इस प्रोटोकॉल नवजात चूहों और prepubertal चूहों से अलग-अलग डिम्बग्रंथि के रोम से अंडाशय का उपयोग करते हुए, माउस डिम्बग्रंथि ऊतक के प्राथमिक संस्कृति / सह संस्कृति का वर्णन है। संस्कृति तकनीक अंडाशय पर बाह्य एजेंटों के प्रभाव की जांच की अनुमति देता है, एक अत्यधिक शारीरिक ढंग से विकास का समर्थन है, और डिम्बग्रंथि के रोम के बीच बातचीत की।
स्तनधारी अंडाशय डिम्बग्रंथि के रोम से बना है, दैहिक granulosa कोशिकाओं से घिरा हुआ एक भी डिम्बाणुजनकोशिका से मिलकर प्रत्येक कूप, एक तहखाने झिल्ली के भीतर एक साथ संलग्न। रोम के एक परिमित पूल meiotic गिरफ्तारी में oocytes मौलिक रोम के गठन, चपटा granulosa कोशिकाओं के साथ एक निकट सहयोग के लिए फार्म जब भ्रूण के विकास के दौरान नीचे रखी है। द्वारा या शीघ्र ही जन्म के बाद, स्तनधारी अंडाशय बिंदु से आगे बढ़ रहा है कूपिक पूल में रोम की एक सतत जारी है जिसमें से मौलिक रोम के अपने जीवनकाल की आपूर्ति, होते हैं।
अंडाशय के रोम संस्कृति में एक अत्यधिक शारीरिक ढंग से बढ़ रही है, के साथ इन विट्रो में विकास के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी है। इस काम के मौलिक रोम युक्त पूरे नवजात अंडाशय की संस्कृति, और व्यक्तिगत डिम्बग्रंथि के रोम के संस्कृति, preovu के माध्यम से एक अपरिपक्व से रोम के विकास का समर्थन कर सकते हैं जो एक विधि का वर्णनlatory मंच है, जिसके बाद उनके oocytes इन विट्रो में निषेचन से गुजरना करने में सक्षम हैं। यहाँ रेखांकित काम अंडाशय बाहरी यौगिकों के लिए जोखिम से प्रभावित है कि कैसे निर्धारित करने के लिए संस्कृति सिस्टम का उपयोग करता है। हम भी बढ़ रही रोम और मौलिक रोम के गैर-बढ़ पूल के बीच होती है कि बातचीत की जांच की अनुमति देता है जो एक सह संस्कृति प्रणाली, का वर्णन है।
स्तनधारी अंडाशय oocytes की एक महिला के जीवन की आपूर्ति, एक डिम्बग्रंथि कूप के भीतर निहित प्रत्येक से बना है। रोम विश्राम में जन्म से पहले का गठन कर रहे हैं, मौलिक चरण: कूप पूल की स्थापना की है एक बार, बढ़ती कूप पूल में मौलिक से रोम की एक सतत और क्रमिक आंदोलन है। रोम विकसित करने के लिए शुरू के रूप में वे preovulatory, या Graafian, मुकाम तक पहुंचा है, जब तक वे, प्राथमिक, माध्यमिक, preantral और फिर antral चरणों के माध्यम से विकसित करना। Preovulatory रोम से केवल oocytes निषेचित, तो अवधि के लिए भ्रूण के विकास का समर्थन करने में सक्षम पूर्ण विकास क्षमता है।
अंडाशय में लंबे समय के लिए इन विट्रो में एक अत्यधिक शारीरिक तरीके से विकसित करने के लिए जाना जाता रहा है। इस वजह से यह भीतर अपरिपक्व अवस्था से एक oocyte टी के माध्यम से (जिस पर यह अपने अर्धसूत्रीविभाजन पूरा करने में असमर्थ है प्वाइंट) का समर्थन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक डिम्बग्रंथि कूप को होने की संभावना हैवह विकासात्मक सक्षम मंच (जिस पर यह पूरी तरह से अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और कार्यकाल के लिए जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण के विकास के पूरा समर्थन कर सकते हैं बिंदु)।
इन विट्रो में अंडाशय विकास के शारीरिक प्रकृति अंडाशय संस्कृति तकनीक का व्यापक उपयोग करने के लिए प्रेरित किया है। नतीजतन, इन विट्रो तरीकों (उदाहरण के लिए कि पॉलीसिस्टिक डिम्बग्रंथि सिंड्रोम, पीसीओ का), रसायनों के संपर्क से प्रभावित हैं कैसे अंडाशय / oocytes की परीक्षा है, और भी के व्यावहारिक उद्देश्य के साथ अंडाशय विकास, डिम्बग्रंथि विकृति के नियमन की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है मौलिक डिम्बग्रंथि के रोम से fertilizable oocytes प्राप्त करने के। मानव सहित बड़े स्तनपायी, से रोम का उपयोग करते हुए संस्कृति तकनीक, बहुत हाल के वर्षों 2,3 में सुधार हुआ है, हालांकि तारीख करने के लिए, बाद केवल माउस डिम्बग्रंथि ऊतक एक का उपयोग कर हासिल किया गया है।
हम यहाँ माउस डिम्बग्रंथि ऊतक का उपयोग कर कई संस्कृति विधियों का वर्णन। पहले methoडी पूरे नवजात माउस अंडाशय का उपयोग करता है, और मौलिक रोम 4 के गठन और प्रारंभिक विकास का समर्थन करता है। दूसरी प्रणाली preovulatory चरण के लिए देर से preantral से व्यक्तिगत बरकरार डिम्बग्रंथि के रोम के विकास का समर्थन करता है; इस तकनीक का उपयोग, रोम व्यक्तिगत रूप से सुसंस्कृत, या जोड़ों 5,6 में किया जा सकता है। अंत में, हम बढ़ रही है और मौलिक डिम्बग्रंथि के रोम 7 के बीच बातचीत की जांच की अनुमति देता है कि एक विधि में पहले दो तकनीकों के संयोजन, एक सह संस्कृति प्रणाली का वर्णन।
व्यक्तिगत बरकरार डिम्बग्रंथि के रोम के संस्कृति के माध्यम से विश्लेषण कूप / अंडाशय हार्मोन उत्पादन की जांच की अनुमति देता है, जबकि कूप विकास, संस्कृति की अवधि के दौरान दैनिक कूप माप से निर्धारित किया जा करने की अनुमति देता है। इसके अलावा ऊतक विश्लेषण ऊतकीय / immunohistological विश्लेषण के लिए या उदाहरण प्राप्त करने के लिए बाद के प्रसंस्करण के लिए, संस्कृति के अंत में रोम या डिम्बग्रंथि ऊतक का एक संग्रह के द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैmRNA या प्रोटीन।
हम यहाँ भी केवल जल्द से जल्द कूप चरणों, व्यक्तिगत preantral डिम्बग्रंथि के रोम और दो ऊतकों के सह संस्कृतियों युक्त पूरे नवजात अंडाशय का उपयोग करते हुए, इन विट्रो में माउस डिम्बग्रंथि के रोम के विकास का समर्थन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि विभिन्न संस्कृति प्रणालियों का वर्णन है।
नवजात माउस अंडाशय की संस्कृति जल्दी डिम्बग्रंथि विकास, माध्यमिक कूप चरण के लिए विशेष रूप से कूप विकास दीक्षा का समर्थन करता है। नवजात चूहों की उम्र की एक श्रृंखला के हित के विकास के चरणों पर निर्भर करता है, इन संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंडाशय नवजात चूहों से प्राप्त कर रहे हैं, कूप गठन चल लेकिन अभी तक नहीं पूरा हो जाएगा: संस्कृति में कम से कम आंशिक रूप से कूप विकास द्वारा पीछा जारी रखा कूप गठन का समर्थन करेंगे। वैकल्पिक रूप से, उम्र के चार से पांच दिनों चारों ओर चूहों से अंडाशय के उपयोग के मौलिक और बढ़ती folli की एक बड़ी संख्या की संस्कृति में परिणाम (जिसके द्वारा समय कूप गठन के पहले से ही पूरा हो गया है)cles 12। यहाँ वर्णित विशिष्ट तकनीक का लाभकारी पहलुओं ऐसे सीरम के रूप में अपरिभाषित additives के उपयोग से परहेज है, केवल αMEM और बीएसए से मिलकर एक बहुत ही बुनियादी माध्यम में अधिक से अधिक ऊतक के oxygenation, और संस्कृति की अनुमति देते हैं, जो अस्थायी पॉली कार्बोनेट झिल्ली, का उपयोग शामिल है। पूरे अंडाशय की संस्कृति ऐसी सुसंस्कृत नवजात अंडाशय एक से कूप-granulosa सेल परिसरों के विच्छेदन के रूप में तकनीक में परिवर्तन, आवश्यकता के बाद के विकास के साथ, माध्यमिक कूप मंच से परे विकास का समर्थन करने के लिए प्रतीत नहीं होता।
कूप विकास के बाद के चरणों उनके तीन आयामी संरचना को बनाए रखने whilst संस्कृति में preovulatory चरण के लिए विकसित किया जा सकता है, जो व्यक्ति बरकरार देर पूर्व antral के रोम, बाहर विदारक द्वारा इन विट्रो में विकसित किया जा सकता है। विवो में होता है के रूप में इस संस्कृति तकनीक के लिए बरकरार रोम के उपयोग के विभिन्न कूपिक घटकों के बीच के रिश्ते को बनाए रखता है। थीसंस्कृति प्रणाली निषेचन और बाद में भ्रूण के विकास का समर्थन कर सकते हैं कि oocytes प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Fertilizable oocytes भी डिम्बाणुजनकोशिका-granulosa सेल परिसरों विट्रो एक में बड़े हो रहे हैं, जिसके दौरान एक दूसरे चरण के द्वारा पीछा यहाँ वर्णित के रूप में ज्यादा एक प्रारंभिक संस्कृति प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए माउस नवजात अंडाशय से प्राप्त किया जा सकता है। काफी बार आज इस्तेमाल अन्य प्रणालियों का समर्थन प्रदान करने के लिए इस तरह के alginate हाइड्रोजेल के रूप में एक सामग्री में समझाया गया है कि रोम या डिम्बग्रंथि ऊतक की संस्कृति, शामिल हैं (उदाहरण के लिए, देखते हैं, Tagler एट अल। 13)। विधि विकास का ध्यान ज्यादा अब मानव सहित प्रजातियों में से एक सीमा से मौलिक रोम से fertilisable oocytes प्राप्त करने के लिए लंबी अवधि के लक्ष्य के साथ, अंडाशय और बड़े स्तनधारियों के रोम के लिए संस्कृति तकनीक में सुधार है।
किसी भी एक समय में, स्तनधारी अंडाशय interactio साथ, विकास के चरणों की एक श्रृंखला में रोम होते हैंउनके विनियमन को प्रभावित करने के रोम के बीच एनएस। डिम्बग्रंथि समारोह के इस पहलू बुरा समझा जाता है और मुश्किल विवो में जांच करने के लिए। यहाँ वर्णित अंतिम विधि इन विट्रो में रोम के विभिन्न चरणों के विकास का समर्थन करने के लिए सह संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करता है। यदि आवश्यक हो, एक या दोनों के ऊतकों से पहले सह संस्कृति विवो में या इन विट्रो में पूर्व में इलाज किया जा सकता है। इस जैसे सह संस्कृति प्रणालियों से बढ़ कैसे उदाहरण के लिए, कूप-कूप बातचीत की जांच करने के लिए, जिसमें एक आदर्श तरीका प्रदान करते हैं, antral के रोम मौलिक कूप पूल प्रभावित है, मुश्किल साबित किया है कि डिम्बग्रंथि के जीव विज्ञान के पहलुओं को अब तक की जांच करने के लिए।
सावधान विच्छेदन आकस्मिक ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए आवश्यक है, हालांकि पूरे अंडाशय संस्कृति तकनीक, काफी स्पष्ट हैं। व्यक्ति के रोम के विच्छेदन सही स्तर पर रोम अंडाशय बरकरार और undamaged से बाहर विच्छेदित किया जा सकता से पहले दोहराया अभ्यास की आवश्यकता होती है एक विशेष तकनीक है। यह जटिल हैध्यान से व्यक्ति के रोम बाहर काटना, या विच्छेदन प्रोटोकॉल के दौरान निरंतर क्षति बाद में संस्कृति की अवधि के दौरान कूप मौत में परिणाम कर सकते हैं। टिशू कल्चर इलाज किया plasticware के लिए किया जाता है, तो रोम को जोड़ना होगा: रोम से microtiter प्लेटों के कुएं में सीधे कहाँ रखा है, यह प्लास्टिक पर thecal कोशिकाओं के नीचे चढ़ाना कम करने के लिए, केवल गैर टिशू कल्चर में इलाज प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है अच्छी तरह के आधार और टूटना रूप में वे विकास। सभी सह संस्कृति काम के लिए, ऊतकों सीधे एक दूसरे के साथ संपर्क में रखा जाना चाहिए।
कूप संस्कृति तकनीक में इस्तेमाल के लिए ऊपर विस्तृत मध्यम माउस सीरम के अलावा भी शामिल है। यह भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ माउस सीरम को बदलने के लिए संभव है, लेकिन बैच परीक्षण उपयुक्त स्रोतों की पहचान करने के लिए आवश्यक के साथ इस तरह सीरा की केवल सामयिक बैचों पूरी तरह से, preovulatory चरण के लिए कूप विकास का समर्थन करेंगे। FSH के बैच के परीक्षण के अंतर्राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के रूप में, यह भी सलाह दी जाती हैएफएसएच इन विट्रो में कूप विकास के लिए केवल कुदरती तौर सहसंबंधी मूल्यांकन किया है जिसके द्वारा टीएस। कूप टूटना नियमित संस्कृति की अवधि के दौरान होती है, तो एक ताजा बैच के साथ शेयर एस्कॉर्बिक एसिड की जगह पर विचार करें।
तकनीक, विदारक माइक्रोस्कोप और टिशू कल्चर इन्क्यूबेटरों के अलावा अन्य विशेष रूप से विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है एक लामिना का प्रवाह हुड और अच्छा बाँझ तकनीक का उपयोग डिम्बग्रंथि के रोम यहाँ वर्णित विधि के रूप में, एंटीबायोटिक दवाओं के अभाव में संवर्धित किया जा करने की अनुमति है। यह वे संस्कृति निम्नलिखित निषेचित किया जा रहे हैं, खासकर यदि oocytes पर एंटीबायोटिक दवाओं के किसी भी संभावित हानिकारक प्रभाव से बचने के लिए, सहायक हो सकता है। यह एक बाँझ वातावरण में काम करने के लिए संभव नहीं है, जहां यह विच्छेदन और संस्कृति मीडिया के लिए एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने के लिए सलाह दी जाती है।
The authors have nothing to disclose.
Work was funded by MRC grant G1002118.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L) |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
Mouse serum | – | – | Collected from cardiac puncture |
FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20°C. |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20°C. |
Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
Syringe filters (25mm, 0.2µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter: for filtering larger (> 5mls) volumes of medium. |
Syringe filters (13mm, 0.2µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter: for filtering smaller (< 5mls) volumes of medium |
Syringe filters (25mm, 0.45µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter: for filtering oil. |
Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
24 well plate | Greiner | 662160 | |
96 well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
96 well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0µm pore size |
Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33mm (29G) +1ml |
Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilise then warm before use |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use |
Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30mmx0.25 Type C | |
Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |