This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
في هذا التقرير، وصفنا تنفيذ الأشعة تحت الحمراء القريبة fluorophore المسمى تحقيقات للتأكد من صحة في الجسم الحي تجارب التصوير طعم أجنبي باستخدام المجراة سابقا التدفق الخلوي ومضان المجهري للأورام طعم أجنبي تشريح. نحن مقارنة nanobody واحد نطاق (ق + 16A، 17 كيلو دالتون) (1) والأجسام المضادة وحيدة النسيلة (Nika102، 150 كيلو دالتون) 2،3 موجهة لنفس المستضد الهدف لمحددة في الجسم الحي القريب من الأشعة تحت الحمراء التصوير مضان في نموذج سرطان الغدد الليمفاوية طعم أجنبي. يتم التعبير عن مستضد المستهدفة ADP ribosyltransferase ARTC2.2 باعتباره GPI الراسية-سطح الخلية ecto انزيم من قبل خلايا سرطان الغدد الليمفاوية 4-9.
Nanobodies المستمدة من الكامليد السلسلة الثقيلة فقط الأجسام المضادة هي أصغر المتاحة ملزم مستضد شظايا 10،11. مع فقط ~ 15 كيلو دالتون، هذه الشظايا الأجسام المضادة صغيرة قابلة للذوبان، ومستقرة جدا وبرأت renally من التداول 8،10. تيخصائص ذات المناظر جعلها مناسبة بشكل خاص لاستهداف محددة وفعالة من مستضدات الأورام في الجسم الحي 12-20. أهداف مستضد المشتركة للnanobodies المتاحة هي عامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR1 أو HER-1)، الإنسان عامل نمو البشرة من النوع 2 (HER-2 أو CD340)، مستضد سرطاني مضغي (CEA)، والتصاق الخلايا الوعائية جزيء-1 (VCAM-1 ) 21. تقارن Nanobody هي أدوات واعدة لعلاج مناعي السرطان وعلاج الأمراض الالتهابية 22.
وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن nanobodies تسمح أعلى -ratios للورم إلى الخلفية (T / B) من الأجسام المضادة في الجسم الحي التقليدية في تطبيقات التصوير الجزيئي 8،17،19. ويفسر ذلك بشكل رئيسي عن طريق اختراق الأنسجة فقيرة نسبيا وبطيئة من الأجسام المضادة التقليدية، وإزالة بطيئة من التداول، والاحتفاظ طويلة في أنسجة غير المستهدفة 23. وعلاوة على ذلك، يزيد من الأجسام المضادة التقليدية يؤدي إلى i تراكم غير محددالأورام مستضد سلبي ن الهدف الناجمة عن نفاذية تعزيز والاستبقاء (EPR) تأثير 24،25. وهذا يعني أن تناول جرعات أعلى من الأجسام المضادة التقليدية قد تزيد ليس فقط إشارات محددة ولكن أيضا إشارات غير محددة، وبالتالي تقليل الحد الأقصى لنسبة قابلة للتحقيق الورم إلى الخلفية. في المقابل، زيادة جرعة nanobodies يزيد من إشارات الأورام مستضد إيجابي ولكن ليس من الأنسجة الطبيعية أو الأورام مستضد سلبي (بيانات غير منشورة).
ما وراء المقارنة بين nanobodies والأجسام المضادة التقليدية، ونحن الخطوط العريضة تقييما داخل الفرد من xenografts مستضد الإيجابية و-negative في نفس الفئران للمقارنة المباشرة لإشارات محددة وغير محددة بسبب تأثير EPR. سمحت تحقيقات مترافق fluorophore القريب من الأشعة تحت الحمراء لنا لاستغلال التحقيق واحد في الجسم الحي وخارج الحي باستخدام التصوير مضان الأشعة تحت الحمراء القريبة، التدفق الخلوي، ومضان المجهري. تطبيق بروتوكولات لدينا يسمح لغيرالمشع، حساسة للغاية، وغير مكلفة تعظيم الاستفادة من التجارب المجراة في التصوير الجزيئي مثل تقييم يبني الأجسام المضادة الجديدة لاستهداف الورم محدد.
والهدف من هذه الدراسة هو البرنامج التعليمي لتسليط الضوء على استخدام NIRF التصوير لتقييم يبني الأجسام المضادة الجديدة في مجال التصوير الجزيئي قبل السريرية.
في هذا البروتوكول، تم تنفيذ جميع التجارب مع نظام NIRF-التصوير الحيوانات الصغيرة، ومضان تنشيط خلية فارز (FACS) تدفق عداد الكريات، والمجهر متحد البؤر.
استخدمنا الأشعة تحت الحمراء القريبة fluorophore nanobodies وصفت والأجسام المضادة وحيدة النسيلة التقليدية الموجهة ضد نفس الهدف على خلايا سرطان الغدد الليمفاوية للمقارنة المتعدد الوسائط للفي الجسم الحي وخارج الحي التحليلات. أظهرنا أن nanobodies هي مناسبة كذلك أدوات التشخيص للكشف السريع ومحددة في الجسم الحي من الأورام اللمفاوية.
في الجسم الحي، ق + 16A 680 يسمح للكشف سريع وأكثر تحديدا من xenografts-ARTC2 إيجابية. وبصرف النظر عن حركية مختلفة للحصول على أفضل التصور الورم في الجسم الحي، وكان العيب الرئيسي لNika102 680 إشارة غير محددة عالية من الأورام ARTC2 سلبية وإشارات الخلفية غير محددة.
يحلل خارج الحي تدفق cytometric من الخلايا المتفرقة من الأورام تشريح لم تظهر أي ملزمة لانوعي إلى خلايا سرطان الغدد الليمفاوية-ARTC2 سلبية من حقن AF680-تقارن. خارج الحي مضان كشفت قوي وhomogen تقريباتلطيخ الأوس من الخلايا في أقسام ورم ART2C إيجابية في حالة nanobody الصورة + 16A، مؤكدا أن nanobody كان قادرا على الوصول إلى المناطق النائية حتى داخل الورم بعد 6 ساعات. في المقابل، أظهر الأجسام المضادة وحيدة النسيلة تلطيخ أضعف وغير متجانسة من الخلايا في الأورام ARTC2 إيجابية بعد 6 ساعات. نتائج التصوير أفضل مع الأجسام المضادة التقليدي لا يمكن أن يتحقق بعد 24 ساعة أو 48 ساعة (لا تظهر البيانات). من أجل إجراء مقارنة شاملة اثنين من بنيات الحجم بشكل مختلف، والتصوير في نقاط زمنية مختلفة (المسلسل التصوير) لابد من القيام بها لتحديد أفضل نقطة زمنية التصوير لكل بناء.
مثل دراسات سابقة أخرى، فإن النتائج المعلنة هنا تؤكد أن في الجسم الحي التصوير الجزيئي مع nanobodies المسمى يسمح في نفس اليوم التصوير ورم سريع ومحدد مع ارتفاع الورم إلى خلفية نسب 12-15،17-19. بالعكس، والأجسام المضادة التقليدية تؤدي إلى انخفاض الورم إلى الخلفية النسب وإشارات غير محددة من مكافحةالأورام جنرال السلبية في وقت مبكر بعد الحقن بسبب إزالتها بطيء من الجسم. من أجل الحصول على نتائج التصوير الأمثل مع الأجسام المضادة التقليدية، وقت التصوير ويشير 24 ساعة أو حتى 48 ساعة بعد وهناك حاجة إلى حقن عادة. هذه النتائج هي في اتفاق مع الدراسات السابقة التي اقترحت أن الأجسام المضادة التقليدية مع فوائد علاجية ثبت أن فائدة محدودة في مجال التصوير الجزيئي 17،19،26. لذلك الأجسام المضادة التقليدية قد تكون مناسبة بدلا لأغراض علاجية بسبب الطويلة البلازما نصف الحياة، بينما nanobodies هي مناسبة بدلا لأغراض التصوير بسبب التخليص السريع الخاصة بهم من الدورة الدموية. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن أي فائض من nanobodies أصغر (15-17 كيلو دالتون) يتم مسح بسرعة عبر القضاء الكلوي في حين يتم الاحتفاظ الزائد من الأجسام المضادة التقليدية الكبيرة (150 كيلو دالتون) في تداول هذه الاختلافات. وبالتالي فإن الميزة الرئيسية لnanobodies للتصوير الجزيئي هو إشارة خلفية منخفضة في نقاط وقت التصوير في وقت مبكر regardlوفاق سطيف من الجرعة حقن. وهذا يسمح التصوير نفس اليوم ويمكن أن يكون للترجمة إلى السريري الإعداد. النقيض من ذلك، الأجسام المضادة التقليدية يجب أن تكون معاير بالضبط لتقليل إشارات خلفية غير محددة، مع الحفاظ على ما يكفي من إشارة محددة من الأنسجة المستهدفة (بيانات غير منشورة).
واحدة من قيود في الجسم الحي تقنية NIRF التصوير هو عمق الاختراق المنخفض الذي يسمح عموما التصوير الوحيد من تحت الجلد ولكن ليس من النماذج الورم مثلي. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذا القيد في بيئة تجريبية قبل تقنيات الصورة الصوتية للتصوير الشعاعي الطبقي وضعت مؤخرا التي تسمح التصوير كامل الجسم من الفئران 27 الذين يعيشون. الحد آخر من تقنية NIRF التصوير هو تقييم الجرعة الأنسجة بالمقارنة مع التصوير بوساطة النويدات المشعة. ومع ذلك، قد يكون radiolabelled في nanobodies عن التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) التصوير من النماذج طعم أجنبي والتقييم الكمي الدقيق للالتتبع biodistribution. في الواقع، ونتائج NIRF التصوير لدينا هي وفقا لدراسة حديثة أنه بالمقارنة nanobodies والأجسام المضادة التقليدية للتصوير PET. وجاء في الكتاب أيضا إلى استنتاج مفاده أن nanobodies تسمح التصوير في نفس اليوم مع ارتفاع الورم إلى خلفية نسب 15.
ومع ذلك، فقط وضع العلامات من يبني الأجسام المضادة مع الأشعة تحت الحمراء القريبة الفلورسنت صبغة AF680 يسمح لنا شاملة في المختبر، في الجسم الحي وخارج الحي مقارنة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء التصوير مضان باستخدام التدفق الخلوي، مضان المجهر، وNIRF التصوير. لهذا السبب، ولأنه غير مشع، حساسة للغاية، وغير مكلفة، ويستخدم سهلة لإنتاج نسبيا تحقيقات المستهدفة، ندعو إلى استخدام تقنية NIRF التصوير لتقييم يبني الأجسام المضادة الجديدة في مجال التصوير الجزيئي قبل السريرية.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل كلية الدراسات العليا "التهاب والتجديد" من مركز البحوث التعاونية 841 من الألمانية للبحوث (الكسندر لينز، فالنتين Kunick، وليام Fumey)، عن طريق مركز البحوث التعاونية 877 من الألمانية للبحوث (فريدريش كوخ نولتي) ، من قبل مؤسسة فيرنر أوتو (بيتر Bannas)، من قبل مؤسسة فيلهلم ساندر (بيتر Bannas، فريدريك كوخ نولتي)، وجمعية الألمانية للبحوث (مارتن Trepel، فريدريك هاج وفريدريك كوخ نولتي). نشكر جامعة سرطان مركز هامبورغ (UCCH) في مرفق فيفو البصرية التصوير الأساسية والموظفين في UKE للتشاور وخدمات عالية الجودة العالية. وأيد مرفق الأساسية في جزء من المنح المقدمة من دويتشه Krebshilfe (السرطان الألمانية المعونة).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |