Summary
Dit protocol beschrijft de primaire cultuur / co-cultuur van de muis eierstokweefsel, met behulp van de eierstokken van pasgeboren muizen en individuele ovariële follikels van prepuberale muizen. De kweektechnieken ondersteunen In een sterk fysiologische wijze, waardoor onderzoek naar het effect van extrinsieke middelen op de eierstok en interacties tussen ovariële follikels.
Abstract
De zoogdierlijke ovarium bestaat ovariële follikels elke follikel bestaan uit één eicel omgeven door somatische granulosacellen, samen omsloten door een basale membraan. Een eindige pool van follikels wordt tijdens de embryonale ontwikkeling, wanneer eicellen in meiotische arrestatie vormen een nauwe samenwerking met afgeplatte granulosacellen, de vorming van primordiale follikels vastgelegd. Bij of kort na de geboorte, zoogdieren eierstokken bevatten levering van primordiale follikels hun leven, vanuit welk punt verder is er een geleidelijke afgifte van follikels in de groeiende folliculaire zwembad.
De eierstok is bijzonder vatbaar voor ontwikkeling in vitro, met follikels groeien in een zeer fysiologische wijze cultuur. Het beschrijft de kweek van gehele neonatale eierstokken die primordiale follikels en de cultuur van individuele ovariële follikels, een werkwijze die de ontwikkeling van follikels van een onvolwassen kan ondersteunen door de preovugevende stadium, waarna de eicellen kunnen bevruchting ondergaan in vitro. Het werk geschetste gebruikt kweeksystemen te bepalen hoe de eierstok wordt beïnvloed door blootstelling aan externe verbindingen. We beschrijven ook een co-kweeksysteem dat onderzoek de interacties die optreden tussen de follikels en de niet-groeiende pool van primordiale follikels maakt.
Introduction
De zoogdieren eierstok is samengesteld uit levenslange voorraad van eicellen van een vrouw, elk geborgen in een follikel. De follikels zijn gevormd voor de geboorte bij de rust, primordiale stadium: zodra het follikel pool is vastgesteld, is er een voortdurende en geleidelijke beweging van follikels van de oorspronkelijke in de groeiende follikel zwembad. Omdat follikels beginnen te groeien, ontwikkelen zij door de primaire, secundaire, preantral en dan antral stadia, totdat ze de preovulatory of Graafse, stadium te bereiken. Alleen eicellen uit preovulatoire follikels hebben volledige ontwikkelingsstoornissen, in staat om de embryonale ontwikkeling te ondersteunen om termijn, indien bevrucht.
Het ovarium is al lang bekend ontwikkelen op een zeer fysiologische wijze in vitro. Dit is waarschijnlijk toe te schrijven aan elke follikel met daarin de cellen nodig om een oöcyt van onrijpe (op welk punt het in staat is de meiotische deling voltooid) tot t ondersteunenHij ontwikkelingsgebied competent fase (op welk punt kan volledig achter de voltooiing van meiose, bevruchting en de ontwikkeling van de resulterende embryo voldragen).
De fysiologische aard van eierstok ontwikkeling in vitro heeft geleid tot het uitgebreide gebruik van ovariumcultuur technieken. Bijgevolg hebben in vitro methoden zijn gebruikt om de regulering van de eierstok ontwikkeling, ovariële pathologie (bijvoorbeeld die van polycysteus ovarium syndroom, PCOS), nagaan hoe de eierstokken / eicellen worden beïnvloed door blootstelling aan chemische stoffen, en ook met de praktische doel van onderzoeken verkrijgen fertilizable eicellen uit primordiale follikels in de eierstokken. Tot op heden is deze alleen bereikt middels muis eierstokweefsel 1, hoewel kweektechnieken met follikels van grote zoogdieren, waaronder mensen, zijn sterk verbeterd in de afgelopen jaren 2,3.
We beschrijven hier meerdere cultuur methoden met behulp van de muis eierstokweefsel. De eerste method maakt gebruik van hele neonatale muis eierstokken, en ondersteunt de vorming en de vroege ontwikkeling van primordiale follikels 4. Het tweede systeem ondersteunt de groei van het individu, intacte ovariële follikels uit de late preantral naar de pre-ovulatoire fase; Met deze techniek kan follikels afzonderlijk gekweekt of in paren 5,6. Tenslotte beschrijven we een co-kweeksysteem, de eerste twee technieken combineren een methode die onderzoek naar de interactie tussen groeiende en primordiale ovariële follikels 7 toelaat.
Cultuur van individuele intacte ovariële follikels laat follikel groei te bepalen uit de dagelijkse follikel metingen tijdens de kweekperiode, terwijl het medium analyse laat onderzoek van follikel / eierstok hormoonproductie. Verdere analyses weefsel kan worden bereikt door een verzameling van follikels of eierstokweefsel eind cultuur histologische / immunohistologische analyse of voor verdere verwerking bijvoorbeeld verkrijgenmRNA of eiwitten.
Protocol
Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen onder licentie door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken (project licentienummer PPL 60/1726 en 60/4026).
Opmerking: Huis dieren in overeenstemming met de Britse wettelijke eisen in een 14 uur licht en 10 uur donker fotoperiode. Gedrag dierproeven met wildtype muizen C57Bl6J, Tau-GFP muizen die alomtegenwoordige expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) 8 en Thy1-YFP muizen met af expressie van geel fluorescerend eiwit (YFP) in een subset van neuronale cellen 9 hebben: beide transgene lijnen werden gekweekt op een C57Bl6J achtergrond.
1. arbeidsomstandigheden en voorbereiding van instrumenten
- Voer alle media bereiding, weefsel dissecties en cultuur werken in een laminaire stroming kap steriliteit: vermijdt de eis van de toevoeging van antibiotica media.
- Altijd toestaan media / cultuur platen / embryo gerechten in evenwichtten minste 1 uur in een 37 ° C oven (dissectie medium / embryo schotels) of 37 ° C, 5% CO2 incubator (cultuurmedium en platen), voorafgaand aan gebruik.
- Soak glazen pipetten in 0,1% oplossing van bovine serum albumine (BSA) voor ongeveer een uur, en dan laten drogen. Trek pipetten in de vlam van een bunsenbrander, buigen het glas als je dat doet, om fijn getekende gebogen glazen pipetten te produceren. Na de pipet wordt getrokken, is een schone snede met een glassnijder. Oven steriliseren bij 160 ° C gedurende ongeveer 45 min.
OPMERKING: Een opslag van deze glazen pipetten nodig om eierstokken en follikels dragen.
2. Voorbereiding van Dissection en Cultuur Media
- Bereid Dissection Medium.
- Los 3 mg / ml BSA in Leibowitz L15 medium en filter gesteriliseerd door een 0,2 um porie, 25 mm filter.
- Neonatale Ovarium Cultuur.
- Tot medium te bereiden op neonatale ovariumcultuur, maak 1 ml medium voor each eierstok die worden gekweekt. Los 3 mg / ml BSA in α-Minimal Essential Media (aMEM) en filter gesteriliseerd door een 0,2 um porie, 13 mm diameter filter in een steriele buis.
- Om platen te bereiden op neonatale ovariumcultuur, voeg 1 ml van neonatale eierstok kweekmedium in elk putje (één eierstok per putje) van een 24-well plaat. Met steriele horlogemaker tang, plaats een polycarbonaat membraan bovenop het medium in elk putje, glanzend oppervlak tot. UV steriliseren membranen voor gebruik.
- Follikel cultuur.
- Om medium voorbereiding follikel cultuur supplement α-Minimal Essential Media met 1 IU / ml recombinant humaan follikel stimulerend hormoon, 5 ug / ml ascorbinezuur en 5% v / v serum verkregen van volwassen vrouwelijke muizen. Filter steriliseer door een 0,2 um porie, 13 mm diameter filter in een steriele buis.
- Filter steriliseer siliconenolie met een diameter 0,45 pm porie, 25 mm, in een steriele buis.
- Om pla bereidentes, Breng 30 pl druppels follikel kweekmedium in elk putje van een niet-weefselkweek behandelde 96-well microtiterplaten met ronde putjes met alleen de bovenste rij van elke plaat (zodat follikels in nieuwe rijen worden bewogen elke dag over de kweekperiode). Overlay zorgvuldig medium met 70 pi gesteriliseerd siliconenolie, tot medium verdamping te voorkomen.
- Follikel-eierstok Co-cultuur.
- Bereid medium voor follikel-eierstok co-cultuur als voor follikel cultuur in stap 2.3.1 hierboven, die samen 1 ml medium voor elke follikel-eierstok co-cultuur opgezet.
- Om petrischaal, voeg 1 ml medium in elk putje van een 24-wells plaat. Met steriele horlogemaker tang, plaats een Nucleopore membraan bovenop het medium in elk putje, glanzend oppervlak tot. UV steriliseren membranen voor gebruik.
3. Neonatale Ovarium Dissection en Cultuur
- Plaats 1 ml dissectie medium in elke steriele glazen embryo schotel. <li> Cull neonatale muis pups in de leeftijd tussen postnatale dag 0 en 5, ruimen door onthoofding volgens Britse ministerie van Binnenlandse Zaken regelgeving.
- Pak de huid die de buikwand met behulp van een paar fijne dissectie pincet en maak een grote snede in de huid en het lichaam muur. Trek opent de incisie, zodat de hele buik wordt blootgesteld. De blaas wordt gewoonlijk gezwollen in dit stadium kan worden doorboord om ontleding te vergemakkelijken.
- Verplaats het lef uit de weg met behulp van horlogemaker tang. Volg de baarmoederhoorns van de blaas naar de nieren aan elke kant. De eierstok ligt net onder de nieren bovenaan de baarmoeder en zal verschijnen als een wolk structuur onder een stereomicroscoop.
- Pak de eierstok voorzichtig met horlogemaker tang, en gebruik een schaar om zijn gehechtheid aan de baarmoeder te verbreken. Breng de paar eierstokken in embryo vaat met voorverwarmde dissectie medium.
- Het uitvoeren van fijne dissectie van eierstokken onder een dissectie microscoop op een verwarmde stage (37 ° C). Gebruik van insuline naalden weg te trimmen de bursitis sac en het overtollige materiaal met inbegrip van de eileider, totdat alleen de eierstok blijft.
- Breng elke eierstok in het putje van een kweekplaat bereid in stap 2.2.2, gebruikmakend van een fijn getekende gebogen glazen pipet, een eierstok bovenop elk membraan (zie figuur 1A). Cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Veranderen om de dag het medium. Gebruik een pipet 50% van het medium wisselen elk putje voor pre ontgast vers medium: plaats de pipetpunt aan de rand van de put drager niet te verstoren het membraan.
- Handhaaf kweken tot 6 dagen.
- Aan het einde van de kweek, bevriezen medium repareren of eierstokken bevriezen na een korte wassen in PBS, zoals vereist.
- Fix eierstokken in Bouin's fixatief 90 min voor histologische analyse, of in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 90 min voor immunohistologische analyse. Snap bevriezen eierstokken door het plaatsen van weefsel ineen polypropyleen buis, het plaatsen van de buis in droogijs gedurende 5-10 minuten voor bevriezen bij -70 ° C voor daaropvolgende eiwit of mRNA-extractie.
4. Follikel Dissection en Cultuur
- Ruimen 19-23 dagen oude vrouwelijke muizen en isoleren van de eierstokken. Maak de vacht met 70% ethanol alvorens een incisies. Huidplooi met stompe uiteinden pincet en een grote incisie in de buik met dissectie scharen, doordringen tot zowel de huid als de lichaamswand.
- Beweeg de darm uit de weg met behulp van een fijnere set van dissectie instrumenten en zoek de baarmoeder. Volg de baarmoeder naar de eierstok die zich onder de nier aan elke kant.
- Voorzichtig grijpen de eierstok behulp van een paar pincetten horlogemaker, scheiden de eierstokken bevestiging aan de baarmoeder met fijne dissectie schaar. Vermijd het verzamelen van te veel van de ovariële vet pad. Het verzamelen van de eierstokken en de overdracht tot een embryo gerechten met voorverwarmde dissectie medium.
- Reverplaats de ovariële bursa met behulp van insuline naalden weg te trimmen de bursitis sac en het overtollige materiaal met inbegrip van de eileider, totdat alleen de eierstok blijft. Ruwweg halveren elke eierstok met behulp van insuline naalden.
- Breng elke eierstok-half voorzichtig in een individuele horlogeglas met 1 ml dissectie medium. Bedek elk horlogeglas met een glasplaatje om verdamping van medium te voorkomen en om de steriliteit te waarborgen.
- WINKEL horlogeglazen bevattende eierstok helften in een 37 ° C oven totdat het nodig zijn maar zich de volgende dissectie stap zo snel mogelijk. Gooi weefsel opgeslagen op deze manier voor meer dan een uur.
- Transfer horlogeglas met een eierstok halve tot 37 ° C verwarmd microscooptafel in een laminaire stroming kap. Ongeveer ontleden eierstok in grote stukken met twee insuline naalden, teneinde late pre-antrale follikels identificeren als volgt: deze zullen 2-3 lagen granulosacellen bevatten en hebben een diameter van ongeveer 180-200 urn.
- Handmatig ontleden elke identified follikels met behulp van een insuline naald en een 30 x 0,25 mm acupunctuur naald die is verzekerd in een naaldhouder. Wees voorzichtig om het grootste deel van de omliggende stroma te verwijderen, maar voorkomen dat schade aan de basale lamina van follikels (zie figuur 1B).
- Gebruik een fijn getekende gebogen glazen pipet om ontleed follikels zorgvuldig over te dragen in een verzamelen horlogeglas met voorverwarmde dissectie medium. Wees voorzichtig om follikels te houden binnen de dunne kaliber gedeelte van de pipet om te voorkomen dat follikels.
- Maatregel follikels nauwkeurig met behulp van een geijkte oculairgraticule gemonteerd in een dissectie microscoop.
- Selecteer follikels voor cultuur alleen als ze meten 190 ± 10 micrometer in doorsnede. Selecteer verder alleen gezond, sferische follikels voor cultuur; deze zullen doorzichtig zijn, zonder donkere atretische gebieden, en hebben een intacte basale lamina, samen met enkele bijgevoegde thecal weefsel: gooi geen follikels die niet passen in deze beschrijving. Een opbrengst van tussen 10-15 follikels per ovarium is goed.
- Gebruik een fijn getekende gebogen glazen pipet om een enkele follikel te zetten in het putje van een plaat gemaakt als in stap 2.3.3. Plaats de follikel voorzichtig in de bodem van de put (en niet in de bovenste olielaag). Cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Culture follikels tot 6 dagen, bewegen follikels in een putje met vers medium elke dag.
- Bereid de volgende rij in de 96-well plaat zoals in plaat bereiding in stap 2.3.3. Terug plaat incubator voor minstens een uur equilibratie mogelijk. Transfer follikels in de frisse putten van medium, met behulp van een fijn getekende glazen pipet.
- Als op enig moment in de cultuur follikels worden gelaten gedurende twee dagen alvorens naar vers medium, plaatst elke follikel in een minimum van 60 pl (in plaats van 30 ui) druppels follikel kweekmedium.
- Om gegevens op de follikelgroei te verzamelen, meten follikels dagelijks, met behulp van een eyepiece raster gemonteerd in een dissectie microscoop. De olielaag zullen metingen van de follikel diameter vervormen, dus werken de kalibratiecoëfficiënt voor de set-up.
- Aan het einde van de kweek, bevriezen medium repareren of te bevriezen weefsel voor latere analyse, zoals in stap 3.10 hierboven.
- Follikel-follikel Co-cultuur.
- Cultuur twee follikels bij elkaar, om de interacties tussen de follikels te onderzoeken. Cultuur als hierboven, maar plaatst u twee follikels side-by-side, in contact, in een put.
- Plaats 100 pl druppels follikel kweekmedium in elk putje van een niet-weefselkweek behandelde 96-well microtiterplaat vlakke-well plaat bedekken medium met 100 ui gesteriliseerd siliconenolie. Niet follikels in de frisse putten overdragen zoals in stap 4.13 hierboven, maar in plaats daarvan gebruik maken van een fijne gel tip om 50% te veranderen van het medium om de andere dag.
- Om weefsel oorsprong in de co-cultuur identificeren co-cultuur follikels elk uit een andere genetische bron, bijvoorbeeld one van de eierstok van een wildtype muis, en de andere uit de eierstok van een muis met alomtegenwoordige expressie van GFP. Bij gebruik van GFP of YFP weefsel minimaliseren blootstelling van weefsel zo veel mogelijk licht tijdens cultuur, en door de fixatie / verwerkingsstappen daarna.
OPMERKING: Het is normaal dat de twee follikels om samen te groeien in een enkele, 'twee-follikel' eenheid (zie figuur 1C).
5. Follikel-Ovarium Co-culturen
- Ontleden eierstokken en follikels uitgevoerd als in de afdelingen 3 en 4 hierboven.
- Plaats een neonatale eierstok op een membraan, in een plaat bereid als in stap 2.4.2 hierboven. Plaats voorzichtig één follikel in contact met één pool van de neonatale eierstok, met een fijn getekende gebogen glazen pipet. Cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende maximaal 5 dagen.
- Om onderscheid te maken tussen het weefsel oorsprong binnen de co-cultuur, gebruiken en eierstokken follikels uit twee verschillende dusurces, bijvoorbeeld een van een wild-type muis, en één van een muis met alomtegenwoordige uitdrukking van GFP.
- Breng 500 pi medium dagelijks zoals in stap 3.8 hierboven, maar met follikel kweekmedium. Tijdens de co-cultuur, de follikel vaak ingekapseld wordt door de eierstok (figuur 1D).
- Aan het einde van de kweek, bevriezen medium repareren of te bevriezen weefsel voor latere analyse, zoals in stap 3.10 hierboven.
6. Fixatie, Immunocytochemie en beeldvorming van Gekweekte Tissue
- Eind cultuur, wassen weefsel in PBS en overdragen aan 100 pl (follikel) of 1 ml (eierstok) 10% neutraal gebufferde formaline en vast gedurende 1 uur op ijs. Bewegen door 3 wasbeurten van 1x PBS bij 4 ° C.
- Voor immunocytochemie van follikels, transfer van putjes van een 96-well microtiterplaat round-well plaat met een fijn getekende gebogen glazen pipet, waarbij elk putje met verschillende wasbeurten behandelingen.
- Voor immuuncytochemie op Ovaries (of eierstok-follikel co-culturen), insluiten in 4% agarosegel en rubriek 50 micrometer met een vibrotome. Float secties in de putjes van een 24-putjesplaat wasbeurten behandeling toepassen, verwijderen met een pipet.
- Voor de beeldvorming: overdragen agarose secties om vlak glas dia's en monteren met montage medium; of overdracht follikels (of follikel-follikel complexen) om holte glas dia's en monteer met niet-verharding montage medium. Afbeelding monsters met een confocale microscoop.
Representative Results
Figuur 1 toont beeld van eierstokken en follikels begin en tijdens de procedures cultuur.
Figuur 2 toont representatieve resultaten van neonatale eierstokken (hier, eierstokken van pasgeboren pups) blootgesteld aan reprotoxische stoffen tijdens cultuur. Neonatale eierstokken werden gekweekt gedurende 6 dagen, en blootgesteld aan een chemotherapiedrug, hetzij cisplatine of doxorubicine, op dag 2 van de cultuur. Aan het einde van de kweek werden eierstokken vastgesteld verwerkt voor histologie en eierstokken vervolgens onderzocht om het aantal gezonde en ongezonde ovariële follikels 4 bepalen. Alternatief kan een snellere beoordeling van vroege follikels verkregen uit de kweek van ovariële fragmenten met eierstokken van een muis expressie een oöcyt-specifieke fluorescente merker 10.
Tijdens de kweek van individuele follikels, kan follikelgroei gemakkelijk worden vastgesteld door dagelijkse metingen tijdens de culture periode. Figuur 3 toont representatieve resultaten van de groei van de follikels gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van het gonadotrofine hormonen follikel stimulerend hormoon (FSH) en luteïniserend hormoon (LH) 5.
Follikel follikel of follikel-eierstok co-cultuur kan worden gebruikt om de interacties tussen follikels onderzoeken. Afhankelijk van het weefsel en verwerking, kunnen beelden worden verkregen met helderveld, fluorescentie of confocale microscopen. Figuur 4 toont representatieve resultaten van beelden van dergelijke co-culturen onderzocht verschillende celtypen betrokken bij follikel follikel communicatie, waaronder endotheel- en zenuwcellen 7.
Figuur 1: (A) microfoto van een neonatale eierstok verkregen uit een muis in de geboortedatum, geplaatst een polycarbonaat membraan. (B) microfoto van vers ontleed gezonde ovariële follikel, met de meeste van de omliggende stromale weefsel weg ontleed. (C) Microfoto van co-cultuur van twee ovariumfollikels over de eerste drie dagen van de cultuur, het tonen het nauwe contact dat ontstaat tussen de twee follikels als de opbrengst cultuur (Ci: eerste dag van de cultuur; Cii: tweede dag van de cultuur; CIII : derde dag van de cultuur). Gereproduceerd van Spears et al. 11 (D) microfoto van co-gekweekte preantral follikel en neonatale eierstok na twee dagen kweken. Afbeelding toont de follikel raken ingekapseld door de eierstok. Pijl toont preantral follikel. Afbeelding van Dr. Federica Lopes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
guur 2 "src =" / files / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg "/>
Figuur 2: Effect van de chemotherapie drugs cisplatine en doxorubicine op neonatale gekweekte eierstokken cisplatine en doxorubicine beide leiden tot verlies van de follikel gezondheid en een vermindering van de follikel nummers.. (A) cisplatine; (B) doxorubicine: (i) Percentage van ongezonde follikels (duidelijke); en (ii) het totale aantal follikels (gearceerd) in elke eierstok. Bars duiden betekenen + sem; n = 5 voor alle groepen, Sterren duiden significante verschillen ten opzichte van controle (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Overgenomen van Morgan et al. 4
Figuur 3:. Groeicijfers van follikels blootgesteld aan verschillende gonadotrofine omgevingen Waarden zijn gemiddelden ± SEM (n ≥16 voor elke groep). Pijl geeft de start van antral-vorming in alle gonadotrofine groepen. Gereproduceerd van Murray et al. 5
Figuur 4: Beelden van follikel follikel en eierstok-follikel co-culturen, met follikel follikel interacties (A) confocale microscoop van een groen fluorescerend eiwit (GFP) en follikel een wildtype (WT) follikel na co-kweek (. GFP expressie hier afgebeeld in wit), met de processen van de GFP follikel getoond die zich uitstrekt over de WT follikel. (B) Dwarsdoorsnede door een GFP / WT follikel complexe volgende co-cultuur, waaruit blijkt dat GFP processen (groen) van de aangrenzende follikel leugen grenzend aan de basale lamina van de WT follikel. (C) Neonatale WT eierstok na kweek met een pre-antrale follikel-GFP tot expressie, waaruit blijkt dat GFP cellen en cellulaire processen (groen) zijn gemigreerddoor de ovariële interstitum van de neonatale eierstok. (D) GFP / WT follikel complex met endotheelcellen, getoond door expressie van endotheelcel merker CD31 (rood). (E) GFP / WT follikel complex met neuronale cellen, getoond door expressie van neuronale marker beta tubuline III (zie hier als rood, of geel als dubbel-gelabeld met GFP, groen). (F) YFP / WT follikel complex, waar YFP verwijst naar follikel een Thy1-YFP muis die incidenteel expressie van geel fluorescerend eiwit (YFP: geel) in een subset van neuronale cellen 9, waaruit blijkt dat neuronen uitstrekken vanaf de YFP follikel. Bars 50 urn (A, B, D), 100 urn (C, E, F), 100 urn (inzet in A), 10 urn (inzet in C), 15 urn (inzet in D). Gereproduceerd van Campbell et al. 7 Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijkenguur.
Discussion
We beschrijven hier verschillende kweeksystemen die kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling van de muis ovariële follikels ondersteunt in vitro, met hele neonatale eierstokken met alleen de vroegste stadia follikel, individuele preantral ovariële follikels en ook co-culturen van de twee weefsels.
Cultuur van neonatale muis eierstokken ondersteunt vroege ovariële ontwikkeling, met name de follikelgroei initiatie tot de secundaire follikel podium. Een spreiding in leeftijd van neonatale muizen kunnen worden gebruikt om deze kweken, afhankelijk van de ontwikkelingsstadia van belang. Als eierstokken worden verkregen van pasgeboren muizen, zal follikel vorming aan de gang, maar nog niet compleet zijn: cultuur zal ten minste gedeeltelijk te ondersteunen verdere follikel vorming gevolgd door follikel groei. Alternatief gebruik van eierstokken van muizen ongeveer vier tot vijf dagen oud (tegen die tijd follikel vorming reeds voltooid) resulteert in kweek van een groter aantal primordiale en groeiende Follikelen 12. Gunstige aspecten van de specifieke techniek beschreven onder gebruik van drijvende polycarbonaat membranen, die een grotere zuurstofvoorziening van het weefsel en cultuur toe in een basisch medium bestaande uit slechts aMEM en BSA, vermijden van het gebruik van ongedefinieerde additieven zoals serum. Culture of geheel eierstokken lijkt geen ondersteuning ontwikkeling dan de secundaire follikel stadium latere ontwikkeling van de verandering in techniek, zoals de ontleding van follikel-granulosacellen complexen uit de gekweekte neonatale eierstok 1.
Latere stadia van de follikelontwikkeling kan in vitro worden ontwikkeld door ontleden uit afzonderlijke, intacte late pre-antrale follikels, die kunnen worden gekweekt tot het preovulatoire stadium cultuur behoud van de driedimensionale structuur. Het gebruik van intacte follikels van deze cultuur techniek blijft de verhouding tussen de verschillende folliculaire componenten in vivo optreedt. This kweeksysteem kan worden gebruikt om eicellen bevruchting en latere embryo-ontwikkeling kan ondersteunen verkrijgen.
Fertilizable eicellen kunnen ook worden verkregen uit muizen neonatale eierstokken met een initiële cultuurprotocol veel beschreven, gevolgd door een tweede fase waarin oöcyt-complexen granulosa cellen gekweekt in vitro 1. Andere systemen vrij vaak omvatten vandaag cultuur van follikels of eierstokweefsel die is ingekapseld in een materiaal zoals alginaat hydrogel te ondersteunen (zie bijvoorbeeld Tagler et al. 13). Veel van de focus van methode ontwikkeling nu kweektechnieken voor de eierstokken en follikels van grotere zoogdieren te verbeteren, met als doel het verkrijgen fertilisable oöcyten van primordiale follikels uit een aantal soorten, waaronder mensen langdurig.
Op een bepaald moment, zoogdieren eierstokken bevatten follikels bij een bereik van ontwikkelingsstadia, met interactions tussen follikels die hun regelgeving. Dit aspect van ovariële functie wordt slecht begrepen en moeilijk te onderzoeken in vivo. De laatste methode beschreven maakt gelijktijdige kweeksystemen ontwikkeling van verschillende stadia van follikels in vitro ondersteunen. Indien nodig, een of beide weefsels worden voorbehandeld in vivo of in vitro voor co-cultuur. Co-kweeksystemen zoals dit een ideale manier om follikel follikel-interacties te onderzoeken, bijvoorbeeld hoe groeien, antrale follikels beïnvloeden het primordiale follikel pool, aspecten ovariële biologie die moeilijk gebleken te onderzoeken tot nu.
Hele eierstok cultuur technieken zijn vrij eenvoudig, maar een zorgvuldige dissectie is nodig om onbedoelde weefselschade te voorkomen. Dissectie van de individuele follikels is een gespecialiseerde techniek, waarbij herhaalde praktijk voordat follikels op het juiste stadium kan worden ontleed uit de eierstok intact en onbeschadigd. Het is cruciaalte ontleden individuele follikels zorgvuldig, of schade opgelopen tijdens de dissectie protocol kan resulteren in een follikel dood tijdens de daaropvolgende kweekperiode. Wanneer follikels direct in het putje van microtiterplaten geplaatst, is het belangrijk om alleen niet-weefselkweek behandelde plastic gebruiken om laag af van thecale cellen op het kunststof te minimaliseren: als weefselkweek behandelde plasticware wordt gebruikt, zal de follikels hechten aan de bodem van de put en scheuren als ze groeien. Voor alle co-cultuur, dienen de weefsels direct contact met elkaar worden geplaatst.
Het medium hierboven beschreven voor gebruik in de follikel kweektechniek omvat de toevoeging van muizenserum. Het is mogelijk om het muizenserum met foetaal runderserum vervangen, maar slechts incidenteel partijen van deze sera volledig ondersteunen follikelontwikkeling het pre-ovulatoire fase ladingsgewijs testen moeten geschikte bronnen te identificeren. Batch-testen van FSH is ook aan te raden, omdat de internationale Units door die FSH wordt beoordeeld correlaat alleen grof tot follikelgroei in vitro. Als follikel ruptuur routinematig optreedt tijdens de kweekperiode, overwegen ter vervanging voorraad ascorbinezuur met een verse partij.
De technieken niet bijzonder gespecialiseerde apparatuur dan ontleden microscopen en weefselkweek incubators nodig, hoewel gebruik van een laminaire stroming kap en goede steriele techniek kan de ovariële follikels worden gekweekt in afwezigheid van antibiotica, zoals in de hier beschreven werkwijzen. Dit kan nuttig zijn, om eventuele schadelijke effect van antibiotica op de oöcyten te voorkomen, vooral wanneer ze worden bevrucht na kweek. Wanneer het niet mogelijk is te werken in een steriele omgeving, is het raadzaam om antibiotica aan de dissectie en cultuurmedia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
- Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).
- McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles. Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).
- Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin. PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).
- Murray, A. A., et al. Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids. Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles. Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).
- Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein. Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Maiani, E., et al. Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib. Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).
- Spears, N., Bruin, dr, Gosden, J. P., G, R. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).
- Tagler, D., et al. Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).
