Detta protokoll beskriver den primära kultur / co-kultur av mus äggstocksvävnad, med hjälp av äggstockar från neonatala möss och enskilda äggstocksfollikler från prepubertala möss. De odlingstekniker stödja utvecklingen i ett mycket fysiologiskt sätt, vilket gör undersökning av effekten av yttre medel på äggstocken, och av växelverkan mellan äggblåsor.
Däggdjurs äggstock är sammansatt av ovariefolliklar, varje follikel bestående av en enda oocyt omgiven av somatiska granulosaceller, slutna tillsammans inom ett basalmembran. En ändlig pool av folliklar fastställs under fosterutvecklingen, när äggceller i meiotiska gripande bildar ett nära samarbete med tillplattade granulosaceller, bildar primordiala folliklar. Genom eller strax efter födseln, däggdjurs äggstockar innehåller sin livstid leverans av primordial folliklar, från vilken punkt och framåt finns det en jämn frisättning av folliklar i den växande follikulär poolen.
Den äggstocken är särskilt mottaglig för utveckling in vitro, med folliklar växer i en mycket fysiologiskt sätt i kultur. Detta arbete beskriver kulturen i hela neonatal äggstockar innehåller primordial folliklar, och kulturen i enskilda äggblåsor, en metod som kan stödja utvecklingen av folliklar från en omogen fram till preovuvande stadium, varefter deras oocyter kan undergå befruktning in vitro. Det arbete som beskrivs här använder odlingssystem för att avgöra hur äggstocken påverkas av exponering för externa föreningar. Vi beskriver också ett samodlingssystemet, vilket möjliggör undersökning av det samspel som sker mellan växande folliklar och den icke-växande pool av primordiala folliklar.
Däggdjurs äggstock är sammansatt av en kvinnlig livstid leverans av oocyter, vardera innesluten i en äggstocks follikel. De folliklar bildas före födseln på vila, primordial scen: när follikeln poolen är etablerad, det finns en ständig och gradvis förflyttning av folliklar från primordial i den växande follikeln poolen. Som folliklar börjar växa, de utvecklas genom de primära, sekundära, preantral och sedan antrala stadier, tills de når preovulatoriska eller Graafsk, skede. Endast oocyter från preovulatorisk folliklar har full utvecklingskompetens, kunna stödja embryonal utveckling till sikt, om befruktade.
Äggstocken har länge varit känt att utvecklas på ett mycket fysiologiskt sätt in vitro. Detta kommer sannolikt att bero på varje äggblåsa innehåller inom sig cellerna krävs för att stödja en äggcell från omogna stadiet (då det inte kan slutföra sin meiotisk delning) genom att than utvecklingsmässigt kompetent stadium (då det kan fullt ut stödja slutförandet av meios, gödsling och utvecklingen av den resulterande embryot till term).
Den fysiologiska naturen hos äggstocken utveckling in vitro har lett till den utbredda användningen av äggstocksodlingstekniker. Följaktligen har in vitro-metoder använts för att undersöka regleringen av äggstocken utveckling, äggstocks patologi (till exempel att av polycystiskt ovariesyndrom, PCOS), undersökning av hur äggstockar / oocyter påverkas av exponering för kemikalier, och även med det praktiska syftet att erhålla fertilizable äggceller från primordiala folliklar. Hittills har den senare uppnåtts enbart med musen äggstocksvävnad 1, även om odlingstekniker som använder folliklar från stora däggdjur, inklusive människor, kraftigt har förbättrats de senaste åren 2,3.
Vi beskriver här flera odlingsmetoder som använder musen äggstocksvävnad. Den första metod använder hela neonatal mus äggstockar, och stöder bildandet och tidig utveckling av primordiala folliklar 4. Det andra systemet stödjer tillväxten av enskilda, intakta äggstocksfollikler från slutet preantral till preovulatoriska scenen; med denna teknik, kan folliklar odlas individuellt eller i par 5,6. Slutligen beskriver vi en samodlingssystemet, kombinera de två första teknikerna i en metod som möjliggör undersökning av samspelet mellan växande och primordiala folliklar 7.
Kultur av enskilda intakta ovarialfolliklar låter tillväxten av folliklar som skall fastställas från dagliga mätningar follikelstimulerande under odlingsperioden, medan medel analys möjliggör undersökning av follikelstimulerande / äggstock hormonproduktion. Ytterligare vävnads analyser kan uppnås genom en samling av folliklar eller äggstocksvävnad vid slutet av kulturen, för histologiska / immunohistologiska analyser eller för efterföljande bearbetning för att exempelvis erhållamRNA eller proteiner.
Vi beskriver här olika odlingssystem som kan utnyttjas för att stödja utvecklingen av mus äggblåsor in vitro, användning av hela neonatal äggstockar innehåller bara de tidigaste follikelstimulerande stadierna, enskilda preantral äggblåsor och även co-kulturer av de två vävnaderna.
Kultur av neonatal mus äggstockar stödjer tidig äggstocks utveckling, särskilt tillväxten av folliklar initiering upp till den sekundära follikelstimulerande stadiet. En rad åldrarna neonatala möss kan användas för dessa kulturer, beroende på utvecklingsstadier av intresse. Om äggstockarna erhålls från nyfödda möss, kommer follikelstimulerande bildning vara på väg men ännu inte klar: kultur kommer åtminstone delvis att stödja fortsatt follikelstimulerande bildning följt av tillväxten av folliklar. Alternativt (vid vilken tid follikelstimulerande bildningen redan kompletta) användning av äggstockar från möss cirka fyra till fem dagars ålder resulterar i odling av ett större antal primordial och växande Follilarna 12. Fördelaktiga aspekter av den specifika teknik som beskrivs här inkluderar användning av flytande polykarbonatmembran, som tillåter större syresättning av vävnaden, och kultur i en mycket grundläggande medium bestående av endast aMEM och BSA, undvika användning av odefinierade tillsatser såsom serum. Kultur av hela äggstockar verkar inte stödja utvecklingen bortom den sekundära follikelstimulerande scenen, med efterföljande utveckling kräver en förändring i teknik, såsom dissektion av komplex follikelstimulerande granulosa cell från odlade neonatal äggstocken 1.
Senare skeden av foUikelutveckling kan utvecklas in vitro genom att dissekera ut enskilda, intakta sena pre-antrala folliklar, som kan odlas till preovulatoriska stadiet i kultur och samtidigt behålla sin tredimensionella struktur. Användningen av intakta folliklar för denna odlingsteknik bibehåller förhållandet mellan de olika follikulära komponenterna som sker in vivo. This kultursystem kan användas för att erhålla oocyter som kan stödja befruktning och efterföljande embryoutveckling.
Fertilizable oocyter kan också erhållas från mus neonatal äggstockar som använder en initial kultur protokollet mycket som beskrivs här, följt av en andra etapp under vilken komplexen oocyt-granulosa cell odlas in vitro en. Andra system som används ganska ofta idag inkluderar kultur av folliklar eller äggstocksvävnad som har inkapslade i ett material såsom alginat hydrogel, för att ge stöd (se till exempel, Tagler et al. 13). Mycket av fokus för metodutveckling nu är att förbättra odlingstekniker för äggstockarna och folliklar av större däggdjur, med det långsiktiga målet att uppnå fertilisable äggceller från primordiala folliklar från en rad olika arter, inklusive människan.
Vid ett och samma tillfälle, däggdjurs äggstockar innehåller folliklar vid en rad utvecklingsstadier, med interactions mellan folliklar påverkar deras reglering. Denna aspekt av äggstocksfunktion är dåligt förstådd och svår att undersöka in vivo. Den sista metoden som beskrivs här använder co-odlingssystem för att stödja utvecklingen av olika stadier av folliklar in vitro. Om så krävs, en eller båda vävnader kan förbehandlas in vivo eller in vitro före samodling. Co-odlingssystem som denna ger en idealisk sättet att undersöka follikelstimulerande follikelstimulerande interaktioner, till exempel hur växer, antrala folliklar påverkar primordial follikeln poolen, aspekter av äggstocks biologin som har visat svåra undersöka förrän nu.
Hela äggstocksodlingstekniker är ganska enkelt, men noggrann dissektion krävs för att undvika oavsiktlig vävnadsskada. Dissekering av enskilda folliklar är en specialiserad teknik, som kräver upprepad övning innan folliklar vid rätt skede kan dissekeras ut från äggstocken intakt och oskadad. Det är kritisktatt dissekera ut enskilda folliklar noga, eller skador under dissektionen protokollet kan leda till hårsäcken död under den efterföljande odlingsperioden. Där folliklar placeras direkt i brunnen av mikrotiterplattor, är det viktigt att använda endast icke-vävnadskultur behandlade plaster, för att minimera bordläggningen ned av thecal celler på plast: om vävnadskultur behandlas plasten används, kommer hårsäckarna fäster vid brunnens botten och bristningar när de växer. För alla samodling fungera måste vävnaderna placeras direkt i kontakt med varandra.
Mediet i detalj ovan för användning i follikeln odlingstekniken innefattar tillsättning av musserum. Det är möjligt att ersätta musen serum med fetalbovinserum, men endast enstaka partier av sådana sera kommer fullt ut stödja foUikelutveckling till preovulatoriska scenen, med batch-tester som krävs för att identifiera lämpliga källor. Batch-testning av FSH är också tillrådligt, eftersom den internationella Units genom vilken FSH bedöms korrelerar endast grovt till tillväxten av folliklar in vitro. Om follikelstimulerande bristning inträffar rutinmässigt under odlingsperioden, överväga att ersätta lager askorbinsyra med ett nytt parti.
Teknikerna inte kräver annat än dissekera mikroskop och vävnadsodlings inkubatorer särskilt specialiserad utrustning, även om användning av en huv med laminärt flöde och god sterilteknik tillåta äggstocksfollikler som skall odlas i frånvaro av antibiotika, såsom i de metoder som beskrivs här. Detta kan vara till hjälp, för att undvika eventuella skadliga effekten av antibiotika på ägg, speciellt om de ska befruktas efter kultur. Där det inte är möjligt att arbeta i en steril miljö, är det tillrådligt att tillsätta antibiotika till dissektion och odlingsmedia.
The authors have nothing to disclose.
Work was funded by MRC grant G1002118.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L) |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
Mouse serum | – | – | Collected from cardiac puncture |
FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20°C. |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20°C. |
Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
Syringe filters (25mm, 0.2µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter: for filtering larger (> 5mls) volumes of medium. |
Syringe filters (13mm, 0.2µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter: for filtering smaller (< 5mls) volumes of medium |
Syringe filters (25mm, 0.45µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter: for filtering oil. |
Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
24 well plate | Greiner | 662160 | |
96 well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
96 well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0µm pore size |
Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33mm (29G) +1ml |
Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilise then warm before use |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use |
Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30mmx0.25 Type C | |
Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |