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Developmental Biology

Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

Published: March 17, 2015 doi: 10.3791/52458
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Centre for Integrative Physiology, University of Edinburgh, 2MRC Centre for Reproductive Health, University of Edinburgh

Summary

Este protocolo describe el cultivo primario / co-cultivo de tejido ovárico ratón, utilizando los ovarios de ratones recién nacidos y los folículos ováricos individuales de ratones prepúberes. Las técnicas de cultivo de apoyar el desarrollo de una manera altamente fisiológica, lo que permite la investigación del efecto de los agentes extrínsecos en el ovario, y de las interacciones entre los folículos ováricos.

Abstract

El ovario de los mamíferos está compuesto de los folículos ováricos, cada folículo que consta de un solo ovocito rodeado por células de la granulosa somáticas, encerrado juntos dentro de una membrana basal. Una piscina finito de folículos se establece durante el desarrollo embrionario, cuando los ovocitos en detención meiótica forman una estrecha asociación con las células de la granulosa aplanadas, formando folículos primordiales. Por nacimiento o poco después, los ovarios de mamíferos contienen la oferta de su vida de folículos primordiales, desde qué punto en adelante hay una liberación constante de folículos en el creciente piscina folicular.

El ovario es particularmente susceptibles al desarrollo in vitro, con folículos en crecimiento de una manera altamente fisiológica en cultivo. Este trabajo describe la cultura de ovarios neonatales enteras que contienen folículos primordiales, y la cultura de los folículos ováricos individuales, un método que puede apoyar el desarrollo de los folículos de un inmaduro hasta el preovumentación etapa, después de lo cual sus ovocitos son capaces de someterse a la fertilización in vitro. El trabajo descrito aquí utiliza sistemas de cultivo para determinar cómo el ovario se ve afectada por la exposición a compuestos externos. También se describe un sistema de co-cultivo, que permite la investigación de las interacciones que se producen entre los folículos en crecimiento y la no-creciente número de folículos primordiales.

Introduction

El ovario de mamífero se compone de suministro de por vida de una mujer de oocitos, cada uno contenido dentro de un folículo ovárico. Los folículos se forman antes del nacimiento en el reposo, la etapa primordial: una vez establecida la piscina folículo, hay un movimiento continuo y gradual de los folículos de la primordial en la piscina folículo en crecimiento. Como los folículos empiezan a crecer, se desarrollan a través de las etapas primarias, secundarias, preantral y luego antrales, hasta que alcancen el preovulatorio, o de Graaf, etapa. Solamente los ovocitos de folículos preovulatorios tienen competencia de desarrollo completo, capaz de apoyar el desarrollo embrionario a plazo, si fertilizado.

El ovario mucho tiempo se ha sabido para desarrollar de una manera altamente fisiológica in vitro. Esto es probable que sea debido a cada folículo ovárico que contiene en su interior las células necesarias para apoyar un ovocito de la etapa inmadura (momento en el que es incapaz de completar su división meiótica) a través de tque etapa de desarrollo competente (momento en el que puede apoyar plenamente la finalización de la meiosis, la fertilización y el desarrollo del embrión resultante a término).

La naturaleza fisiológica de desarrollo de ovario in vitro ha llevado a la amplia utilización de técnicas de cultivo de ovario. En consecuencia, los métodos in vitro se han utilizado para investigar la regulación del desarrollo de ovario, patología ovárica (por ejemplo la del síndrome de ovario poliquístico, síndrome de ovario poliquístico), el examen de cómo ovarios / ovocitos se ven afectados por la exposición a los productos químicos, y también con el objetivo práctico de la obtención de ovocitos fertilizables de folículos ováricos primordiales. Hasta la fecha, este último sólo se ha conseguido a través del ratón tejido ovárico 1, aunque las técnicas de cultivo utilizando los folículos de los grandes mamíferos, incluidos los humanos, han mejorado mucho en los últimos años 2,3.

Se describe aquí varios métodos de cultivo utilizando tejido ovárico ratón. La primera method utiliza enteros ovarios de ratones neonatales, y apoya la formación y el desarrollo temprano de los folículos primordiales 4. El segundo sistema soporta el crecimiento de los folículos ováricos individuales, intactos de finales del preantral a la fase preovulatoria; utilizando esta técnica, los folículos pueden ser cultivadas individualmente, o en parejas 5,6. Por último, se describe un sistema de co-cultivo, la combinación de las dos primeras técnicas en un método que permite la investigación de las interacciones entre el cultivo y los folículos ováricos primordiales 7.

Cultura de los folículos ováricos intactos individuales permite el crecimiento del folículo que se determinará a partir de mediciones del folículo diarios durante el período de cultivo, mientras que el análisis medio permite la investigación de folículo / producción hormonal del ovario. Otros análisis de tejidos pueden ser alcanzados por una colección de folículos o tejido ovárico en el extremo de la cultura, para los análisis histológicos / o inmunohistoquímico para su posterior procesamiento, por ejemplo, para obtenerARNm o proteínas.

Protocol

Todo el trabajo de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales bajo licencia por el Ministerio del Interior del Reino Unido (número de licencia del proyecto PPL 60/1726 y 60/4026).

Nota: animales Casa de conformidad con los requisitos legales del Reino Unido en una luz 14 horas y 10 horas oscuridad fotoperíodo. Realizar experimentos en animales utilizando ratones C57BL6J tipo salvaje, ratones Tau-GFP que tienen expresión ubicua de la proteína fluorescente verde (GFP) 8, y los ratones Thy1-YFP con la expresión ocasional de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en un subconjunto de células neuronales 9: ambas líneas transgénicas fueron criados en un fondo C57BL6J.

1. Condiciones de trabajo y elaboración de instrumentos

  1. Realizar toda la preparación de medios de comunicación, las disecciones de tejidos, y el trabajo de cultivo en una campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad: esto evita el requisito de la adición de antibióticos a los medios de comunicación.
  2. Permita siempre que los medios de comunicación / cultura placas / platos de embriones se equilibrendurante al menos 1 hora, en un horno de 37 ° C (medio de disección / platos de embrión) o 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora (medio y placas de cultivo), antes de su uso.
  3. Remojar pipetas de vidrio en solución al 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante alrededor de una hora y, a continuación dejar secar. Tire pipetas en la llama de un mechero Bunsen, doblando el cristal mientras lo hace, para producir pipetas de vidrio curvado finamente dibujados. Después se extrae la pipeta, hacer un corte limpio con un cortador de vidrio. Esterilizar horno a 160 ° C durante alrededor de 45 minutos.
    NOTA: Una tienda de estas pipetas de vidrio será necesario transferir los ovarios y los folículos.

2. Preparación de la disección y Medios de Cultivo

  1. Preparar Disección Medio.
    1. Disolver 3 mg / ml de BSA en medio Leibowitz L15 y esterilizar por filtración a través de un 0,2 micras de poro, filtro de 25 mm de diámetro.
  2. Neonatal Ovario Cultura.
    1. Para preparar el medio para el cultivo de ovario neonatal, hacer 1 ml de medio para each ovario que se cultivó. Disolver 3 mg / ml de BSA en-α Medio Esencial Mínimo (aMEM) y el filtro de esterilización de 0,2 micras a través de un poro, filtro de 13 mm de diámetro en un tubo estéril.
    2. Para preparar las placas para la cultura ovario neonatal, añadir 1 ml de medio de cultivo ovario neonatal en cada pocillo (un ovario por pocillo) de una placa de 24 pocillos. Con unas pinzas estériles relojero, coloque una membrana de policarbonato en la parte superior del medio en cada superficie bien, brillante hacia arriba. UV esterilizar las membranas antes de su uso.
  3. Folículo Cultura.
    1. Para preparar medio para el cultivo del folículo, los medios de comunicación esencial suplemento de α-mínimo con 1 UI / ml de la hormona estimulante del folículo humana recombinante, ácido ascórbico 5 g / ml y 5% v / v de suero obtenidas de ratones hembra adultos. Esterilizar por filtración a través de un 0,2 micras de poro, filtro de 13 mm de diámetro en un tubo estéril.
    2. Filtrar esterilizar aceite de silicio a través de un filtro de 0,45 micras de diámetro de poro, 25 mm, en un tubo estéril.
    3. Para preparar plates, coloque 30 gotas mu l de medio de cultivo de folículos en cada pocillo de una cultura no-tejido tratado de 96 pocillos de microtitulación placa de ida y así, utilizando sólo la fila superior de cada placa (para permitir que los folículos que se trasladaron a las nuevas filas cada día más el período de cultivo). Superponer cuidadosamente medio con 70 l de aceite de silicona esterilizado, para prevenir medio de la evaporación.
  4. -Folículo ovario Co-cultura.
    1. Preparar medio para-folículo del ovario de co-cultivo como para cultivo de folículos en el paso 2.3.1 anterior, lo que representa 1 ml de medio para cada co-cultivo-folículo del ovario está estableciendo.
    2. Para preparar las placas, añadir 1 ml de medio en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Con unas pinzas estériles relojero, coloque una membrana Nucleopore en la parte superior del medio en cada superficie bien, brillante hacia arriba. UV esterilizar las membranas antes de su uso.

3. Neonatal Ovario Disección y Cultura

  1. Colocar 1 ml de medio de disección en cada placa de embriones de vidrio estéril.
    2. <li> Cull crías de ratón neonatales de edades comprendidas entre 0 y postnatal día 5, el sacrificio por decapitación de acuerdo a las regulaciones del Reino Unido Home Office.
  2. Sujete la piel que cubre la pared abdominal con un par de pinzas de disección finas y hacer una gran incisión en la pared de la piel y el cuerpo. Abra la incisión para que todo el abdomen se expone. La vejiga se llena de sangre por lo general en esta etapa y puede ser perforado para hacer más fácil la disección.
  3. Mueva las tripas fuera del camino con unas pinzas relojero. Siga los cuernos uterinos de la vejiga al riñón a cada lado. El ovario se encuentra justo debajo del riñón en la parte superior del útero y aparecerá como una estructura similar a la nube con un microscopio de disección.
  4. Sujete el ovario suavemente con fórceps relojero, y usar las tijeras para cortar su conexión con el útero. Transferir el par de ovarios en platos de embriones que contienen medio disección pre-calentado.
  5. Realizar fina disección de ovarios bajo un microscopio de disección en un sta climatizadage (37 ° C). Use agujas de insulina para recortar el saco de la bursitis y cualquier exceso de material incluyendo la trompa de Falopio, hasta que sólo el ovario permanece.
  6. Transferir cada ovario en el pocillo de una placa de cultivo preparado en la etapa 2.2.2 anterior, usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado, uno de los ovarios en la parte superior de cada membrana (véase la Figura 1A). Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2.
  7. Cambiar el medio cada segundo día. Utilizar una pipeta para intercambiar el 50% del medio de cada pocillo para la pre-cámara de gas fresco medio: colocar la punta de la pipeta en el borde del pozo de medio para evitar molestar a la membrana.
  8. Mantener culturas para hasta 6 días.
  9. Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar los ovarios después de un breve lavado en PBS, según se requiera.
    1. Fijar ovarios en fijador de Bouin durante 90 min para el análisis histológico, o en 10% de formalina tamponada neutra durante 90 min para el análisis inmunohistoquímico. Snap congelar ovarios mediante la colocación de tejido enun tubo de polipropileno, colocando el tubo en hielo seco durante 5-10 minutos antes de la congelación a -70 ° C para su posterior extracción de proteína o mRNA.

4. folículo Disección y Cultura

  1. Cull 19-23 días de edad ratones hembra y aislar los ovarios. Humedezca la piel con etanol al 70% antes de hacer ninguna incisión. Pellizcar la piel con unas pinzas sin punta y hacer una incisión grande en el abdomen con tijeras de disección, penetrando a través de la piel y la pared del cuerpo.
  2. Mueva el intestino fuera del camino utilizando un conjunto más fino de los instrumentos de disección y localizar el útero. Siga el útero hasta el ovario que se encuentra por debajo de la de riñón en cada lado.
  3. Agarrando suavemente el ovario mediante un par de pinzas relojero, cortar los ovarios conexión con el útero con tijeras de disección finas. Evitar la recogida demasiado de la almohadilla de grasa de ovario. Recoge los ovarios y transferir a un embrión platos que contenían medio disección pre-calentado.
  4. Remover la bolsa ovárica utilizando agujas de insulina para recortar el saco de la bursitis y cualquier exceso de material incluyendo la trompa de Falopio, hasta que sólo el ovario permanece. Aproximadamente reducir a la mitad cada ovario usando agujas de insulina.
  5. Transfiera cuidadosamente cada ovario-media en un vidrio de reloj individual que contiene 1 ml de medio de disección. Cubrir cada vidrio de reloj con un portaobjetos de vidrio para evitar la evaporación del medio y para asegurar la esterilidad.
  6. Vidrios de reloj tienda que contienen mitades de ovario en un horno de 37 ° C hasta que sea necesario, pero llevar a cabo el siguiente paso disección tan pronto como sea posible. Deseche tejido almacenado de esta manera por más de una hora.
  7. Vidrio de reloj de transferencia que contiene un medio de ovario a una platina de microscopio calentado 37 ° C en una campana de flujo laminar. Aproximadamente diseccionar ovario en grandes piezas con dos agujas de insulina, a fin de identificar finales de los folículos pre-antrales como sigue: éstos contendrán 2-3 capas de células de la granulosa y tienen un diámetro de alrededor de 180-200 micras.
  8. Diseccionar manualmente cualquier ifolículos dentified utilizando una aguja de insulina y una de 30 x 0,25 mm aguja de acupuntura que ha sido asegurada en un soporte de la aguja. Tenga cuidado de eliminar la mayor parte del estroma circundante, pero no dañar la lámina basal de los folículos (véase la Figura 1B).
  9. Utilice una pipeta de vidrio curvo finamente elaborado para transferir cuidadosamente folículos disecados en un vidrio de reloj que contiene medio de la recolección de la disección pre-calentado. Tenga cuidado de mantener los folículos dentro de la sección de calibre fino de pipeta para evitar la pérdida de los folículos.
  10. Folículos Medir con precisión utilizando una retícula ocular calibrado montado en un microscopio de disección.
  11. Seleccione folículos para la cultura sólo si miden 190 ± 10 m de diámetro. Además seleccionar solamente, folículos esféricos saludables para la cultura; estos serán translúcido, sin zonas oscuras atretic, y tienen una lámina basal intacta, junto con parte del tejido tecal adjunto: descartar los folículos que no encajan en esta descripción. Un rendimiento de entre 10-15 folículos por ovario es bueno.
  12. Usar una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado para transferir un único folículo en el pocillo de una placa hecha como en el paso 2.3.3 anteriormente. Colocar con cuidado el folículo en el fondo del pozo (y no en la capa de aceite superior). Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2.
  13. Folículos de cultivo para hasta 6 días, moviendo los folículos en un medio fresco que contiene así todos los días.
    1. Preparar la siguiente fila en la placa de 96 así como en la preparación de la placa en el paso 2.3.3. Placa de retorno a la incubadora durante al menos una hora, para permitir el equilibrio. Traslado folículos en los pozos frescas de medio, con una pipeta de vidrio finamente dibujado.
    2. Si en cualquier punto en la cultura folículos se deben dejar durante dos días antes de pasar a medio fresco, colocar cada folículo en un mínimo de 60 l (en lugar de 30 l) gotas de medio de cultivo folículo.
  14. Para recoger datos sobre el crecimiento del folículo, medir los folículos diario, utilizando un eyretícula epiece montado en un microscopio de disección. La capa de aceite distorsionará mediciones del diámetro del folículo, así calcular el coeficiente de calibración para la puesta a punto.
  15. Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar el tejido para su posterior análisis, como en el paso por encima de 3,10.
  16. Folículo folículo Co-cultura.
    1. Cultura dos folículos juntos, para investigar las interacciones entre los folículos. Cultura como anteriormente, pero el lugar dos folículos de lado a lado, en contacto, en un pozo.
    2. Coloque 100 l gotas de medio de cultivo de folículos en cada pocillo de una cultura no tejido tratado de microtitulación de 96 pocillos de placa plana así, superponiendo medio con 100 l de aceite de silicona esterilizado. No transferir los folículos en los pocillos frescos como en el paso por encima de 4,13, pero en lugar de utilizar una punta fina de gel para cambiar 50% del medio cada dos días.
    3. Con el fin de identificar los orígenes de tejido dentro de la co-cultivo, de co-cultivo folículos cada uno de una fuente genética diferente, por ejemplo one desde el ovario de un ratón de tipo salvaje, y el otro desde el ovario de un ratón con expresión ubicua de GFP. Si el uso de GFP o tejido YFP, minimizar la exposición del tejido a la luz tanto como sea posible, durante el cultivo, ya través de los pasos de fijación / procesamiento a partir de entonces.
      NOTA: Es normal que los dos folículos crezcan juntos en una sola unidad de dos folículo '(ver Figura 1 C).

5. Co-culturas-folículo del ovario

  1. Disecar los ovarios y los folículos fuera como en las secciones 3 y 4 anteriores.
  2. Coloque un ovario neonatal en la parte superior de una membrana, en una placa preparada como en el paso 2.4.2 anteriormente. Con cuidado, coloque un único folículo en contacto con uno de los polos del ovario neonatal, usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado. Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2 durante un máximo de 5 días.
  3. Con el fin de distinguir entre el origen del tejido dentro del co-cultivo, utilizar los ovarios y los folículos de dos diferentes asíURCES, por ejemplo, uno de un tipo de ratón salvaje, y otro de un ratón con expresión ubicua de las buenas prácticas agrarias.
  4. Reemplazar 500 l de medio diario como en el paso 3.8 anterior, pero utilizando medio de cultivo folículo. Durante la co-cultura, el folículo menudo queda encapsulado por el ovario (Figura 1D).
  5. Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar el tejido para su posterior análisis, como en el paso por encima de 3,10.

6. Fijación, inmunocitoquímica e Imagen de tejido cultivado

  1. Al final del cultivo, el lavado de tejidos en PBS y transferir a 100 l (folículo) o 1 ml (ovario) de 10% de formalina tamponada neutra, y fijar, por 1 hora en hielo. Moverse a través de 3 lavados de 1x PBS a 4 ° C.
  2. Para inmunocitoquímica sobre los folículos, la transferencia entre los pocillos de una placa de microtitulación de ida y bien 96 pocillos usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado, conteniendo cada pocillo diferentes lavados o tratamientos.
  3. Por inmunocitoquímica en OvariEs (o co-cultivos-ovario folículo), incrustar en el 4% en gel de agarosa y la sección a 50 micras utilizando un vibrotomo. Secciones flotar en los pocillos de una placa de 24 pocillos para aplicar lavados o tratamientos, la eliminación con una pipeta.
  4. Para imágenes: transferir secciones de agarosa a portaobjetos de vidrio plano y montar con medio de montaje; o folículos de transferencia (o complejos folículo folículo) a portaobjetos de vidrio de la cavidad y se montan con que no se endurezca medio de montaje. Especímenes de imagen utilizando un microscopio confocal.

Representative Results

La Figura 1 muestra imágenes de los ovarios y los folículos en el inicio de, y durante, los procedimientos de cultivo.

La Figura 2 muestra los resultados representativos de ovarios neonatales (en este caso, los ovarios de las crías recién nacidas) expuestos a tóxicos para la reproducción durante el cultivo. Ovarios neonatales se cultivaron durante 6 días, y expuestos a un fármaco de quimioterapia, cisplatino o doxorrubicina, en el Día 2 de la cultura. Al final del cultivo, los ovarios se fijaron, se procesaron para histología, y los ovarios examinaron a continuación para determinar el número de folículos ováricos saludables y no saludables 4. Como alternativa, una evaluación más rápida de folículos en crecimiento tempranas se puede obtener de la cultura de fragmentos de ovario, utilizando ovarios de un ratón que expresan un marcador fluorescente-ovocito específicos 10.

Durante el cultivo de folículos individuales, el crecimiento del folículo puede ser fácilmente comprobado por mediciones diarias durante el callejóntura período. La figura 3 muestra los resultados representativos del crecimiento de los folículos cultivadas en presencia o ausencia de las hormonas gonadotropinas hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH) 5.

Folículo folículo o folículo del ovario de co-cultivo se pueden utilizar para investigar las interacciones entre folículos. Dependiendo del tejido y el procesamiento, las imágenes se pueden obtener usando de campo brillante, fluorescencia o microscopios confocales. La Figura 4 muestra resultados representativos de imágenes de tales co-cultivos, el examen de diversos tipos de células implicados en la comunicación del folículo folículo, incluyendo las células endoteliales y neuronales 7.

Figura 1
Figura 1: (A) Microfotografía de un ovario neonatal obtenido de un ratón en el día de nacimiento, colocado en una membrana de policarbonato. (B) Fotomicrografía de recién disecados folículo ovárico sano, con la mayor parte del tejido estromal que rodea disecados fuera. (C) Las microfotografías de co-cultivo de dos folículos ováricos durante los tres primeros días de cultivo, mostrando el estrecho contacto que se establece entre los dos folículos medida que avanza la cultura (Ci: primer día de la cultura; Cii: segundo día de la cultura; Ciii : tercer día de la cultura). Reproducido de Spears et al. 11 (D) Microfotografía de co-cultivadas folículo preantral y ovario neonatal después de dos días de cultivo. La imagen muestra el folículo quedar encapsulada por el ovario. La flecha muestra folículo preantral. Imagen del Dr. Federica Lopes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Efecto de los fármacos de quimioterapia cisplatino y doxorrubicina en ovarios cultivadas neonatales cisplatino y doxorrubicina ambos conducen a la pérdida de la salud del folículo y una reducción del número de folículos.. El cisplatino (A); (B) La doxorrubicina: (i) Porcentaje de los folículos no saludables (borrar); y (ii) el número total de folículos (sombreado) en cada ovario. Bares denotan media + SEM; n = 5 para todos los grupos, estrellas denotan diferencias significativas con respecto al control (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Reproducido de Morgan et al. 4

Figura 3
Figura 3:. Valores Tasas de crecimiento de los folículos expuestos a diferentes ambientes de gonadotrofina son media ± SEM (n ≥16 para cada grupo). La flecha indica el inicio de antrosl la formación en todos los grupos de gonadotrofina. Reproducido de Murray et al. 5

Figura 4
Figura 4: Imágenes del folículo folículo y ovario folículo-co-culturas, mostrando interacciones folículo folículo (A) micrografía confocal de una proteína fluorescente verde (GFP) folículo y una de tipo salvaje (WT) folículo después de co-cultivo (. expresión de GFP se muestra aquí en blanco), con procesos desde el folículo GFP se muestra que se extiende sobre el folículo WT. (B) de la sección transversal a través de un GFP / WT complejo folículo siguiente co-cultivo, mostrando que los procesos de GFP (verde) de la mentira folículo colindante adyacente a la lámina basal del folículo WT. (C) Neonatal WT ovario tras el cultivo con una expresión de GFP-folículo, que muestra que las células GFP y procesos celulares (verde) pre-antral han migradoa través del intersticio de ovario del ovario neonatal. (D) GFP / WT complejo folículo que contiene células endoteliales, que se muestra por la expresión de CD31 marcador de células endoteliales (rojo). (E) GFP / complejo folículo WT contiene células neuronales, que se muestra por la expresión del marcador neuronal beta tubulina III (ver aquí como el rojo o el amarillo si de doble etiquetado con GFP, verde). Complejo folículo (F) YFP / WT, donde YFP se refiere a folículo de un ratón Thy1-YFP que tiene expresión ocasional de la proteína fluorescente amarilla (YFP: amarillo) en un subconjunto de células neuronales 9, que muestra que las neuronas se extienden desde el folículo YFP. Bares 50 micras (A, B, D), 100 m (C, E, F), 100 micras (inserto en A), 10 micras (recuadro en C), 15 micras (inserción en D). Reproducido de Campbell et al. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Se describe aquí diferentes sistemas de cultivo que pueden ser utilizados para apoyar el desarrollo de los folículos ováricos de ratón in vitro, utilizando ovarios neonatales enteras que contienen sólo las etapas más tempranas del folículo, folículos ováricos preantrales individuales y también co-culturas de los dos tejidos.

Cultura de ovarios ratón neonatal apoya el desarrollo ovárico precoz, la iniciación de crecimiento particularmente folículo hasta la etapa de folículo secundario. Una gama de edades de ratones recién nacidos se puede utilizar para estos cultivos, dependiendo de las etapas de desarrollo de interés. Si los ovarios se obtienen de ratones recién nacidos, la formación del folículo se pondrán en marcha, pero aún no se completa: cultura apoyará al menos parcialmente, la formación continua folículo seguido por el crecimiento del folículo. Alternativamente, el uso de los ovarios de ratones alrededor de cuatro a cinco días de edad (por el cual la formación del folículo tiempo ya está completo) resulta en la cultura de un mayor número de Folli primordial y crecienteculos 12. Aspectos beneficiosos de la técnica específica descrita aquí incluyen el uso de membranas de policarbonato flotantes, que permiten una mayor oxigenación del tejido, y cultivo en un medio muy básico que consta de sólo aMEM y BSA, evitando el uso de aditivos no definidos tales como el suero. Cultura de toda ovarios no parece apoyar el desarrollo más allá de la etapa de folículo secundario, con el desarrollo posterior que requiere un cambio en la técnica, tales como la disección de los complejos de células de la granulosa del folículo del ovario neonatal cultivaron 1.

Las etapas posteriores de desarrollo del folículo se pueden desarrollar in vitro mediante la disección a cabo individual, finales de los folículos antrales pre-intactas, que se puede cultivar a la fase preovulatoria en cultivo, mientras que el mantenimiento de su estructura tridimensional. El uso de los folículos intactos para esta técnica de cultivo mantiene la relación entre los diferentes componentes foliculares como ocurre in vivo. This sistema de cultivo puede ser utilizado para obtener ovocitos que pueden apoyar la fecundación y el desarrollo embrionario posterior.

Ovocitos fertilizables también se pueden obtener a partir de ovarios de ratones neonatales usando un protocolo de cultivo inicial mucho como se describe aquí, seguido de una segunda etapa durante la cual los complejos ovocito y las células de la granulosa se ​​cultivan in vitro 1. Otros sistemas utilizados con bastante frecuencia hoy en día incluyen el cultivo de folículos o tejido ovárico que ha sido encapsulados en un material tal como hidrogel de alginato, para proporcionar apoyo (véase, por ejemplo, Tagler et al. 13). Gran parte de la atención del desarrollo del método ahora es mejorar las técnicas de cultivo para los ovarios y los folículos de los mamíferos más grandes, con el objetivo a largo plazo de la obtención de los ovocitos de folículos primordiales fecundables a partir de una variedad de especies, incluyendo los seres humanos.

En cualquier momento, los ovarios de mamíferos contienen folículos en una gama de etapas de desarrollo, con Interactions entre folículos que afectan a su regulación. Este aspecto de la función ovárica es poco conocida y difícil de examinar in vivo. El último método descrito aquí utiliza sistemas de co-cultivo para apoyar el desarrollo de las diferentes etapas de folículos in vitro. Si es necesario, uno o ambos tejidos pueden ser tratados previamente para co-cultivo antes in vivo o in vitro. Sistemas de co-cultivo como éste ofrecen una forma ideal para examinar las interacciones folículo folículo, por ejemplo, cómo cada vez mayor, los folículos antrales afectan a la piscina folículo primordial, aspectos de la biología de ovario que han demostrado ser difíciles de examinar hasta ahora.

Las técnicas de cultivo de ovario de enteros son bastante sencillo, aunque se requiere disección cuidadosa para evitar daños en los tejidos accidental. Disección de los folículos individuales es una técnica especializada, que requiere práctica repetida antes de folículos en la fase de derecho pueden diseccionaron del ovario intacto y sin daños. Es críticoa diseccionar los folículos individuales con cuidado, o daños sufridos durante el protocolo de disección puede provocar la muerte del folículo durante el período de cultivo posterior. Cuando los folículos se colocan directamente en el pocillo de placas de microtitulación, es importante usar sólo plásticos cultura no tejido tratado, para minimizar chapado abajo de las células tecales en los plásticos: si se utiliza material de plástico tratado de cultivo de tejido, los folículos se adherirá a las base del pocillo y ruptura a medida que crecen. Para todos los trabajos de co-cultivo, los tejidos deben ser colocados directamente en contacto uno con el otro.

El medio se detalla anteriormente para uso en la técnica de cultivo del folículo incluye la adición de suero de ratón. Es posible sustituir el suero de ratón con suero bovino fetal, pero sólo los lotes ocasionales de tales sueros apoyará plenamente el desarrollo del folículo a la fase preovulatoria, con lotes de prueba necesaria para identificar fuentes adecuadas. Batch-prueba de FSH también es recomendable, ya que el Uni Internacionalts por el cual la FSH se evalúa correlato sólo crudamente al crecimiento del folículo in vitro. Si la ruptura del folículo se produce habitualmente durante el período de cultivo, considerar la sustitución de ácido ascórbico Stock con un nuevo lote.

Las técnicas no requieren equipo especializado particularmente distinta de microscopios de disección e incubadoras de cultivo de tejidos, aunque el uso de una campana de flujo laminar y una buena técnica estéril permite que los folículos ováricos que se cultivaron en ausencia de antibióticos, como en los métodos descritos aquí. Esto puede ser útil, para evitar cualquier potencial efecto perjudicial de los antibióticos en los ovocitos, particularmente si son para ser fertilizado después del cultivo. Cuando no sea posible trabajar en un ambiente estéril, es aconsejable añadir antibióticos a los medios de disección y la cultura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibowitz L15 Invitrogen 11415049
αMEM Invitrogen 22571020 Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L)
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A9418 For dissection medium
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3311 For culture medium
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A2153 For coating glass pipettes
Mouse serum - - Collected from cardiac puncture
FSH Merck Serono Gonal F Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C.
Ascorbic acid Sigma Aldrich A4034 Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C.
Silicon oil VWR 630064V Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS
Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) Greiner 16532K Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium.
Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) Iwaki 3032-013 Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium
Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) Iwaki 2053-025 Cellulose acetate filter for filtering oil.
Sterile tubes Greiner 187261
24-well plate Greiner 662160
96-well round bottom plate Iwaki 3875-096 Use only non-tissue culture treated plates
96-well flat bottomed well Iwaki 3860-096 Use only non-tissue culture treated plates
Whatman nucleopore membranes Camlab WN/110414 Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size
Insulin needles BD medical supplies 037-7606 0.33 mm (29 G) + 1 ml
Glass embryo dishes VWR 720-0579 Sterilize, then warm before use.
Glass pipettes Fisher Scientific 10209381 BSA coated before use.
Gel tips AlphaLabs LW1103
Acupuncture needles Acumedic LTD 30 mm x 0.25 Type C
Bouin’s fixative Sigma Aldrich HT10132-1L
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT5014-120ml
1.5 ml polypropylene tubes Greiner BioOne 616201

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References

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Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. J. Vis. Exp. (97), e52458, doi:10.3791/52458 (2015).

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