Denne protokollen beskriver den primære kultur / co-kultur av mus eggstokkvev, ved hjelp av eggstokkene fra neonatale mus og individuelle ovariefollikler fra prepubertale mus. De kulturteknikker støtter utvikling i et sterkt fysiologisk måte, slik at undersøkelse av virkningen av ytre midler på eggstokken, og for interaksjoner mellom eggstokkfollikler.
Pattedyr eggstokk er sammensatt av eggstokkfollikler, hver follikkel som består av en enkelt oocyte omgitt av somatiske granulosa celler, lukket sammen i en basalmembran. En begrenset pool av follikler er nedfelt under embryonal utvikling, når ubefruktede egg i meiotisk arrest danne et nært samarbeid med flate granulosa celler, forming primordialfollikler follikler. Ved eller kort tid etter fødselen, pattedyr eggstokkene inneholde sin levetid tilførsel av primordial follikler, fra hvilket tidspunkt og utover det er en jevn frigjøring av follikler i det voksende follikulær bassenget.
Eggstokk er spesielt mottagelig for utvikling av in vitro, med voksende follikler på en meget fysiologisk måte i kultur. Dette arbeidet beskriver kulturen i hele neonatal eggstokkene inneholder primordial follikler, og kulturen i enkelte ovariefollikler, en metode som kan støtte utviklingen av follikler fra en umoden gjennom til preovulatory stadium, hvoretter deres oocytter er i stand til å gjennomgå befruktning in vitro. Arbeidet skissert her bruker kultur systemer for å finne ut hvordan eggstokken påvirkes av eksponering for eksterne forbindelser. Vi beskriver også en co-kultur system, som gjør at etterforskningen av samspillet som oppstår mellom voksende follikler og den ikke-økende pool av primordial follikler.
Pattedyr eggstokk er sammensatt av en kvinnes liv tilførsel av oocytter, som hver inneholdt innenfor en eggstokkfollikkelen. Folliklene blir dannet før fødsel ved hvile, opprinnelige stadium: når hårsekken bassenget er etablert, er det en kontinuerlig og gradvis bevegelse av follikler fra den opprinnelige til den voksende follikkel bassenget. Som follikler begynner å vokse, utvikle de gjennom de primære, sekundære, preantral og deretter antrum etapper, før de når preovulatory, eller Graafs, scenen. Bare ubefruktede egg fra preovulatory follikler har full utviklingskompetanse, i stand til å støtte embryoutvikling til termin, hvis befruktet.
Eggstokk har lenge vært kjent for å utvikle seg i en meget fysiologisk måte in vitro. Dette er sannsynligvis å være på grunn av hver ovarie follikkel som inneholder i seg cellene som er nødvendige for å støtte en oocytt fra umodne trinn (ved hvilket punkt den er ute av stand til å fullføre sin meiotisk divisjon) gjennom til than utviklingshemmede kompetent scenen (noe som medførte den fullt ut kan støtte gjennomføringen av meiose, befruktning og utvikling av den resulterende embryoet til termin).
Den fysiologiske natur eggstokk utvikling in vitro har ført til utstrakt bruk av eggstokkkulturteknikker. Derfor har in vitro metoder blitt brukt til å undersøke regulering av eggstokk utvikling, eggstokk patologi (for eksempel at av polycystisk ovariesyndrom, PCOS), undersøkelse av hvordan eggstokker / eggceller påvirkes av eksponering for kjemikalier, og også med den praktiske sikte på skaffe fertilizable eggceller fra primordial ovariefollikler. Til dags dato, har sistnevnte blitt oppnådd bare ved hjelp av musen eggstokkvev en, selv om kultur teknikker ved hjelp av follikler fra store pattedyr, inkludert mennesker, har kraftig forbedret de siste årene 2,3.
Vi beskriver her flere kultur metoder ved hjelp av musen eggstokkvev. Den første method bruker hele neonatale mus eggstokkene, og støtter dannelsen og tidlig utvikling av primordial follikler 4. Det andre systemet støtter veksten av individuelle, intakte ovariefollikler fra slutten preantral til preovulatory scenen; ved hjelp av denne teknikken, kan follikler dyrkes enkeltvis eller i par 5,6. Endelig beskriver vi en ko-kultur-system som kombinerer de første to teknikkene i en fremgangsmåte som tillater undersøkelse av interaksjonen mellom voksende og primordialfollikler eggstokkfollikler 7.
Kultur av individuelle intakte ovariefollikler gjør hårsekken vekst skal fastsettes fra daglige hårsekken målinger under kultur periode, mens medium analyse tillater undersøkelse av hårsekken / eggstokk hormonproduksjon. Ytterligere analyser vev kan oppnås ved en samling av follikler eller ovarievev ved slutten av kulturen, for histologiske analyser immunohistologiske / eller for etterfølgende behandling for eksempel for å oppnåmRNA eller proteiner.
Vi beskriver her ulike dyrkingssystemer som kan benyttes for å støtte utviklingen av mus ovariefollikler in vitro, bruker hele neonatal eggstokkene som kun inneholder de tidligste hårsekken etapper, individuelle preantral ovariefollikler og også co-kulturer av de to vev.
Culture of neonatal mus eggstokkene støtter tidlig eggstokk utvikling, spesielt hårsekken vekst initiering opp til den sekundære hårsekken scenen. En rekke alderen neonatale mus kan brukes til disse kulturene, avhengig av utviklingsstadier av interesse. Hvis eggstokkene er hentet fra nyfødte mus, vil hårsekken formasjon være i gang, men ikke ennå fullført: kultur vil hvertfall delvis fortsatt hårsekken dannelsen fulgt av hårsekken vekst. Alternativt kan (ved hvilket tidspunkt follicle formasjon allerede er fullført) bruk av ovarier fra mus rundt fire-til-fem-dagers alder fører til kulturen i et større antall opprinnelige og voksende Follicles 12. Fordelaktige sider ved den bestemte teknikk som er beskrevet her inkluderer bruk av flytende polykarbonat-membraner, noe som tillater større oksygenering av vevet, og kulturen i et meget basisk medium som består av bare aMEM og BSA, unngår bruk av udefinerte additiver slik som serum. Kultur av hele ovarier synes ikke å støtte utvikling utover den sekundære follicle trinn, med påfølgende utvikling som krever en endring i teknikken, slik som disseksjon av follikkel-granulosa-cellekomplekser fra dyrkede neonatal eggstokk 1.
Senere stadier av follikkelutvikling kan utvikles in vitro ved å dissekere ut individuelle, intakte sen pre-antrum follikler, noe som kan dyrkes til preovulatory stadium i kultur samtidig opprettholde sin tredimensjonale struktur. Bruken av intakte follikler for denne dyrkningsteknikk opprettholder forholdet mellom de forskjellige komponenter follikulære som oppstår in vivo. This kultursystemet kan bli anvendt for å oppnå oocytter som kan støtte gjødsling og påfølgende embryoutvikling.
Fertilizable oocytter kan også fås fra mus neonatale eggstokkene ved hjelp av en startkultur protokoll mye som er beskrevet her, etterfulgt av et andre trinn hvorunder oocytt-granulosa-cellekomplekser er dyrket in vitro 1. Andre systemer som brukes i dag er ganske ofte kultur av follikler eller eggstokk-vev som er blitt innkapslet i et materiale slik som alginat hydrogel, for å gi støtte (se, for eksempel, Tagler et al. 13). Mye av fokus for metodeutvikling nå er å forbedre kultur teknikker for eggstokkene og follikler av større pattedyr, med den langsiktige mål om å skaffe fertilisable ubefruktede egg fra primordial follikler fra en rekke arter, inkludert mennesker.
Til enhver tid, pattedyr eggstokkene inneholde follikler på en rekke utviklingsstadier, med interactions mellom follikler som påvirker deres regulering. Dette aspektet av ovarial funksjon er dårlig forstått og vanskelig å undersøke in vivo. Den siste metoden er beskrevet her bruker co-kultur-systemer for å støtte utviklingen av ulike stadier av follikler in vitro. Om nødvendig, kan en eller begge vevene kan være forhåndsbehandlet in vivo eller in vitro før ko-kultur. Co-kultur systemer som dette gir en ideell måte å undersøke hårsekken-follicle interaksjoner, for eksempel hvordan vokser, antrum follikler påvirke primordial hårsekken basseng, til aspekter av eggstokkreft biologi som har vist seg vanskelig undersøke før nå.
Hele ovarie dyrkningsteknikker er ganske enkel, men forsiktig disseksjon er nødvendig for å unngå uønsket skade på vev. Disseksjon av individuelle follikler er en spesialisert teknikk, som krever gjentatt praksis før follikler til rett scene kan bli dissekert ut fra eggstokken intakt og uskadet. Det er kritiskå dissekere ut enkelt follikler nøye, eller skader pådratt i disseksjon protokollen kan resultere i hårsekken død under den påfølgende kultur periode. Der folliklene blir plassert direkte inn i brønnen av mikrotiter-plater, er det viktig å bruke bare ikke-vevskultur behandlede plast, for å redusere utplating ned av intraspinal celler på plast: hvis vevskultur behandlede -plast benyttes, vil de follikler feste til bunnen av brønnen og brudd som de vokser. For alle ko-kulturarbeid, må vev plasseres direkte i kontakt med hverandre.
Mediet beskrevet ovenfor for bruk i hårsekken dyrkningsteknikk omfatter tilsetning av museserum. Det er mulig å bytte ut museserum med føtalt bovint serum, men bare sporadiske grupper av slike sera vil gi full støtte follikkelutvikling til preovulatory stadium, med batch-testing er nødvendig for å identifisere egnede kilder. Batch-testing av FSH er også lurt, som International Units der FSH vurderes korrelerer bare grovt til hårsekken vekst in vitro. Hvis hårsekken ryker rutinemessig under kultur periode, bør du vurdere å erstatte lager askorbinsyre med en ny ladning.
De teknikker som ikke krever særlig spesialisert utstyr annet enn dissekere mikroskoper og inkubatorer vev kultur, selv om anvendelse av en laminær strømningshette og god steril teknikk tillater eggstokkfollikler å bli dyrket i fravær av antibiotika, slik som i fremgangsmåtene beskrevet her. Dette kan være nyttig, for å unngå enhver potensiell skadelig virkning av antibiotika på oocytter, særlig hvis de skal bli befruktet etter kultur. Hvor det ikke er mulig å arbeide i et sterilt miljø, er det tilrådelig å legge antibiotika til disseksjon og kultur media.
The authors have nothing to disclose.
Work was funded by MRC grant G1002118.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L) |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
Mouse serum | – | – | Collected from cardiac puncture |
FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20°C. |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20°C. |
Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
Syringe filters (25mm, 0.2µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter: for filtering larger (> 5mls) volumes of medium. |
Syringe filters (13mm, 0.2µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter: for filtering smaller (< 5mls) volumes of medium |
Syringe filters (25mm, 0.45µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter: for filtering oil. |
Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
24 well plate | Greiner | 662160 | |
96 well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
96 well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0µm pore size |
Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33mm (29G) +1ml |
Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilise then warm before use |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use |
Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30mmx0.25 Type C | |
Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |