Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры с использованием данио были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета UCSF-х годов.
1. Подготовка инструментов
- Вставьте мелочах штифт в держатель контактный и зажмите палец.
- Использование тонких наконечников щипцов, осторожно отогните кончиком пальца, чтобы создать небольшое крючок.
- Для манипуляции и стабилизации эмбриона во время травмы, согните конец 28 ЯЗЫК ½ дюйма иглы, установленной на инсулиновый шприц с использованием остроносые плоскогубцы.
2. Подготовка эмбрионов данио рерио за травмы
- Настройка гнездящихся пар данио и собирать яйца в яйца водой (60ug / аквариум солей мл), как было показано ранее 22.
- Добавить 0,003% N-фенилтиомочевины (ПТУ) к яичной водой, когда эмбрионы примерно 8 ч после оплодотворения (ФВЧ), чтобы предотвратить меланизации.
- Dechorionate два дня после оплодотворения (DPF) эмбрионы до эксперимента с использованием тонких наконечников щипцов.
- Обезболить эмбрионов с 0,02% буферном 3-аминобензойной кислоты (Tricaine) примерно 10 минут до манипуляции.
3. Механическая судно Травмы эмбрионов
- Трансфер наркотизированных эмбрионов к депрессии слайда на вскрытии стереомикроскопом с помощью передачи пипетки.
- Использование короткого плоскую сторону иглы шприца манипулировать эмбриона с доминирующей стороны, положение эмбриона на бок с вентральной поверхности, обращенной в сторону от иглы.
- Установите мелочах контактный с наконечником направлен непосредственно против вентральной поверхности рыбы кзади от открытия мочеполовой. Установите мелочах штифт под небольшим углом, так что изогнутая наконечник может пробить перидермы непосредственно в хвостовую вену (рис 1 </ STRONG>).
- Использование иглу шприца, чтобы манипулировать эмбриона, проколоть хвостовую вену с мелочах штифта, нажав на эмбрион в булавку, чтобы немного зацепить штифт в вену.
- Использование иглу шприца, потяните эмбрион от мелочах булавку, чтобы создать небольшой разрыв в сосуде.
ПРИМЕЧАНИЕ: успешное что приведет к травмам в непосредственной кровотечения из вены.
4. Анализ гемостаза
- Выбирайте только эмбрионы с явно циркулирующих в крови клеток для этой процедуры.
- Подготовьте, чтобы начать таймер, как только мелочах контактный вытягивается из сосуда.
- Запустите таймер, как только потеря крови могут быть визуализированы из раны. При потере крови из раны прекращается, остановить таймер и записывать общее время в время кровотечения. Если свертывания тормозится, записывать время, когда к уже не заметно циркулирующих клеток крови.
5. Анализ заживления ран
- Передача позT-травмы животных на стеклянное дно блюд изображений для микроскопии.
- Удалить большинство яиц водой.
- Обложка эмбрионов в 0,3-1,2% низкой температурой плавления агарозы растворенные в яичном воды, нагревают до температуры 42 и 45 ° С и с добавкой 0,02% Tricaine.
- Эмбрионы Позиция на боку с помощью щипцов.
- После агарозном охлаждает, заполните блюдо с 0,02% Tricaine в яйце воды.
- Получение изображений с помощью светлого поля, эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
- Удалить эмбрион из агарозы с помощью щипцов и передать обратно в яйцо воду.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Механические травмы сосуда проводили на 2 денье эмбрионов (фиг.2А - С). Результаты травм при быстрой и надежной связи коагуляции измеряется время прекращения кровотечения (рис 2d). Чтобы определить, может ли или нет быть измерена различия в ответ коагуляции, антикоагулянта гирудина вводили эмбрионов путем инъекции в канал Кювье непосредственно перед ранение (5-10 нл на 1 единицу в мкл гирудина, растворенного в воде) (для демонстрация инъекций в канал Кювье, см предыдущую статью Юпитера 23) 24. Администрация гирудин до травмы в результате значительно повышенная кровоточивость раза по сравнению управления транспортным средством (рис 2D).
Данные повреждения сосуда и коагуляции можно увидеть сразу после травмы с использованием трансгенных линий эндотелиальных (kdrl: EGFP), и эритроцит (gata1a: Dsred 25,26. Изображения были получены последовательно каждый 5 мин в течение периода 12 ч с использованием эпифлуоресцентной. Представитель неподвижных изображений показаны на протяжении разных стадиях заживления ран (рис 3). Использование комбинации дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентной микроскопии, можно измерить различные параметры заживления ран. Для того, чтобы определить, с последующим или нет заживления ран воспроизводимый образец через экспериментах, время восстанавливается кровоток измеряли в 4 группах рыб. Травмы судно в результате надежного стереотипного ответа 253 ± 16 мин к восстановлению кровотока через раненого судна (п = 4-5 рыбы на эксперимент, в среднем ± SEM).
Рисунок 1: Схема 2 DPF эмбриона, показывая размещение мелочах ПИН-кодов для функционирования; orming механическую травму хвостовую вену (CV). Сосудистая отсек серым цветом.
Рисунок 2: Кровотечение раз можно визуально измеряется после механической травмы Кадры из видео в реальном времени с данио травмы сосуда на 2 DPF эмбрионов.. Изображения показаны в момент травмы (а), в течение активного потери крови из раны (B), и после прекращения потери крови (С). Часовой пояс указанные в секундах. Эмбрионы ориентированы в поперечном направлении с передним и сверху брюшной поверхности, обращенной влево. Шкала бар 100 мкм. Администрация антикоагулянт гирудин привело к значительно увеличилось время кровотечения в сравнении с контролем транспортного средства (D) (р <0,0001, т-тест Стьюдента).PG "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3:. Визуализация механические травмы и ремонт с использованием трансгенных маркеров Кадры из интервальная съемка ДВС и флуоресцентной микроскопии после травмы судно с помощью маркеров сосудистого эндотелия (kdrl: EGFP) и красных кровяных клеток (gata1a: Dsred) в 2 денье эмбрионов. Изображения показали разрыв в сосудах и локального накопления красных кровяных клеток (Т = 25), частичный ремонт с восстановленным кровотоком (Т = 210), и, по-видимому полного восстановления нормальной структуры судна (т = 615). Время указано в минутах. Эмбрионы ориентированы в поперечном направлении с передним и сверху брюшной поверхности, обращенной влево. * Указывает положение дорсальной аорты. Травмы (стрелка) нарушается хвостовую вену и часть хвостового сплетения. Шкалабар 25 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данио рерио были успешно использованы в качестве модели для разных типов ран, включая лазерную травму 13-15, лазерно-индуцированной тромбоз 16 и эпителиальные ранив 10. Мы сообщаем метод механического ранения, которое является простым для выполнения и производит контролируемое повреждение в модели в естественных условиях, что является наиболее подходящей для реального времени микроскопии. Результаты травм при быстрой и измеримых гемостаза ответ и воспроизводимым программы заживления ран, которые могут контролироваться с помощью видео и интервальной съемки микроскопии.
Их простой и трафаретная сосудистой анатомии, которая позволяет воспроизводимое повреждение при определенной и микроскопически доступной сайта и присутствие большинства сосудов и кроветворных типов клеток делают эмбрионы данио особенно полезны для изучения ответов на рану. Тем не менее, эмбрионы рыбок данио не имеют функциональные лимфоциты в течение первых недель развития 5,6, что делает эту систему наиболее APщих образовательных для изучения вклада врожденного иммунитета в развитии воспаления и ремонта. В настоящее время большое разнообразие трансгенных данио существует с маркеров для клеток и белков, которые участвуют в образовании тромбов, коагуляции, воспаления и заживления ран, в том числе линий этой меткой тромбоцитов, фибриноген, эритроциты, лейкоциты и эндотелий сосудов 17,21,25- 31. Эти и другие инструменты должны позволить, чтобы следовать за процессы, вовлеченные в гемостаз и ремонта в значительной подробно.
Механическая травма дополняет лазерный травмы для изучения гемостаза у рыбок данио. В то время как лазерно-индуцированной травмы был использован в течение многих лет, чтобы вызвать образование тромбов у эмбрионов данио рерио и мышиных моделях, механизмов, посредством которых лазерный травмы инициирует коагуляции и активация тромбоцитов / тромбоцитов, полностью не известны 16,32. Механическая травма обеспечивает физиологический метод для индукции свертывания сосудистой нарушения и, по-видимому,ткани фактор зависит начало свертывания каскада. Тот факт, что гирудин лечение значительно увеличилось время кровотечения после травмы позволяет предположить, что эта модель тромбина зависит. Механическая травма дополнительно дополняет лазерный травмы, предоставляя достаточное нарушение кровеносного сосуда, чтобы обеспечить возможность проследить ремонт сосудов. Предыдущие исследования успешно использовали механические травмы скальпелем надрез и прокола, чтобы показать различия в периоды кровотечения в условиях фармакологической и генетических манипуляций 19,33. Травмы мелочах используется вывод в текущей модели могут дополнять другие модели травмы, предоставляя более воспроизводимые травмы в результате малого и определенного размера раны она производит и обеспечивая возможность лучше изучить реканализации и ремонт судов.
Эпителиальные ранив в рыбок данио оказались мощная модель для изучения воспаление и заживление ран 10. Способностьввести повреждение сосудов дает возможность оценить ремонт более сложных ран в условиях, когда фибрина обеспечивает предварительную матрицу, тромбы и мусор удаляются, и сосуды восстанавливаются. Поскольку эти процессы задействованы в нормальном восстановления тканей и при остром и хроническом воспалении и сосудистой патологии, этот способ должен помочь моделировать аспекты заболевания человека в системе, где сотовые поведения можно наблюдать в режиме реального времени в целом животной модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684 (2012).
- Boatman, S., et al.
- Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
- Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
- Lieschke, G. J., Trede, N. S.
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
- Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- LeBert, D. C., Huttenlocher, A.
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351 (2013).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S.
- Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682 (2013).
- Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
- Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
- Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
- Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
- Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450 (2014).
