Summary
Detta protokoll beskriver den primära kultur / co-kultur av mus äggstocksvävnad, med hjälp av äggstockar från neonatala möss och enskilda äggstocksfollikler från prepubertala möss. De odlingstekniker stödja utvecklingen i ett mycket fysiologiskt sätt, vilket gör undersökning av effekten av yttre medel på äggstocken, och av växelverkan mellan äggblåsor.
Abstract
Däggdjurs äggstock är sammansatt av ovariefolliklar, varje follikel bestående av en enda oocyt omgiven av somatiska granulosaceller, slutna tillsammans inom ett basalmembran. En ändlig pool av folliklar fastställs under fosterutvecklingen, när äggceller i meiotiska gripande bildar ett nära samarbete med tillplattade granulosaceller, bildar primordiala folliklar. Genom eller strax efter födseln, däggdjurs äggstockar innehåller sin livstid leverans av primordial folliklar, från vilken punkt och framåt finns det en jämn frisättning av folliklar i den växande follikulär poolen.
Den äggstocken är särskilt mottaglig för utveckling in vitro, med folliklar växer i en mycket fysiologiskt sätt i kultur. Detta arbete beskriver kulturen i hela neonatal äggstockar innehåller primordial folliklar, och kulturen i enskilda äggblåsor, en metod som kan stödja utvecklingen av folliklar från en omogen fram till preovuvande stadium, varefter deras oocyter kan undergå befruktning in vitro. Det arbete som beskrivs här använder odlingssystem för att avgöra hur äggstocken påverkas av exponering för externa föreningar. Vi beskriver också ett samodlingssystemet, vilket möjliggör undersökning av det samspel som sker mellan växande folliklar och den icke-växande pool av primordiala folliklar.
Introduction
Däggdjurs äggstock är sammansatt av en kvinnlig livstid leverans av oocyter, vardera innesluten i en äggstocks follikel. De folliklar bildas före födseln på vila, primordial scen: när follikeln poolen är etablerad, det finns en ständig och gradvis förflyttning av folliklar från primordial i den växande follikeln poolen. Som folliklar börjar växa, de utvecklas genom de primära, sekundära, preantral och sedan antrala stadier, tills de når preovulatoriska eller Graafsk, skede. Endast oocyter från preovulatorisk folliklar har full utvecklingskompetens, kunna stödja embryonal utveckling till sikt, om befruktade.
Äggstocken har länge varit känt att utvecklas på ett mycket fysiologiskt sätt in vitro. Detta kommer sannolikt att bero på varje äggblåsa innehåller inom sig cellerna krävs för att stödja en äggcell från omogna stadiet (då det inte kan slutföra sin meiotisk delning) genom att than utvecklingsmässigt kompetent stadium (då det kan fullt ut stödja slutförandet av meios, gödsling och utvecklingen av den resulterande embryot till term).
Den fysiologiska naturen hos äggstocken utveckling in vitro har lett till den utbredda användningen av äggstocksodlingstekniker. Följaktligen har in vitro-metoder använts för att undersöka regleringen av äggstocken utveckling, äggstocks patologi (till exempel att av polycystiskt ovariesyndrom, PCOS), undersökning av hur äggstockar / oocyter påverkas av exponering för kemikalier, och även med det praktiska syftet att erhålla fertilizable äggceller från primordiala folliklar. Hittills har den senare uppnåtts enbart med musen äggstocksvävnad 1, även om odlingstekniker som använder folliklar från stora däggdjur, inklusive människor, kraftigt har förbättrats de senaste åren 2,3.
Vi beskriver här flera odlingsmetoder som använder musen äggstocksvävnad. Den första metod använder hela neonatal mus äggstockar, och stöder bildandet och tidig utveckling av primordiala folliklar 4. Det andra systemet stödjer tillväxten av enskilda, intakta äggstocksfollikler från slutet preantral till preovulatoriska scenen; med denna teknik, kan folliklar odlas individuellt eller i par 5,6. Slutligen beskriver vi en samodlingssystemet, kombinera de två första teknikerna i en metod som möjliggör undersökning av samspelet mellan växande och primordiala folliklar 7.
Kultur av enskilda intakta ovarialfolliklar låter tillväxten av folliklar som skall fastställas från dagliga mätningar follikelstimulerande under odlingsperioden, medan medel analys möjliggör undersökning av follikelstimulerande / äggstock hormonproduktion. Ytterligare vävnads analyser kan uppnås genom en samling av folliklar eller äggstocksvävnad vid slutet av kulturen, för histologiska / immunohistologiska analyser eller för efterföljande bearbetning för att exempelvis erhållamRNA eller proteiner.
Protocol
Allt djurarbete har utförts i enlighet med institutionens riktlinjer på licens av UK Home Office (projektlicensnummer PPL 60/1726 och 60/4026).
Obs: Hus djur i enlighet med brittiska rättsliga krav i en 14 timmar ljus och 10 timmar mörker fotoperiod. Utföra experiment på djur med hjälp vild typ C57Bl6J möss, Tau-GFP möss som har spridd uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP) 8, och Thy1-YFP möss med enstaka uttryck av gula fluorescerande protein (YFP) i en delmängd av nervceller 9: både transgena linjer avlades på en C57Bl6J bakgrund.
1. arbetsvillkor och Beredning av instrument
- Utför all media förberedelser, vävnads dissektioner, och kulturarbete i ett laminärt flöde huva för att säkerställa steriliteten: detta undviker kravet på tillsättning av antibiotika till medierna.
- Tillåt alltid media / odlingsplattor / embryo rätter till jämvikti minst 1 timme, i en ugn 37 ° C (dissektion medium / embryo rätter) eller 37 ° C, 5% CO2 inkubator (odlingsmedium och plattor), före användning.
- Blötglaspipetter i 0,1% lösning av bovint serumalbumin (BSA) för runt en timme, och sedan låt torka. Dra pipetter i lågan från en bunsenbrännare, böjning glaset som du gör det, för att producera fint dragna krökta glaspipetter. Efter pipetten dras, göra ett rent snitt med ett glas kutter. Ugn sterilisera vid 160 ° C i ca 45 min.
OBS: En butik av dessa glaspipetter kommer att behövas för att överföra äggstockar och folliklar.
2. Beredning av Dissection och kultur Media
- Förbered Dissection Medium.
- Lös 3 mg / ml BSA i Leibowitz L15 medium och filtersterilisera genom ett 0,2 | im por, filtret 25 mm diameter.
- Neonatal Äggstock kultur.
- För att förbereda medium för neonatal äggstock kultur, gör en ml medium för each äggstocken som ska odlas. Lös 3 mg / ml BSA i α-Minimal Essential Media (aMEM) och filtersterilisera genom ett 0,2 | im por, filtret 13 mm diameter i ett sterilt rör.
- För att framställa plåtar för neonatal äggstock kultur, tillsätt 1 ml av neonatal äggstock odlingsmedium i varje brunn (en äggstock per brunn) av en 24-brunnars platta. Använda sterila urmakare pincett, placera en polykarbonatmembran ovanpå mediet i varje brunn, glänsande ytan upp. UV sterilisera membran före användning.
- Follicle kultur.
- För att framställa medium för follikelstimulerande kultur, tillägg α-Minimal Essential Media med 1 lU / ml rekombinant humant follikelstimulerande hormon, 5 | ig / ml askorbinsyra och 5% vol / vol serum erhållet från vuxna honmöss. Filtersterilisera genom ett 0,2 | im por, filtret 13 mm diameter i ett sterilt rör.
- Filtersterilisera silikonolja genom ett filter 0,45 ^ m porstorlek, 25 mm diameter, in i ett sterilt rör.
- För att förbereda plates, placera 30 | il droppar av follikelstimulerande odlingsmedium i varje brunn i en icke-vävnadsodlingsbehandlade 96-brunnars mikrotiter rundhålsplatta, med användning av endast den översta raden i varje platta (för att möjliggöra folliklar att flyttas till nya rader varje dag över odlingsperioden). Försiktigt overlay medium med 70 pl steriliserad silikonolja, för att förhindra medel avdunstning.
- Follikelstimulerande äggstock Co-kulturen.
- Förbered medium för follikelstimulerande äggstocken samodling som för follikelstimulerande kultur i steg 2.3.1 ovan, gör upp 1 ml medium för varje follikelstimulerande äggstock samodling inrättas.
- För att framställa plattor, tillsätt 1 ml medium i varje brunn i en 24-brunnsplatta. Använda sterila urmakare pincett, placera en Nucleopore membran ovanpå mediet i varje brunn, glänsande ytan upp. UV sterilisera membran före användning.
3. Neonatal Äggstock Dissection och kultur
- Placera 1 ml dissektion medium i varje steril glas embryo skålen. <li> Cull neonatal mus valpar i åldern mellan postnatal dag 0 och 5, utgallring genom halshuggning enligt brittiska Home Office föreskrifter.
- Ta tag i huden som täcker bukväggen med hjälp av ett par fina dissektion pincett och göra ett stort snitt i huden och kroppen väggen. Dra upp snittet så hela buken utsätts. Blåsan är vanligtvis svullna på detta stadium och kan punkteras för att göra dissektion lättare.
- Flytta innanmätet ur vägen med hjälp av urmakare pincett. Följ livmoderhornen från blåsan upp till njuren på varje sida. Äggstocken är belägen precis nedanför njur upptill av livmodern och kommer att uppträda som en molnliknande struktur under ett dissektionsmikroskop.
- Ta tag i äggstocken försiktigt med urmakare pincett, och använda sax för att klippa av sitt engagemang för livmodern. Överför par äggstockar i embryo rätter innehåller förvärmda dissektion medium.
- Utför fina dissektion av äggstockar under ett dissektion mikroskop på en uppvärmd staGE (37 ° C). Använd insulin nålar för att trimma bort bursal säcken och eventuell överskottsmaterial inklusive äggledaren, tills endast äggstocken står.
- Överför varje äggstock i brunnen på en odlingsplatta framställd i steg 2.2.2 ovan, med användning av en fint dras krökt glaspipett, en äggstock på toppen av varje membran (se figur 1A). Kultur i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Ändra mediet varannan dag. Använd en pipett för att utbyta 50% av mediet i varje brunn för pre-gasade färskt medium: plats pipettspetsen vid kanten av brunnen av medel att undvika att störa membranet.
- Behåll kulturer i upp till 6 dagar.
- Vid slutet av odlingen, frysmedium och fixera eller frysa äggstockar efter en kort tvätt i PBS, såsom krävs.
- Fix äggstockar i Bouins fixeringsmedel under 90 min för histologisk analys, eller i 10% neutral buffrad formalin under 90 min för immunhistologisk analys. Snap frysa äggstockar genom att placera vävnaden iett polypropenrör, placera röret i torr is under 5 till 10 min före frysning vid -70 ° C för efterföljande protein eller mRNA-utvinning.
4. follikelstimulerande Dissection och kultur
- Slakta 19-23 dagar gamla honmöss och isolera äggstockarna. Blöt pälsen med 70% etanol innan du gör några snitt. Nyp huden med trubbiga ändar pincett och göra ett stort snitt i buken med dissektion sax, som tränger igenom både hud och kroppsväggen.
- Flytta tarmen ur vägen genom att använda en finare uppsättning dissektion instrument och lokalisera livmodern. Följ livmodern upp till äggstocken som ligger nedanför njuren på varje sida.
- Försiktigt greppa äggstocken med användning av ett par av urmakare pincett, avskära äggstockar fastsättning livmodern med fina dissektion sax. Undvik att samla för mycket av äggstocksfettkudden. Samla äggstockarna och överför till ett embryo rätter innehåller förvärmda dissektion medium.
- ReFlytta äggstocks bursa använder insulin nålar för att trimma bort bursal säcken och eventuell överskottsmaterial inklusive äggledaren, tills endast äggstocken står. Ungefär halvera varje äggstock använder insulin nålar.
- Försiktigt överföra varje äggstock-halva i ett enskilt urglas innehållande 1 ml dissektion medium. Täck varje urglas med en glasskiva för att förhindra avdunstning av medium och för att säkerställa sterilitet.
- Butiks urglas innehållande ovarieceller halvor i en ugn vid 37 ° tills det behövs, men utföra nästa dissekering steg så snart som möjligt. Kasta vävnad lagras på detta sätt i mer än en timme.
- Transfer urglas innehåller en äggstock halv till en 37 ° C upphettad mikroskop scenen i ett laminärt flöde huva. Ungefär dissekera äggstock i stora bitar med hjälp av två insulinnålar, i syfte att identifiera sena pre-antrala folliklar enligt följande: Dessa kommer att innehålla 2-3 lager av granulosaceller och har en diameter på cirka 180-200 nm.
- Manuellt dissekera någon identified folliklar som använder en insulin nål och en 30 x 0,25 mm akupunkturnål som har säkrats i en nål. Var noga med att ta bort det mesta av det omgivande stroma, men undvika att skada basala lamina av folliklar (se figur 1B).
- Använd en fint dras böjd glaspipett att noggrant överföra dissekerade folliklar i ett uppsamlings urglas innehåller förvärmda dissektion medium. Var noga med att hålla hårsäckarna inom den tunna kaliber sektion pipett för att undvika att förlora folliklar.
- Mät folliklar noggrant med hjälp av en kalibrerad okularfokalplattan passas in i en dissekera mikroskop.
- Välj folliklar för kultur endast om de mäter 190 ± 10 nm i diameter. Ytterligare välja endast friska, sfäriska folliklar för kultur; dessa kommer att vara genomskinliga, utan mörka atretiska områden, och har en intakt basala lamina, tillsammans med några bifogade thecal vävnad: släng eventuella folliklar som inte passar denna beskrivning. Ett utbyte av mellan 10-15 folliklar per äggstocken är bra.
- Använd en fint dras böjda glas pipett för att överföra en enda follikel i brunnen av en platta upprättats i steg 2.3.3 ovan. Placera försiktigt follikeln i botten av brunnen (och inte i den övre oljelagret). Kultur i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Kultur folliklar för upp till 6 dagar, flytta folliklar i en brunn som innehåller färskt medium varje dag.
- Förbered nästa rad i 96-brunnar som i platt förberedelse i steg 2.3.3 ovan. Återgå plattan till inkubatorn under minst en timme, för att möjliggöra ekvilibrering. Överför folliklar i nya brunnar i medium med användning av en fint dras glaspipett.
- Om det vid någon punkt i kulturen folliklar skall kvar för två dagar innan man började med färskt medium, placera varje follikel i ett minimum av 60 | il (i stället för 30 | il) droppar av follikelstimulerande odlingsmedium.
- Att samla in uppgifter om tillväxten av folliklar, mäta folliklar dagligen, med hjälp av en eyepiece gradnät inpassad i ett dissektionsmikroskop. Oljeskiktet snedvrider mätningar av follikelstimulerande diameter, så träna kalibreringskoefficient för set-up.
- Vid slutet av odlingen, frysmedium och fixera eller frysa vävnaden för efterföljande analys, som i steg 3,10 ovan.
- Follikelstimulerande follikelstimulerande Co-kulturen.
- Kultur två folliklar tillsammans, för att undersöka interaktioner mellan folliklar. Kultur som ovan, men placera två folliklar sida vid sida, i kontakt, i en brunn.
- Placera 100 pl droppar av follikelstimulerande odlingsmedium i varje brunn i en icke-vävnadsodlingsbehandlade 96-brunnars mikrotiter platt-brunnar, överliggande medium med 100 | il av steriliserat silikonolja. Överför inte folliklar i färska brunnar som i steg 4.13 ovan, men i stället använda en fin gel tips för att ändra 50% av mediet varannan dag.
- För att identifiera vävnads ursprung inom co-kultur, co-kultur folliklar vardera från en annan genetisk källa, till exempel one från äggstocken av en vild typ mus, och den andra från äggstocken av en mus med ubiquitous uttryck av GFP. Om du använder GFP eller YFP vävnad, minimera exponeringen av vävnad för ljus så mycket som möjligt, under kultur, och genom fixering / bearbetningssteg därefter.
OBS: Det är normalt att de två folliklar att växa ihop till en enda, "två-follikelstimulerande" enhet (se figur 1C).
5. follikelstimulerande Äggstock samkulturer
- Dissekera äggstockar och folliklar ut som i avsnitten 3 och 4 ovan.
- Placera en neonatal äggstock ovanpå ett membran, i en platta framställd såsom i steg 2.4.2 ovan. Placera försiktigt en enda follikel i kontakt med en pol av den neonatala äggstock, med användning av en fint dras krökt glaspipett. Kultur i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under upp till 5 dagar.
- För att skilja mellan vävnaden ursprunget i den co-kultur, använd äggstockar och folliklar från två olika såurces, exempelvis ett från en vild typ mus, och en från en mus med ubiquitous uttryck av GFP.
- Ersätt 500 l av medel dagligen som i steg 3.8 ovan, men med hjälp av follikelstimulerande odlingsmedium. Under samodling, follikeln ofta blir inkapslad av äggstocken (Figur 1D).
- Vid slutet av odlingen, frysmedium och fixera eller frysa vävnaden för efterföljande analys, som i steg 3,10 ovan.
6. Fixering, Immuncytokemi och avbildning av odlad vävnad
- Vid slutet av kulturen, tvätta vävnaden i PBS och överför till 100 | il (follicle) eller 1 ml (äggstock) av 10% neutral buffrad formalin, och fastställa till en timme på is. Flytta genom 3 tvättar av 1x PBS vid 4 ° C.
- För immunocytokemi på folliklar, överföring mellan brunnar i en 96-brunnars mikrotiter rund-brunnar med användning av en fint dras krökt glaspipett, med vardera brunn innehållande olika tvättar eller behandlingar.
- För immunocytokemi på Ovaries (eller äggstock-follikelstimulerande samkulturer), bädda in 4% agarosgel och avsnitt på 50 pm med hjälp av en vibrotome. Float sektioner i brunnarna i en 24-brunnars platta för att tillämpa tvättar eller behandlingar, avlägsnande med en pipett.
- För avbildning: överföra agaros sektioner till platta glasskivor och montera med monteringsmedium; eller överföra folliklar (eller follikelstimulerande follikelstimulerande komplex) till hålrum glas och montera med icke-härdande monteringsmedel. Bild prover med en konfokalmikroskop.
Representative Results
Figur 1 visar bilder av äggstockar och folliklar i början av och under kulturförfaranden.
Figur 2 visar representativa resultat av neonatala äggstockar (här, äggstockar från nyfödda valpar) utsätts för reproduktionstoxiska under kultur. Neonatal äggstockar odlades i 6 dagar, och utsätts för en kemoterapi läkemedel, antingen cisplatin eller doxorubicin, på dag 2 av kultur. I slutet av kulturen, var äggstockar fast, behandlas för histologi och äggstockar undersöks sedan för att bestämma antalet friska och ohälsosamma folliklar 4. Alternativt kan en snabbare bedömning av tidiga växande folliklar erhållas från kulturen i äggstock fragment, med hjälp av äggstockar från en mus som uttrycker en äggcell specifik fluorescerande markör 10.
Under den kultur av enskilda folliklar, kan tillväxten av folliklar lätt fastställas genom dagliga mätningar under culTure perioden. Figur 3 visar representativa resultat av tillväxten av folliklar odlats i närvaro eller frånvaro av det gonadotropin hormoner follikelstimulerande hormon (FSH) och luteiniserande hormon (LH) 5.
Follikelstimulerande-follikeln eller follikelstimulerande äggstock samodling kan användas för att undersöka interaktioner mellan folliklar. Beroende på vävnaden och behandling, kan bilderna erhållas med hjälp av ljusfält, fluorescens eller konfokala mikroskop. Figur 4 visar representativa resultat av bilder från sådana samkulturer, undersöker olika celltyper som är involverade i follikelstimulerande follikelstimulerande kommunikation, inklusive endotel och neuronala celler 7.
Figur 1: (A) Mikrofoto av en neonatal äggstock erhållits från en mus på dagen för födelsen, placerad på ett polykarbonatmembran. (B) Mikrofoto av nyligen dissekerade friska äggblåsa, med de flesta av de omgivande stromal vävnad dissekeras bort. (C) Mikrofotografier av samodling av två äggblåsor under de tre första dagarna av kultur, som visar den nära kontakten som utvecklas mellan de två folliklar som kultur intäkterna (CI: första dagen i kultur, Cii: andra dagen av kultur; CIII : tredje dagen av kultur). Reproducerat från Spears et al. 11 (D) Mikrofoto av samodlade preantral follikeln och neonatal äggstock efter två dagars odling. Bilden visar follikeln blir inkapslad av äggstocken. Pilen visar preantral follikelstimulerande. Bild från Dr Federica Lopes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
gur 2 "src =" / filer / ftp_upload / 52.458 / 52458fig2.jpg "/>
Figur 2: Effekt av cytostatika cisplatin och doxorubicin på nyfödda odlade äggstockar Cisplatin och doxorubicin båda leder till förlust av follikelstimulerande hälsa och en minskning av follikelstimulerande nummer.. (A) Cisplatin; (B) doxorubicin: (i) Andel av ohälsosamma folliklar (töm); och (ii) det totala antalet folliklar (skuggad) i varje äggstock. Barer betecknar menar + sem; n = 5 för alla grupper, stjärnor betecknar signifikanta skillnader i förhållande till kontroll (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Reproducerat från Morgan et al. 4
Figur 3:. Tillväxt andelen folliklar som utsätts för olika gonadotropinfrisättande miljöer Värdena är medelvärde ± SEM (n ≥16 för varje grupp). Pilen anger starten av antral bildning i alla gonadotrofinnivåerna grupper. Reproducerat från Murray et al. 5
Figur 4: Bilder från follikelstimulerande follikeln och äggstock-follikelstimulerande samkulturer, som visar follikelstimulerande follicle interaktioner (A) Confocal mikrofoto av ett grönt fluorescerande protein (GFP) follikeln och en vildtyp (WT) follikelstimulerande efter samodling (. GFP uttryck visas här i vitt), med processer från GFP follikelstimulerande visas sträcker sig över WT follikelstimulerande. (B) Tvärsnitt genom en GFP / WT follikelstimulerande komplex efter samodling, som visar att GFP processer (gröna) från angränsande follikeln ligger intill den basala lamina av WT follikeln. (C) Neonatal WT äggstocken efter kultur med en pre-antral GFP-uttryck follikelstimulerande, som visar att GFP celler och cellulära processer (grön) har migreratgenom äggstocks interstitum av neonatal äggstocken. (D) GFP / WT follikel komplex innehållande endotelceller, som visas genom expression av endotelial cellmarkör CD31 (röd). (E) GFP / WT follikelstimulerande komplex innehållande nervceller, som visas genom uttryck av neuronala markör beta tubulin III (se här som rött, eller som gult om dubbelmärkt med GFP, grönt). (F) YFP / WT follikelstimulerande komplex, där YFP avser follikel från en Thy1-YFP mus som har tillfällig uttryck av gula fluorescerande protein (YFP: gul) i en delmängd av nervceller 9, som visar att nervceller sträcker sig från YFP follikeln. Bars 50 um (A, B, D), 100 pm (C, E, F), 100 ^ m (infällt i A), 10 ^ m (infällt i C), 15 | im (infällt i D). Reproducerat från Campbell et al. 7 Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Vi beskriver här olika odlingssystem som kan utnyttjas för att stödja utvecklingen av mus äggblåsor in vitro, användning av hela neonatal äggstockar innehåller bara de tidigaste follikelstimulerande stadierna, enskilda preantral äggblåsor och även co-kulturer av de två vävnaderna.
Kultur av neonatal mus äggstockar stödjer tidig äggstocks utveckling, särskilt tillväxten av folliklar initiering upp till den sekundära follikelstimulerande stadiet. En rad åldrarna neonatala möss kan användas för dessa kulturer, beroende på utvecklingsstadier av intresse. Om äggstockarna erhålls från nyfödda möss, kommer follikelstimulerande bildning vara på väg men ännu inte klar: kultur kommer åtminstone delvis att stödja fortsatt follikelstimulerande bildning följt av tillväxten av folliklar. Alternativt (vid vilken tid follikelstimulerande bildningen redan kompletta) användning av äggstockar från möss cirka fyra till fem dagars ålder resulterar i odling av ett större antal primordial och växande Follilarna 12. Fördelaktiga aspekter av den specifika teknik som beskrivs här inkluderar användning av flytande polykarbonatmembran, som tillåter större syresättning av vävnaden, och kultur i en mycket grundläggande medium bestående av endast aMEM och BSA, undvika användning av odefinierade tillsatser såsom serum. Kultur av hela äggstockar verkar inte stödja utvecklingen bortom den sekundära follikelstimulerande scenen, med efterföljande utveckling kräver en förändring i teknik, såsom dissektion av komplex follikelstimulerande granulosa cell från odlade neonatal äggstocken 1.
Senare skeden av foUikelutveckling kan utvecklas in vitro genom att dissekera ut enskilda, intakta sena pre-antrala folliklar, som kan odlas till preovulatoriska stadiet i kultur och samtidigt behålla sin tredimensionella struktur. Användningen av intakta folliklar för denna odlingsteknik bibehåller förhållandet mellan de olika follikulära komponenterna som sker in vivo. This kultursystem kan användas för att erhålla oocyter som kan stödja befruktning och efterföljande embryoutveckling.
Fertilizable oocyter kan också erhållas från mus neonatal äggstockar som använder en initial kultur protokollet mycket som beskrivs här, följt av en andra etapp under vilken komplexen oocyt-granulosa cell odlas in vitro en. Andra system som används ganska ofta idag inkluderar kultur av folliklar eller äggstocksvävnad som har inkapslade i ett material såsom alginat hydrogel, för att ge stöd (se till exempel, Tagler et al. 13). Mycket av fokus för metodutveckling nu är att förbättra odlingstekniker för äggstockarna och folliklar av större däggdjur, med det långsiktiga målet att uppnå fertilisable äggceller från primordiala folliklar från en rad olika arter, inklusive människan.
Vid ett och samma tillfälle, däggdjurs äggstockar innehåller folliklar vid en rad utvecklingsstadier, med interactions mellan folliklar påverkar deras reglering. Denna aspekt av äggstocksfunktion är dåligt förstådd och svår att undersöka in vivo. Den sista metoden som beskrivs här använder co-odlingssystem för att stödja utvecklingen av olika stadier av folliklar in vitro. Om så krävs, en eller båda vävnader kan förbehandlas in vivo eller in vitro före samodling. Co-odlingssystem som denna ger en idealisk sättet att undersöka follikelstimulerande follikelstimulerande interaktioner, till exempel hur växer, antrala folliklar påverkar primordial follikeln poolen, aspekter av äggstocks biologin som har visat svåra undersöka förrän nu.
Hela äggstocksodlingstekniker är ganska enkelt, men noggrann dissektion krävs för att undvika oavsiktlig vävnadsskada. Dissekering av enskilda folliklar är en specialiserad teknik, som kräver upprepad övning innan folliklar vid rätt skede kan dissekeras ut från äggstocken intakt och oskadad. Det är kritisktatt dissekera ut enskilda folliklar noga, eller skador under dissektionen protokollet kan leda till hårsäcken död under den efterföljande odlingsperioden. Där folliklar placeras direkt i brunnen av mikrotiterplattor, är det viktigt att använda endast icke-vävnadskultur behandlade plaster, för att minimera bordläggningen ned av thecal celler på plast: om vävnadskultur behandlas plasten används, kommer hårsäckarna fäster vid brunnens botten och bristningar när de växer. För alla samodling fungera måste vävnaderna placeras direkt i kontakt med varandra.
Mediet i detalj ovan för användning i follikeln odlingstekniken innefattar tillsättning av musserum. Det är möjligt att ersätta musen serum med fetalbovinserum, men endast enstaka partier av sådana sera kommer fullt ut stödja foUikelutveckling till preovulatoriska scenen, med batch-tester som krävs för att identifiera lämpliga källor. Batch-testning av FSH är också tillrådligt, eftersom den internationella Units genom vilken FSH bedöms korrelerar endast grovt till tillväxten av folliklar in vitro. Om follikelstimulerande bristning inträffar rutinmässigt under odlingsperioden, överväga att ersätta lager askorbinsyra med ett nytt parti.
Teknikerna inte kräver annat än dissekera mikroskop och vävnadsodlings inkubatorer särskilt specialiserad utrustning, även om användning av en huv med laminärt flöde och god sterilteknik tillåta äggstocksfollikler som skall odlas i frånvaro av antibiotika, såsom i de metoder som beskrivs här. Detta kan vara till hjälp, för att undvika eventuella skadliga effekten av antibiotika på ägg, speciellt om de ska befruktas efter kultur. Där det inte är möjligt att arbeta i en steril miljö, är det tillrådligt att tillsätta antibiotika till dissektion och odlingsmedia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
- Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).
- McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles. Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).
- Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin. PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).
- Murray, A. A., et al. Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids. Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles. Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).
- Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein. Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Maiani, E., et al. Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib. Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).
- Spears, N., Bruin, dr, Gosden, J. P., G, R. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).
- Tagler, D., et al. Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).
