Protocol
NOTA: Le procedure utilizzando zebrafish sono stati approvati dalla Institutional Animal Care del UCSF and Use Committee.
1. Preparazione di strumenti
- Inserire pin minuzia in un supporto del perno e bloccare il perno.
- Utilizzando pinze punta fine, piegare attentamente la punta del perno di creare un leggero uncino.
- Per la manipolazione e la stabilizzazione dell'embrione durante lesioni, piegate la fine di un 28 calibro ½ pollice ago montato su una siringa da insulina con pinze ad ago.
2. Preparazione di embrioni di zebrafish per Injury
- Impostare zebrafish coppie nidificanti e raccogliere le uova in acqua uovo (60ug / ml sali acquario), come indicato in precedenza 22.
- Aggiungere 0,003% N-feniltiourea (PTU) all'acqua uovo quando gli embrioni sono circa 8 ore dopo la fecondazione (HPF) per impedire melanizzazione.
- Dechorionate due giorni dopo la fecondazione (dpf) embrioni prima dell'esperimento con una pinza a punta fine.
- Anestetizzare gli embrioni con il 0,02% tamponato acido 3-aminobenzoico (Tricaine) circa 10 minuti prima di manipolazioni.
3. Vessel meccanica Injury di embrioni
- Trasferimento embrioni anestetizzati a una diapositiva depressione su uno stereomicroscopio dissezione utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Usando il lato corto piatto dell'ago della siringa per manipolare l'embrione con la mano dominante, posizionare l'embrione su un lato con la superficie ventrale rivolto verso l'ago.
- Posizionare il perno minuzia con la punta puntato direttamente contro la superficie ventrale del posteriore pesce all'apertura urogenitale. Posizionare il perno minuzia con una leggera angolazione tale che l'estremità ricurva è in grado di penetrare attraverso la periderm direttamente nella vena caudale (Figura 1 </ Strong>).
- Utilizzando l'ago della siringa per manipolare l'embrione, perforare la vena caudale con il perno minutia toccando l'embrione nel perno di agganciare leggermente il perno nella vena.
- Utilizzando l'ago della siringa, estrarre l'embrione dal perno minuzia per creare un piccolo strappo nel recipiente.
NOTA: Una lesione di successo si tradurrà in sanguinamento immediato dalla vena.
4. Analisi di Emostasi
- Scegliere solo embrioni con visibilmente circolanti globuli per questa procedura.
- Preparare per iniziare il temporizzatore non appena il perno minutia è tirato dal recipiente.
- Avviare il temporizzatore non appena la perdita di sangue può essere visualizzata dalla ferita. Quando la perdita di sangue dalla ferita cessa, fermare il timer e registrare il tempo totale come tempo di sanguinamento. Se la coagulazione è inibita, registrare il tempo quando non ci sono più visibilmente circolanti globuli.
5. Analisi di guarigione delle ferite
- Trasferimento posanimali t-lesioni su piatti di imaging con fondo di vetro per la microscopia.
- Rimuovere la maggior parte dell'acqua uovo.
- Coprire gli embrioni a 0,3-1,2% basso punto di fusione agarosio disciolti in acqua uovo, riscaldata a tra 42 e 45 ° C e integrati con il 0,02% Tricaine.
- Posizione embrioni sui loro lati con pinze.
- Dopo l'agarosio si raffredda, riempire il piatto con il 0,02% Tricaine in acqua uovo.
- Acquisire le immagini utilizzando chiaro, epifluorescenza, o microscopia confocale.
- Rimuovere embrione dal agarosio con pinze e trasferire di nuovo in acqua uovo.
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Representative Results
Lesioni vaso meccanica è stata eseguita su 2 dpf embrioni (Figura 2A - C). Risultati lesioni in una rapida ed affidabile risposta coagulazione misurata come tempo per la cessazione di sanguinamento (Figura 2D). Per determinare se le differenze nella risposta della coagulazione possono essere misurati, l'irudina anticoagulante è stato somministrato alle embrioni per iniezione nel condotto di Cuvier immediatamente prima ferendo (5-10 nl di 1 unità per ml irudina disciolto in acqua) (per dimostrazione di iniezioni nel condotto di Cuvier, vedi precedente articolo JoVE 23) 24. La somministrazione di irudina prima di pregiudizio provocato aumentato significativamente i tempi rispetto controllo del veicolo (Figura 2D) sanguinamento.
La prova del danno nave e la coagulazione può essere visto immediatamente post-infortunio utilizzando linee transgeniche per endoteliale (kdrl: EGFP) e dei globuli rossi (gata1a: DsRed 25,26. Le immagini sono state acquisite in sequenza ogni 5 minuti per un periodo di 12 ore usando epifluorescenza. Rappresentante ancora immagini sono mostrate in tutta diverse fasi di riparazione della ferita (Figura 3). Utilizzando una combinazione di contrasto interferenziale differenziale (DIC) e microscopia a fluorescenza, è possibile misurare parametri distinti di riparazione della ferita. Al fine di determinare se la riparazione della ferita seguito un modello riproducibile attraverso esperimenti, il tempo per ristabilito il flusso di sangue è stata misurata in 4 gruppi di pesci. Lesioni Vessel determinato una risposta stereotipata affidabile di 253 ± 16 min per il ripristino del flusso di sangue attraverso il vaso ferito (n = 4-5 pesci per esperimento, media ± SEM).
Figura 1: Schema di 2 dpf embrione che mostra il posizionamento del perno minuzia per perf orming lesioni meccaniche della vena caudale (CV). compartimento vascolare è ombreggiato in grigio.
Figura 2: Bleeding volte può essere misurato visivamente dopo lesioni meccaniche Stills dal video in tempo reale di lesioni vaso zebrafish su 2 dpf embrioni.. Le immagini vengono visualizzate al momento della lesione (A), in caso di perdita di sangue dalla ferita attiva (B), e dopo la cessazione della perdita di sangue (C). Tutti gli orari indicati sono in secondi. Gli embrioni sono orientati lateralmente anteriore in alto e ventrale superficie rivolta verso sinistra. Scale bar 100 micron. Amministrazione della irudina anticoagulante ha portato ad un aumento significativo del tempo di sanguinamento rispetto controllo del veicolo (D) (p <0,0001, test t di Student).pg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Visualizzare lesioni meccaniche e riparazione utilizzando marcatori transgenici Stills da timelapse DIC e microscopia a fluorescenza dopo l'infortunio nave utilizzando marcatori di endotelio vascolare (kdrl: EGFP) e globuli rossi (gata1a: DsRed) in 2 dpf embrioni. Immagini hanno mostrato un divario nei vasi e accumulo locale rosso sangue cellule (t = 25), riparazione parziale con ristabilito il flusso di sangue (t = 210), e apparentemente completo restauro della struttura del vaso normale (t = 615). Il tempo viene indicato in minuti. Gli embrioni sono orientati lateralmente anteriore in alto e ventrale superficie rivolta verso sinistra. * Indica la posizione dell'aorta dorsale. L'infortunio (freccia) interrotto la vena caudale e parte del plesso caudale. Scalabar 25 micron.
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Discussion
Zebrafish sono stati utilizzati con successo come modello per i diversi tipi di ferite comprese lesioni laser 13-15, indotta da laser trombosi 16, e ferendo 10 epiteliale. Descriviamo un metodo di ferimento meccanica che è semplice da eseguire e produce una lesione controllata in un modello in vivo che è altamente suscettibile di microscopia in tempo reale. Risultati lesioni in una risposta rapida emostatico e misurabile e un programma di riparazione ferita riproducibile che può essere monitorato tramite video e timelapse microscopio.
La loro anatomia semplice e stereotipati vascolare, che permette lesioni riproducibile in un sito definito e microscopicamente accessibili, e la presenza di più vascolare e tipi cellulari ematopoietiche rendono zebrafish embrioni particolarmente utile per studiare risposte a lesioni. Tuttavia, gli embrioni di zebrafish non hanno linfociti funzionali durante le prime settimane di sviluppo 5,6, rendendo questo sistema più appropriate per studiare il contributo di immunità innata in infiammazione e la riparazione. Allo stato attuale, una grande varietà di zebrafish transgenico esiste con marcatori per cellule e proteine che partecipano alla formazione di trombi, coagulazione, infiammazione, e la riparazione delle ferite, comprese le linee che etichettano trombociti, fibrinogeno, eritrociti, leucociti e endotelio vascolare 17,21,25- 31. Questi e altri strumenti dovrebbero permettere di seguire processi di emostasi e riparazione in dettaglio significativo.
Lesioni meccaniche complementi lesioni laser per lo studio dell'emostasi in zebrafish. Mentre lesioni indotta da laser è stata usata per anni per innescare la formazione di trombi in embrioni di zebrafish e modelli di mouse, i meccanismi con cui lesioni laser innesca la coagulazione e l'attivazione piastrinica / piastrinica non sono completamente noti 16,32. Danno meccanico fornisce un metodo fisiologicamente rilevanti per indurre coagulazione violazione vascolare e, presumibilmente,tessuto-factor-dipendente inizio della coagulazione a cascata. La scoperta che il trattamento irudina aumentato in modo significativo i tempi di sanguinamento dopo la lesione suggerisce che questo modello è trombina-dipendente. Lesioni meccaniche integra inoltre lesioni laser fornendo perturbazione sufficiente di un vaso sanguigno di offrire l'opportunità di seguire la riparazione dei vasi. Precedenti studi hanno utilizzato con successo danno meccanico da bisturi incisione e ago puntura per mostrare le differenze nei tempi di sanguinamento in condizioni di farmacologica e genetica manipolazione 19,33. L'infortunio pin minuzia utilizzato nel modello attuale può integrare altri modelli lesioni fornendo un infortunio più riproducibile a causa delle dimensioni piccole e definito della ferita che produce e fornendo l'opportunità di studiare meglio ricanalizzazione nave e la riparazione.
Epiteliale ferendo nel zebrafish ha dimostrato di essere un potente modello per studiare l'infiammazione e ferita riparazione 10. La capacità diintrodurre un danno vascolare offre l'opportunità di valutare la riparazione di ferite più complesse in ambienti dove la fibrina fornisce una matrice provvisoria, trombi e detriti vengono cancellati, e le navi rigenerare. Poiché questi processi partecipano normale riparazione dei tessuti e in infiammazione acuta e cronica e patologia vascolare, questo metodo dovrebbe aiutare a modellare aspetti della malattia umana in un sistema in cui comportamenti cellulari possono essere monitorati in tempo reale in un modello animale intero.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
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