Protocol
OPMERKING: De procedures met behulp van zebravis werden goedgekeurd door UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van Gereedschap
- Steek minutia pin in een penhouder en klem de pin.
- Met behulp van fijne punt tang, buig de punt van de pen om een lichte haak te creëren.
- Voor manipulatie en stabilisatie van het embryo tijdens blessure, buig het einde van een 28 gauge ½ inch naald gemonteerd op een insulinespuit behulp punttang.
2. Voorbereiding van de zebravis embryo's voor letsel
- Opgezet zebravis broedparen en het verzamelen van eieren in ei water (60ug / ml aquarium zouten) zoals eerder 22 getoond.
- Voeg 0,003% N-fenylthioureum (PTU) om het ei water wanneer de embryo's zijn ongeveer 8 uur na de bevruchting (HPF) om melanisatie voorkomen.
- Dechorionate twee dagen na de bevruchting (DPF) embryo's voorafgaand aan het experiment met behulp van fijne punt tang.
- Verdoven het embryo met 0,02% gebufferde 3-aminobenzoëzuur (tricaïne) ongeveer 10 min voor manipulaties.
3. mechanische Vessel Letsel van embryo's
- Transfer narcose embryo's tot een depressie dia op een dissectie stereomicroscoop met behulp van een transfer pipet.
- Met behulp van de korte platte kant van de naald naar het embryo met de dominante hand te manipuleren, de positie van de embryo op zijn kant met het ventrale oppervlak afgekeerd van de naald.
- Plaats de munitia pin met de tip wees direct tegen het ventrale oppervlak van de vis posterior naar de urogenitale opening. Plaats de minutia pen onder een lichte hoek zodat de gebogen tip rechtstreeks kan doorboren de periderm in de staartader (figuur 1 </ Strong>).
- Met behulp van de naald aan het embryo te manipuleren, doorboren de caudale ader met de minutia pin door het embryo te tikken in de pen om iets te haken de pin in de ader.
- Met behulp van de naald, trek het embryo uit de buurt van de minutia pin om een klein scheurtje in het vat te maken.
OPMERKING: Een succesvolle letsel zal leiden tot onmiddellijke bloeden uit de ader.
4. Analyse van Hemostasis
- Kies alleen embryo's met zichtbaar circulerende bloedcellen voor deze procedure.
- Bereid de timer zodra de minutiae pen wordt getrokken uit het vat begint.
- Start de timer zodra bloedverlies gevisualiseerd worden uit de wond. Wanneer bloedverlies uit de wond ophoudt, stopt de timer en noteer de totale tijd als Bloeden Time. Als coagulatie wordt geremd, om de tijd wanneer er niet langer zichtbaar circulerende bloedcellen.
5. Analyse van de Wound Healing
- Transfer post-letsel dieren op glazen bodem beeldvorming gerechten voor microscopie.
- Verwijder het merendeel van het ei water.
- Bedek de embryo's in 0,3-1,2% laag smeltpunt agarose opgelost in ei water, verwarmd tot tussen de 42 en 45 ºC en aangevuld met 0,02% tricaïne.
- Plaats embryo op hun kant behulp van een tang.
- Na de agarose afkoelt, vul de schaal met 0,02% tricaïne in ei water.
- Verwerven van beelden met behulp van helderveld, epifluorescentie of confocale microscopie.
- Verwijder embryo uit de agarose behulp van een tang en transfer terug naar ei water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mechanische vaatletsel werd uitgevoerd op 2 dpf embryo (Figuur 2A - C). Letsel leidt tot een snelle en betrouwbare coagulatie respons, zoals gemeten door de tijd om het stoppen bloedingen (figuur 2D). Om te bepalen of verschillen in de coagulatie reactie meetbaar is het antistollingsmiddel hirudine toegediend aan het embryo door injectie in het kanaal van Cuvier onmiddellijk voor verwonding (5-10 nl van 1 eenheid per pl hirudine opgelost in water) (voor demonstratie van injecties in de Duct van Cuvier, zie vorige Jove artikel 23) 24. De toediening van hirudine voorafgaand aan de verwondingen resulteerden in een significant verhoogd bloedingsrisico tijden versus controle over het voertuig (figuur 2D).
Bewijs van schade schip en coagulatie kan gezien worden onmiddellijk na het letsel met behulp van transgene lijnen voor endotheel (kdrl: EGFP) en rode bloedcellen (gata1a: DsRed 25,26. Beelden werden achtereenvolgens verworven om de 5 min voor een 12 uur periode met behulp van epifluorescente. Representatieve foto getoond gedurende verschillende stadia van wondgenezing (figuur 3). Met een combinatie van differentiële interferentie contrast (DIC) en fluorescentie microscopie, is het mogelijk om verschillende parameters van wondheling meten. Om te bepalen of wondherstel volgde een reproduceerbaar patroon over experimenten, de tijd hersteld bloedstroom werd gemeten in 4 groepen van vis. Vaatletsel resulteerde in een betrouwbare stereotiepe reactie van 253 ± 16 min tot het herstel van de bloedstroom door de verwonde vat (n = 4-5 vis per experiment, gemiddelde ± SEM).
Figuur 1: Schematische weergave van 2 dpf embryo waaruit plaatsing van munitia pin voor perf orming mechanische beschadiging van de caudale ader (CV). Vasculaire compartiment is grijs gearceerd.
Figuur 2: Bloeden keer kan visueel worden gemeten na mechanische verwonding Stills van real-time video van de zebravis schip letsel op 2 dpf embryo's.. Beelden worden weergegeven op het moment van verwonding (A), bij actieve bloedverlies uit de wond (B), en na beëindiging van bloedverlies (C). Alle aangegeven tijden zijn in seconden. Embryo's worden lateraal georiënteerd met anterior boven en ventrale oppervlak gericht naar links. Schaalbalk 100 micrometer. Toediening van het antistollingsmiddel hirudine tot bloedingstijden versus vehikel controle (D) (p <0,0001, Student's t-test) aanzienlijk toegenomen.pg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3:. Het visualiseren van mechanische schade en reparatie met behulp van transgene markers Stills uit timelapse DIC en fluorescentie microscopie na vatverwonding behulp van markers voor vasculaire endotheel (kdrl: EGFP) en rode bloedcellen (gata1a: DsRed) in 2 dpf embryo's. Beelden toonden een gat in schepen en lokale rode bloedcel ophoping (t = 25), gedeeltelijk herstel met heropgerichte bloedstroom (t = 210), en blijkbaar volledig herstel van de normale vat structuur (t = 615). Tijd wordt aangegeven in minuten. Embryo's worden lateraal georiënteerd met anterior boven en ventrale oppervlak gericht naar links. * Geeft de positie van de dorsale aorta. De blessure (pijlpunt) verstoorde de caudale ader en van de staartvin plexus. Schaalbar 25 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravis zijn met succes gebruikt als model voor verschillende soorten wonden waaronder laser verwonding 13-15, laser geïnduceerde trombose 16 en epitheliale 10 verwonden. Wij rapporteren een methode mechanische verwonding die eenvoudig uit te voeren en geeft een gecontroleerde letsel bij een in vivo model dat zeer vatbaar realtime microscopie. Letsel heeft een snelle en meetbare hemostatische reactie en reproduceerbare wondherstel programma dat kan worden gevolgd met video en timelapse microscopie.
De eenvoudige en stereotype vasculaire anatomie, die reproduceerbaar letsel bij een bepaalde en microscopisch toegankelijke plaats maakt, en de aanwezigheid van de meeste vasculaire en hematopoëtische celtypen maken zebravisembryo bijzonder nuttig voor het bestuderen op schadelijke stimuli. Echter, zebravis embryo geen functionele lymfocyten tijdens de eerste weken van de ontwikkeling 5,6, waardoor dit systeem zeer appropriate voor het bestuderen van de bijdrage van aangeboren immuniteit in ontsteking en reparatie. Momenteel wordt een groot aantal transgene zebravis bestaan met merkers voor cellen en eiwitten die deelnemen aan trombusvorming, stolling, ontsteking en wondgenezing, inclusief lijnen die bloedplaatjes, fibrinogeen, erytrocyten, leukocyten en vasculair endotheel label 17,21,25- 31. Deze en andere instrumenten moeten het mogelijk maken processen voor hemostase en reparatie aanzienlijk detail te volgen.
Mechanische letsel aanvulling laser letsel voor de studie van hemostase in de zebravis. Terwijl lasergeïnduceerde schade heeft al jaren gebruikt om trombusvorming in de zebravis embryo's en muismodellen, de mechanismen waarmee laser letsel veroorzaakt coagulatie en trombocyten / bloedplaatjesactivering zijn niet volledig bekend 16,32 triggeren. Mechanisch letsel verschaft een fysiologisch relevant werkwijze voor het induceren van coagulatie door vasculaire breuk en vermoedelijktissue-factor-afhankelijke aanvang van de coagulatie cascade. De bevinding dat hirudine behandeling bloedingstijd na letsel aanzienlijk toegenomen suggereert dat dit model trombine afhankelijk. Mechanische verwonding bovendien een aanvulling op laser letsel door voldoende verstoring van een bloedvat om een kans om vat reparatie volgen bieden. Eerdere studies hebben met succes gebruik van mechanische verwondingen door scalpel incisie en naald punctie aan verschillen in bloeden tijden in omstandigheden van farmacologische en genetische manipulatie 19,33 tonen. De munitia pin letsel gebruikt in het huidige model kunnen andere verwondingen modellen aan te vullen met een meer reproduceerbaar letsel als gevolg van de kleine en de gedefinieerde grootte van de wond die het produceert en door het verstrekken van een kans om beter te studeren vaartuig rekanalisatie en reparatie.
Epitheliale verwonden in de zebravis heeft bewezen een krachtig model voor het bestuderen van ontsteking en wondheling 10 zijn. De mogelijkheid ominvoering van een vasculair letsel biedt een mogelijkheid om reparatie van meer complexe wonden in instellingen waar fibrine biedt een voorlopige matrix, trombi en puin worden gewist beoordelen, en vaten regenereren. Aangezien deze processen deelnemen normaal weefselherstel en bij acute en chronische ontsteking en vasculaire pathologie moet deze methode bijdragen model aspecten van humane ziekte in een systeem waar de cellulaire gedrag kan worden gecontroleerd in real time in een geheel diermodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684 (2012).
- Boatman, S., et al.
- Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
- Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
- Lieschke, G. J., Trede, N. S.
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
- Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- LeBert, D. C., Huttenlocher, A.
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351 (2013).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S.
- Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682 (2013).
- Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
- Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
- Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
- Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
- Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450 (2014).
