在斑马鱼胚胎的机械血管损伤

Published: February 17, 2015 doi: 10.3791/52460

Hilary Clay¹, Shaun R. Coughlin¹

¹Cardiovascular Research Institute, University of California

Protocol

注：使用斑马鱼的程序批准了加州大学旧金山分校的机构动物护理和使用委员会。

1.准备工具

将细节针入针座，钳制引脚。
用细尖镊子，小心翼翼地弯针的针尖创建一个轻微的钩子。
对于操作和伤害在胚胎稳定，弯曲28瓜哥½英寸针安装在使用尖嘴钳胰岛素注射器的结束。

2.准备斑马鱼胚胎的损伤

成立了斑马鱼的繁殖对收集的鸡蛋水（60ug / mL的水族馆盐）蛋之前²²所示。
添加0.003％N-苯基硫脲（PTU）的蛋水时的胚胎是大约8小时受精后（HPF），以防止黑化。
Dechorionate2天受精后（DPF）用细尖镊子胚胎实验之前。
麻醉用0.02％缓冲的3-氨基苯甲酸（三卡因）之前的操作约10分钟的胚胎。

3.机械船舶胚胎损伤

麻醉转移胚胎到抑郁症的幻灯片上用移液管解剖体视显微镜。
使用注射器针头的短边平来操纵与优势手的胚胎，朝向远离针腹面定位在其一侧的胚胎。
定位销细节与尖端直接指向对鱼后方泌尿生殖开口的腹面。定位销细节以一个很小的角度，使得所述弯曲端部能够通过周皮直接刺穿入尾静脉（ 图1 </ STRONG>）。
使用注射器针头操纵胚胎，通过敲击胚胎成销稍微钩销插入静脉刺穿尾静脉用细节销。
用注射器针头，拉胚离细节引脚创建一个小的撕裂血管。
注：一个成功的损伤将导致从静脉直接出血。

止血4.分析

有明显的循环血细胞在此过程中只选择胚胎。
准备只要细节销从容器拉出开始定时器。
只要血液损失可以从伤口被可视启动定时器。当从伤口失血停止，停止计时和总时间记录为出血时间。如果凝固被抑制，记录时间到时不再有明显的循环血液细胞。

伤口愈合5.分析

传输POST-伤害动物到玻璃底菜成像显微镜。
去除大部分的鸡蛋水。
覆盖在0.3-1.2％低熔点胚胎琼脂糖溶解在蛋水，加热至42之间和45ºC和补充有0.02％三卡因。
位置的胚胎在使用镊子身体两侧。
琼脂糖冷却后，装满鸡蛋的水0.02％三卡因的菜。
通过收购明，落射荧光或共聚焦显微镜图像。
使用镊子从琼脂糖取出胚胎，并传回的鸡蛋水。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

机械血管损伤2进行DPF胚胎（ 图2A - C）。损伤产生快速和可靠的电凝反应如通过时间测量以停止出血（ 图2D）的。以确定是否在凝固反应差异可以测量，抗凝血剂水蛭素施用给胚胎注射入居维叶的管道伤人（NL每微升水蛭素溶解在水中1单元5-10）之前立即（对于示范注射到居维叶的管道中，看到以前的朱庇特的第²³条^）24。水蛭素的前损伤导致给药显著增加出血时间与车辆控制（ 图2D）。

的血管损伤和凝血证据可以看出使用内皮转基因品系立即后损伤（kdrl：EGFP）和红细胞（gata1a：红色荧光蛋白 25,26。图像被顺次获取的，每5分钟，使用表面荧光一个12小时的时期。代表性静止图像显示在整个创伤修复（ 图3）的不同阶段。使用微分干涉对比（DIC）和荧光显微镜的组合，因此能够测量创伤修复截然不同的参数。为了确定伤口修复是否遵循横过实验可再现的模式，以重新建立血流时间测定4组的鱼。血管损伤导致血流的重建通过受伤容器的可靠的定型的253±16分钟反应（每组n = 4-5实验鱼，平均±SEM）。

图1：2 DPF胚胎图显示细节针安置PERF orming尾静脉（CV）的机械性损伤，血管车厢的灰色阴影。

图2：出血时间可以机械性损伤后进行目视测定剧照从斑马鱼血管损伤的实时视频2旦的胚胎。图像显示在损伤（A）的时间，在此期间从伤口（B）积极失血，并停止失血（C）之后。表明所有的时间都在秒。胚胎与前在面对左顶部和腹面横向取向。比例尺为100μm。抗凝剂水蛭素的施用导致出血时间与载体对照（D）的 （P <0.0001，学生t检验），以显著增加。PG“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

（：EGFP kdrl）和红血细胞（gata1a：红色荧光蛋白 ）的2旦胚胎：图3。使用标记为血管内皮血管损伤后的可视化使用的转基因标志物的机械性损伤和修复剧照从慢速拍摄DIC和荧光显微镜。图像显示，血管和当地的红血细胞聚集（T = 25），部分修复与重新建立血流量（T = 210），与正常血管结构（T = 615）显然完全恢复的差距。时间显示在分钟。胚胎与前在面对左顶部和腹面横向取向。 *表示背主动脉的位置。受伤（箭头）打乱了尾静脉和尾丛的组成部分。规模酒吧25微米。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

斑马鱼已经成功地使用的一种模式的不同类型的伤口，包括激光损伤^13-15，激光诱导的血栓¹⁶和上皮伤人^10。我们报告机械损伤的方法，该方法是简单的执行，并在体内模型中是高度适合于实时显微镜产生一个受控的损伤。损伤产生快速和可测量的止血反应并且可以使用视频和缩时显微术来监测一个重现的伤口修复程序。

其简单和刻板血管解剖，这允许在定义的和微观上可访问的网站可再现损伤，且最血管和造血细胞类型的存在使斑马鱼的胚胎用于研究响应损伤是特别有用的。然而，斑马鱼胚胎没有在开发过程中^5,6的第一周淋巴细胞的功能，使得该系统最APpropriate用于研究天然免疫的在炎症和修复的贡献。目前，各种各样的转基因斑马鱼与标记为参与血栓形成，凝固，炎症和伤口修复，包括标记血小板，纤维蛋白原，红细胞，白细胞和血管内皮系细胞和蛋白质存在^{17,21,25- 31。}这些和其它工具应该使人们有可能跟随参与止血和修复中显著详细流程。

机械性损伤补充激光损伤止血的斑马鱼的研究。而激光诱导损伤已经使用多年触发血栓形成在斑马鱼胚胎和小鼠模型，通过该激光损伤触发凝血和血小板/血小板活化不充分已知^16,32的机制。机械性损伤提供了有关生理的方法，通过血管违反诱发凝血，据推测，组织因子依赖性凝血级联的开始。这一发现，水蛭素治疗显著损伤后出血时间增加表明，这种模式是凝血酶依赖。机械性损伤，提供血管的破坏足以提供一个机会，跟随船只维修还补充激光伤害。以前的研究已经成功地使用机械损伤手术刀切开针头穿刺显示出血时间在药理和遗传操纵^19,33的条件的差异。在当前的模型中使用的细节销损伤可由由于它产生伤口的小和定义的大小，并通过提供一个机会，以更好地研究血管再通和维修提供一个更可再现的损伤补充其他损伤模型。

上皮伤人的斑马鱼已被证明是一个强大的模型用于研究炎症和创伤修复^10。的能力，以引入血管损伤提供了一个机会，以评估设置里的纤维蛋白提供了一个临时矩阵，血栓和杂物被清除修复更为复杂的伤口，和血管再生。作为这些方法中参与正常组织修复和在急性和慢性炎症及血管病理学，这种方法应该有助于人类疾病的各个方面进行建模的系统中，其中的细胞行为可以实时地在整个的动物模型来监测。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minutia Pins	Fine Science Tools	26002-10	Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass Depression Slide	Aquatic Eco-Systems	M30
Low Melting Agarose	Lonza	50081	Preheated to 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	Sigma Aldrich	H7016
Glass bottom imaging dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C
Dissecting microscope	Olympus	SZH10
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer
Aquarium salts	Instant Ocean
Insulin syringe with 28.5 G needle	Becton Dickinson	329461