Protocol
HINWEIS: Verfahren mit Zebrafisch wurden von UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Herstellung der Werkzeuge
- Legen Minutien Stift in ein Stifthalter und klemmen Sie den Stift.
- Mit feiner Spitze Pinzette vorsichtig biegen Sie die Spitze des Stiftes, um einen leichten Haken erstellen.
- Für Bearbeitung und Stabilisierung des Embryos während Verletzungen, biegen Sie das Ende einer 28 Gauge ½ Zoll-Nadel auf einer Insulinspritze mit Spitzzange montiert.
2. Herstellung von Zebrafischembryonen für Verletzungen
- Richten Sie Zebrafisch Brutpaare und sammeln Eier im Eier Wasser (60ug / ml Aquarium Salze), wie zuvor 22 gezeigt.
- Fügen 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) mit dem Ei Wasser, wenn die Embryonen etwa 8 Stunden nach der Befruchtung (HPF) zu Melanisierung verhindern.
- Dechorionate 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) Embryonen vor dem Experiment mit feiner Spitze Pinzette.
- Anesthetize die Embryonen mit 0,02% gepuffert 3-Aminobenzoesäure (Tricaine) ca. 10 min vor Manipulationen.
3. Mechanische Vessel Verletzung von Embryonen
- Übertragen narkotisierten Embryonen auf eine Depression gleiten auf einem Seziertisch Stereomikroskop mit einer Transferpipette.
- Mit dem kurzen flachen Seite der Spritzennadel, um den Embryo mit der dominanten Hand zu manipulieren, positionieren Sie den Embryo auf die Seite mit der Bauchseite abgewandten Nadel.
- Positionieren Sie die Minutien Stift mit der Spitze zeigte direkt auf der Bauchseite des Fisches hinter dem urogenitalen Öffnung. Positionieren Sie den Pin Minutien in einem leichten Winkel, so dass die gebogene Spitze ist in der Lage, durch die Periderm direkt in die Schwanzvene (Abbildung 1 <bohren/ Strong>).
- Mit der Spritzennadel, um den Embryo zu manipulieren, durchbohren die Schwanzvene mit der Minutien Stift durch Antippen des Embryos in den Stift, um etwas haken Sie den Stift in die Vene.
- Mit der Spritzennadel, ziehen Sie den Embryo von der Minutien Stift einen kleinen Riss im Behälter zu schaffen.
ANMERKUNG: Eine erfolgreiche Verletzung führt zur sofortigen Blutungen aus der Vene führen.
4. Analyse der Blutstillung
- Wählen Sie nur Embryonen mit sichtbar zirkulierenden Blutzellen für dieses Verfahren.
- Bereiten Sie den Timer, sobald die Minutien Stift aus dem Behälter gezogen beginnen.
- Den Timer zu starten, sobald der Blutverlust aus der Wunde sichtbar gemacht werden. Wenn Blutverlust aus der Wunde nicht mehr, stoppen Sie die Zeit und notieren Gesamtzeit als Blutungszeit. Wenn die Koagulation inhibiert wird, nimmt die Zeit auf, um, wenn es nicht mehr sichtbar zirkulierenden Blutzellen.
5. Analyse der Wundheilung
- Über post-Verletzungen Tiere auf dem Glasboden Bildgebung Gerichte für die Mikroskopie.
- Entfernen Sie die Mehrheit der Eier Wasser.
- Decken Sie die Embryonen in 0,3 bis 1,2% niedrig schmelzender Agarose in Ei Wasser gelöst, um zwischen 42 und 45 ° C erwärmt und mit 0,02% Tricaine ergänzt.
- Position Embryonen auf ihren Seiten mit einer Pinzette.
- Nachdem die Agarose kühlt, füllen Sie die Schale mit 0,02% Tricaine in Ei Wasser.
- Erwerben Sie Bilder mit Hellfeld, Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie.
- Entfernen Embryo aus der Agarose mit einer Pinzette und Transfer zurück zum Ei Wasser.
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Representative Results
Mechanische Gefäßverletzung wurde am 2. dpf Embryonen (- C 2A) durchgeführt. Schädigung führt zu einer schnellen und zuverlässigen Koagulation Reaktion wie durch die Zeit zur Beendigung der Blutung (2D) gemessen. Um zu bestimmen, ob oder ob nicht Unterschiede in der Gerinnungsreaktion gemessen werden konnte, das Antikoagulans Hirudin wurde den Embryonen durch Injektion in die Kanal Cuviers unmittelbar vor der Verletzung (5-10 nl von 1 Einheit pro ul Hirudin gelöst in Wasser) verabreicht (beispiels Demonstration der Injektionen in den Kanal von Cuvier, siehe vorherige JoVE Artikel 23) 24. Die Verabreichung von Hirudin vor Verletzungen führten zu einem deutlich erhöhten Blutungszeiten gegenüber Vehikelkontrolle (2D).
(: Egfp kdrl) und der roten Blutkörperchen (gata1a: Der Nachweis der Gefäßschäden und Koagulation kann sofort nach der Verletzung mit transgenen Linien für endotheliale sehen DsRed 25,26. Bilder wurden der Reihe nach alle 5 Minuten für eine 12-Stunden-Zeitraum mit Epifluoreszenz erworben. Repräsentative Standbilder werden über verschiedene Phasen der Wundheilung (Figur 3) dargestellt. Verwendung einer Kombination von Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) und Fluoreszenz-Mikroskopie, ist es möglich, verschiedene Parameter der Wundreparatur zu messen. Um zu bestimmen, ob oder ob nicht der Wundheilung folgt ein reproduzierbares Muster über Experimenten wurde die Zeit, um den Blutfluss wieder hergestellt in 4 Gruppen von Fischen gemessen. Gefäßverletzung ergab eine zuverlässige klischeeAntwort von 253 ± 16 min auf die Wiederherstellung des Blutflusses durch die verletzten Gefäß (n = 4-5 Fische pro Experiment Durchschnitt ± SEM).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der 2 dpf Embryo zeigt die Platzierung von Minutien Stift für perf orming mechanische Verletzung der Schwanzvene (CV). Gefäßraum ist grau unterlegt.
Abbildung 2: Die Blutungszeiten können visuell nach mechanischen Verletzungen durch Echtzeit-Video von Zebrafisch Gefäßverletzung auf 2 dpf Embryonen gemessen werden Stills.. Die Bilder werden zum Zeitpunkt der Verletzung (A) gezeigt ist, während der aktiven Blutverlust aus der Wunde (B), und nach Beendigung der Blutabnahme (C). Alle angegebenen Zeiten sind in Sekunden. Embryonen werden seitlich am oberen vorderen und ventralen Seite nach links orientiert. Maßstabsbalken 100 um. Die Verabreichung des Antikoagulans Hirudin führte zu Blutungszeiten gegenüber Fahrzeugsteuerung (D) (p <0,0001, t-Test) signifikant erhöht.pg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 3: Visualisierung mechanische Verletzung und Reparatur mit transgenen Marker Stills aus Zeitraffer DIC und Fluoreszenz-Mikroskopie nach Gefäßverletzung mit Marker für vaskuläre Endothel (kdrl: egfp) und rote Blutzellen (gata1a: DsRed) in 2 dpf Embryonen. Bilder zeigten eine Lücke in Schiffen und lokale Zellakkumulation roter Blut (t = 25), teilweise mit Reparatur wieder hergestellt Blutfluss (t = 210), und anscheinend vollständige Wiederherstellung der normalen Gefäßstruktur (t = 615). Die Zeit wird in Minuten angegeben. Embryonen werden seitlich am oberen vorderen und ventralen Seite nach links orientiert. * Die Position der dorsalen Aorta. Die Verletzung (Pfeilspitze) störte die Schwanzvene und ein Teil der Schwanz Plexus. MaßstabBar 25 um.
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Discussion
Zebrafische wurden erfolgreich als ein Modell für die verschiedenen Arten von Wunden einschließlich Laserbeschädigung 13-15, Laser-induzierte Thrombose 16 und epithelialen Verwundung 10 verwendet. Wir berichten über ein Verfahren zur mechanischen Verwundung, die einfach auszuführen ist und erzeugt einen kontrollierten Verletzungen in einem in vivo-Modell, das sehr gut für Echtzeit-Mikroskopie ist. Schädigung führt zu einem schnellen und messbaren hämostatische Antwort und reproduzierbar Wundreparatur-Programm, das Video und Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet werden können.
Ihre einfache und stereotype Gefäßanatomie, die reproduzierbare Verletzungen bei einem definierten und mikroskopisch zugängliche Website ermöglicht, und die Anwesenheit der meisten vaskulären und hämatopoetischen Zelltypen machen Zebrafischembryonen besonders nützlich für das Studium Reaktionen auf Verletzungen. Allerdings glaube Zebrafischembryonen keine funktionelle Lymphozyten in den ersten Wochen der Entwicklung 5,6, so dass dieses System die meisten apchenden für die Untersuchung der Beteiligung der angeborenen Immunität bei Entzündungen und Reparatur. Zur Zeit ist eine große Vielfalt von transgenem Zebrafisch bestehen Marker für Zellen und Proteinen, die in die Thrombusbildung, Koagulation, Entzündung und Wundheilung, einschließlich der Leitungen, die Thrombozyten Fibrinogen, Erythrozyten, Leukozyten und Gefäßendothel beschriften teilnehmen 17,21,25- 31. Diese und andere Werkzeuge müssen es ermöglichen, Prozesse bei der Hämostase und Reparatur in signifikanten Detail beteiligt zu folgen.
Mechanische Verletzungen ergänzt Laser Verletzungen für das Studium der Blutstillung im Zebrafisch. Während laserinduzierte Schädigung seit Jahren verwendet worden, um die Thrombusbildung in Zebrafischembryos und Mausmodelle, die Mechanismen, durch die Laserbeschädigung ausgelöst Koagulation und Thrombozyten / Blutplättchen-Aktivierung nicht vollständig bekannt 16,32 auslösen. Mechanische Verletzungen stellt eine physiologisch relevante Verfahren zur Induktion der Koagulation durch Gefäßverletzung und, vermutlich,Gewebefaktor-abhängigen Initiation der Gerinnungskaskade. Der Befund, dass Hirudin Behandlung Blutungszeiten signifikant nach der Verletzung erhöht legt nahe, dass dieses Modell thrombinabhängigen. Mechanische Verletzungen ergänzt zusätzlich Laserbeschädigung durch ausreichende Unterbrechung eines Blutgefäßes, eine Gelegenheit, Gefäßreparatur folgen können. Frühere Studien haben erfolgreich mechanische Verletzung von Skalpellschnitt und Punktion verwendet werden, um Unterschiede in der Blutungszeiten unter den Bedingungen der pharmakologischen und genetischen Manipulation 19,33 zeigen. Die Minutien Stift Verletzungen im aktuellen Modell verwendet werden, können andere Verletzungsmodelle durch die Bereitstellung einer besser reproduzierbaren Verletzungen aufgrund der kleinen und definierten Größe der Wunde es produziert und durch die Möglichkeit, besser zu studieren Schiff Rekanalisation und Reparatur zu ergänzen.
Epithelial Verwundung im Zebrafisch hat sich als leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der Entzündung und Wundheilung 10 sein. Die Fähigkeit,Einführung einer Gefäßverletzung bietet die Möglichkeit, die Reparatur von komplexeren Wunden in Situationen, in denen Fibrin bietet eine provisorische Matrix, Thromben und Ablagerungen werden gelöscht bewerten und Schiffen zu regenerieren. Da diese Prozesse in normalen Gewebereparatur und bei akuten und chronischen Entzündungen und Gefäßpathologie, sollte diese Methode helfen, Aspekte der menschlichen Krankheitsmodell in einem System, wo zelluläre Verhalten kann in Echtzeit in einem ganzen Tiermodell beobachtet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
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