Protocol
MERK: Prosedyrer ved hjelp av sebrafisk ble godkjent av UCSF er Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Utarbeidelse av verktøy
- Sett minutia pinnen inn en pinneholderen, og fest pinnen.
- Ved hjelp av fin spiss tang, nøye bøye tuppen av pinnen for å skape en liten krok.
- For manipulasjon og stabilisering av embryoet under skader, bøy enden av en 28 gauge ½ tommers nål montert på en insulinsprøyte ved hjelp nebbtang.
2. Utarbeidelse av Sebrafisk embryoer for Injury
- Sett opp sebrafisk hekkende par og samle egg i egg vann (60ug / ml akvarium salter) som vist tidligere 22.
- Legg 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) til egget vannet når embryoene er ca 8 timer etter befruktning (HPF) for å hindre melanization.
- Dechorionate todagers post befruktning (DPF) embryoer før forsøket ved hjelp fin spiss tang.
- Bedøve embryoene med 0,02% bufret 3-aminobenzosyre (Tricaine) ca 10 min før manipulasjoner.
3. Mekanisk Vessel Skade på embryoer
- Overføre bedøvede embryo til en depresjon lysbilde på en dissekere stereo ved hjelp av en overføring pipette.
- Ved hjelp av den korte flate siden av sprøytespissen for å manipulere embryo med dominerende hånd, plasserer embryoet på sin side med den ventrale overflate som vender bort fra nålen.
- Plasser småarbeidet stiften med spissen rettet direkte mot den ventrale overflaten av fiske posterior til den urogenitale åpning. Plasser minutia pinnen med en liten vinkel slik at den buede spissen er i stand til å pierce gjennom periderm direkte inn i halevenen (figur 1 </ Strong>).
- Ved hjelp av sprøytespissen for å manipulere embryoet, pierce kaudalvenen med minutia pinnen ved å banke embryoet inn pinnen til litt hekte pinnen inn i venen.
- Ved hjelp av sprøytespissen, trekk embryoet bort fra minutia pin for å lage en liten tåre i fartøyet.
MERK: En vellykket skade vil resultere i umiddelbar blødning fra venen.
4. Analyse av Hemostase
- Velge bare embryoer med synlig sirkulerende blodceller for denne prosedyren.
- Klargjør for å starte timeren så snart småarbeidet stiften er trukket fra fartøyet.
- Start tidsmåleren så snart blodtap kan visualiseres fra såret. Når blodtap fra såret opphører, stoppe tidtakeren og registrere total tid som blødningstid. Dersom koaguleringen er sperret, registrerer tiden for når det ikke lenger er synlig sirkulerende blodceller.
5. Analyse av Wound Healing
- Transfer post-skade dyrene bort på glassbunn bilde retter for mikroskopi.
- Fjern mesteparten av egget vann.
- Dekk embryoene i 0,3 til 1,2% lavt smelte agarose oppløst i egg vann, oppvarmet til mellom 42 og 45 ºC og supplert med 0,02% Tricaine.
- Posisjons embryoer på sine sider ved hjelp av pinsett.
- Etter agarosen kjøler, fylle tallerken med 0,02% Tricaine i egg vann.
- Erverve bilder med lysfelt, epifluorescence, eller konfokalmikroskopi.
- Fjern embryo fra agarosen bruker pinsett og overføre tilbake til egg vann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanisk skade skipet ble utført på to dpf embryoer (Figur 2A - C). Skade resulterer i en rask og pålitelig koagulering respons målt som tid til opphør av blødning (figur 2D). For å avgjøre hvorvidt forskjeller i koagulasjon respons kunne måles, ble den antikoagulerende hirudin administrert til embryoer ved injeksjon i Duct av Cuvier umiddelbart før såret (5-10 nl av en enhet per mikroliter hirudin oppløst i vann) (for demonstrasjon av injeksjoner i Duct av Cuvier, se forrige Jove artikkel 23) 24. Administrasjonen av hirudin før skaden resulterte i økt betydelig blødning ganger versus kjøretøy kontroll (figur 2D).
Tegn på skade fartøy og koagulasjon kan sees umiddelbart etter skade ved bruk av transgene linjer for endothelial (kdrl: EGFP) og røde blodceller (gata1a: DsRed 25,26. Bilder ble kjøpt opp sekvensielt hvert 5 min for en 12 timers periode ved hjelp epifluorescence. Representant stillbilder vist gjennom ulike stadier av sår reparasjon (figur 3). Ved hjelp av en kombinasjon av kontrastdifferensialinterferens (DIC) og fluorescens mikroskopi, er det mulig å måle forskjellige parametere av sårreparasjon. For å bestemme hvorvidt eller ikke sårhelbredelse fulgte et reproduserbart mønster på tvers av eksperimenter, ble tidspunktet for gjenopprettet blodstrøm målt i fire grupper av fisk. Fartøyet skade resulterte i en pålitelig stereotype respons på 253 ± 16 min til gjenoppretting av blodstrømmen gjennom den sårede fartøyet (n = 4-5 fisk per forsøk, gjennomsnitt ± SEM).
Figur 1: Skisse av to dpf embryo som viser plassering av minutia pin for perf forme mekanisk skade kaudalvenen (CV). Vaskulær rommet er skyggelagt i grått.
Figur 2: Blødning ganger kan visuelt målt etter mekanisk skade Stills fra sanntids video av sebrafisk skade fartøy på to dpf embryoer.. Bilder vises på tidspunktet for skade (A), under aktiv blodtap fra såret (B), og etter opphør av blodtap (C). Alle klokkeslett er oppgitt i sekunder. Embryoer er orientert sideveis med fremre ved toppen og ventral overflate som vender mot venstre. Skala bar 100 mikrometer. Administrasjon av den antikoagulerende hirudin ført til betydelig økt blødningstider kontra kjøretøy kontroll (D) (p <0,0001, T-test).pg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Visualisering mekanisk skade og reparasjon ved hjelp av transgene markører Stills fra timelapse DIC og fluorescens mikroskopi etter skade fartøyet ved hjelp av markører for vaskulær endotel (kdrl: EGFP) og røde blodceller (gata1a: DsRed) i 2 dpf embryoer. Bilder viste et gap i skip og lokale røde blodceller opphopning (t = 25), delvis reparasjon med re-etablert blodstrøm (t = 210), og tilsynelatende fullstendig restaurering av normal kar struktur (t = 615). Tiden vises i minutter. Embryoer er orientert sideveis med fremre ved toppen og ventral overflate som vender mot venstre. * Indikerer posisjonen til den dorsale aorta. Skaden (pilspiss) forstyrret halevenen og en del av hale plexus. Skalabar 25 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk har blitt brukt som en modell for ulike typer sår, inkludert laser skade 13-15, laser-indusert trombose 16, og epitel såret 10. Vi rapporterer en metode for mekanisk såret som er enkel å utføre og produserer en kontrollert skade i en in vivo modell som er svært mottagelig for sanntids mikroskopi. Skade resulterer i en rask og målbar hemostatisk respons og en reproduserbar sår reparasjon program som kan overvåkes ved hjelp av video og timelapse mikroskopi.
Deres enkle og stereotype vaskulær anatomi, som tillater reproduserbar skade på en definert og mikroskopisk tilgjengelig område, og tilstedeværelsen av mest vaskulær og blodkreft celletyper gjør sebrafisk embryo spesielt nyttig for å studere svarene til skade. Men ikke sebrafisk embryo ikke har funksjonelle lymfocytter i løpet av de første ukene av utviklingen 5,6, noe som gjør dette systemet mest apsikts for å studere bidraget av medfødt immunitet i betennelse og reparasjon. I dag er et bredt utvalg av transgen sebrafisk eksisterer med markører for celler og proteiner som deltar i trombedannelse, koagulering, betennelse og sårheling, inkludert linjer som etiketten trombocytter, fibrinogen, erytrocytter, leukocytter og vaskulært endotel 17,21,25- 31. Disse og andre verktøy skal gjøre det mulig å følge prosessene som er involvert i hemostase og reparasjon i betydelig detalj.
Mekanisk skade utfyller laser skade for studiet av hemostase i sebrafisk. Mens laser-indusert skade har blitt brukt i årevis for å utløse trombedannelse i sebrafisk embryoer og musemodeller, mekanismer som laser skade utløser koagulering og thrombocyte / plateaktivering er ikke fullstendig kjent 16,32. Mekanisk skade gir en fysiologisk relevant metode for å indusere koagulering av vaskulær brudd og, formodentlig,vev-faktor-avhengige initiering av koagulasjonskaskaden. Oppdagelsen av at hirudin behandling betydelig økt blødningstider etter skade tyder på at denne modellen er trombin avhengig. Mekanisk skade i tillegg utfyller laser skade ved å gi tilstrekkelig avbrudd av en blodåre å gi en mulighet til å følge fartøyet reparasjon. Tidligere studier har med hell brukt mekanisk skade av skalpell snitt og nålestikk å vise forskjeller i blødningstid under forhold med farmakologiske og genetisk manipulasjon 19,33. Minutia pin skade som brukes i dagens modell kan utfylle andre skademodeller ved å tilby en mer reproduserbar skade på grunn av den lille og definerte størrelsen på såret den produserer og ved å gi en mulighet til å bedre studere fartøy recanalization og reparasjon.
Epitel såret i sebrafisk har vist seg å være en kraftig modell for å studere betennelse og sår reparasjon 10. Evnen til åintrodusere en vaskulær skade gir en mulighet til å vurdere reparasjon av mer komplekse sår i miljøer hvor fibrin gir en foreløpig matrise, tromber og rusk er fjernet, og fartøy regenerere. Ettersom disse prosesser deltar i normalt vev reparasjon og akutt og kronisk inflammasjon og vaskulær patologi, bør denne metoden bidra til å modellere aspekter av human sykdom i et system hvor cellulære oppførsel kan overvåkes i sanntid i et helt dyremodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684 (2012).
- Boatman, S., et al.
- Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
- Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
- Lieschke, G. J., Trede, N. S.
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
- Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- LeBert, D. C., Huttenlocher, A.
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351 (2013).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S.
- Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682 (2013).
- Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
- Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
- Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
- Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
- Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450 (2014).
