulari (verde)attraverso la interstitum ovarica dell'ovaio neonatale. (D) GFP / complesso follicolo WT contenente cellule endoteliali, evidenziati dalla espressione di CD31 endoteliali indicatore di cella (rosso). (E) GFP complesso follicolo / WT contenenti cellule neuronali, mostrati da espressione di marcatore neuronale beta tubulina III (vedi qui come rosso, giallo o come se un doppio marcato con GFP, verde). Complesso follicolo (F) YFP / WT, dove YFP si riferisce ad follicolo da un mouse Thy1-YFP che ha espressione occasionale di proteina fluorescente gialla (YFP: giallo) in un sottogruppo di cellule neuronali 9, mostrando che i neuroni si estendono dal follicolo YFP. Bar 50 micron (A, B, D), 100 micron (C, E, F), 100 micron (riquadro in A), 10 micron (riquadro in C), 15 micron (riquadro in D). Tratto da Campbell et al. 7 Clicca qui per vedere una versione più grande di questo fifigura.
Discussion
Descriviamo qui i vari sistemi di coltura che possono essere utilizzati per sostenere lo sviluppo dei follicoli ovarici topo in vitro, usando intere ovaie neonatali che contengono solo le prime fasi del follicolo, singoli follicoli ovarici preantrali e anche co-culture dei due tessuti.
Cultura della neonatale topo ovaie supporta primo sviluppo ovarico, iniziazione crescita particolarmente follicolo fino alla fase del follicolo secondario. Una gamma di età dei topi neonati può essere utilizzato per queste culture, a seconda delle fasi di sviluppo di interesse. Se le ovaie sono ottenuti da topi appena nati, la formazione del follicolo sarà in corso, ma non è ancora completa: la cultura sarà almeno in parte sostenere la formazione del follicolo continua seguita da una crescita del follicolo. In alternativa, l'uso di ovaie di topi circa quattro-cinque giorni di età (da cui la formazione tempo follicolo è già complete) comporta cultura di un maggior numero di folli primordiale e crescenteCles 12. Aspetti benefici della tecnica specifica qui descritto comprendono l'uso di membrane di policarbonato galleggianti, che permettono una maggiore ossigenazione dei tessuti, e coltura in un mezzo di base formato unicamente αMEM e BSA, evitando l'uso di additivi non definiti come siero. Culture dell'intero ovaie non sembra sostenere lo sviluppo oltre la fase follicolo secondario, con conseguente sviluppo richiede una modifica nella tecnica, come la dissezione di complessi cellule follicolo-granulosa dalla coltura ovaio neonatale 1.
Fasi successive di sviluppo del follicolo possono essere sviluppate in vitro da dissezione out individuale, intatti follicoli pre-antrali fine, che può essere coltivata alla fase preovulatoria nella cultura, pur mantenendo la loro struttura tridimensionale. L'uso di follicoli intatti per questa tecnica di coltura mantiene il rapporto tra le diverse componenti follicolari come avviene in vivo. This sistema di coltura può essere utilizzato per ottenere ovociti che possono sostenere la fecondazione e il successivo sviluppo embrionale.
Ovociti fertilizable possono anche essere ottenuti da topi ovaie neonatali utilizzano un protocollo di coltura iniziale quanto qui descritto, seguita da una seconda fase in cui i complessi ovocita-cellule della granulosa sono coltivate in vitro 1. Altri sistemi utilizzati abbastanza frequentemente oggi includono cultura follicoli o tessuto ovarico che è stato incapsulato in un materiale come idrogel alginato, per fornire supporto (vedere, per esempio, Tagler et al. 13). Gran parte del centro di sviluppo del metodo ora è quello di migliorare le tecniche di coltura per le ovaie e follicoli di mammiferi più grandi, con l'obiettivo a lungo termine di ottenere ovociti concimabile di follicoli primordiali da una gamma di specie, compresi gli esseri umani.
In qualsiasi momento, ovaie dei mammiferi contengono follicoli in una serie di fasi di sviluppo, con interactions tra follicoli che interessano la loro regolamentazione. Questo aspetto della funzione ovarica è poco conosciuta e difficile da esaminare in vivo. L'ultimo metodo descritto qui utilizza sistemi di co-coltura per sostenere lo sviluppo delle diverse fasi di follicoli in vitro. Se necessario, uno o entrambi i tessuti possono essere pre-trattati in vivo o in vitro prima della co-coltura. Sistemi di co-coltura di questo tipo forniscono un modo ideale per esaminare le interazioni follicolo-follicolo, per esempio come in crescita, follicoli antrali influenzano la piscina follicolo primordiale, aspetti della biologia ovarico che hanno dimostrato difficile da esaminare fino ad ora.
Intere tecniche di coltura ovariche sono piuttosto semplici, anche se attenta dissezione è necessario per evitare danni ai tessuti accidentali. Dissezione dei singoli follicoli è una tecnica specializzata, che richiede pratica ripetuta prima di follicoli in fase di destra possono essere sezionati fuori dall'ovaio integro e non danneggiato. E 'fondamentaleper sezionare i singoli follicoli con attenzione, o danni subiti durante il protocollo di dissezione può provocare la morte del follicolo durante il successivo periodo di coltura. Dove follicoli sono posti direttamente nel pozzetto di piastre di microtitolazione, è importante utilizzare solo plastiche coltura non-tessuti trattati, per minimizzare placcatura giù di cellule tecali sulle materie plastiche: se viene utilizzato coltura tissutale plasticware trattati, i follicoli si unisce al base del pozzo e della rottura durante la crescita. Per tutti i lavori di co-coltura, tessuti devono essere posti direttamente in contatto tra loro.
Il mezzo sopra descritto per l'uso nella tecnica di coltura follicolo comprende l'aggiunta di siero di topo. È possibile sostituire il siero di topo con siero bovino fetale, ma soltanto lotti occasionali di tali sieri sosterrà pienamente lo sviluppo del follicolo alla fase preovulatoria, con batch test deve identificare fonti adatte. Batch-test di FSH è anche consigliabile, come Uni Internazionalets con cui FSH viene valutata correlato solo rozzamente per la crescita del follicolo in vitro. Se la rottura del follicolo si verifica regolarmente durante il periodo di cultura, di sostituire l'acido ascorbico magazzino con un nuovo lotto.
Le tecniche non richiedono attrezzature particolarmente specializzata diverso microscopi dissezione e incubatori coltura tissutale, anche se l'uso di una cappa a flusso laminare sterile e buona tecnica permette follicoli ovarici per coltivate in assenza di antibiotici, come nei metodi qui descritti. Ciò può essere utile, per evitare qualsiasi potenziale effetto dannoso degli antibiotici sugli oociti, specialmente se devono essere fecondato seguente cultura. Qualora non sia possibile lavorare in un ambiente sterile, è consigliabile aggiungere antibiotici per la dissezione e la coltura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
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- McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles. Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).
- Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin. PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).
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- Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles. Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).
- Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein. Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).
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