This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
Bu yazıda, ex vivo disseke ksenograft tümörlerinin flow sitometri ve floresan mikroskop kullanılarak in vivo ksenogref görüntüleme deneyleri onaylanması için yakın-kızılötesi fluorofor etiketli prob uygulanmasını açıklar. Tek bir etki nanobody (s + 16a, 17 kDa), 1 ve in vivo olarak belirli aynı hedef antijene karşı yönlendirilen tek klonlu bir antikoru (Nika102, 150 kDa), 2,3 karşılaştırın yakın kızıl ötesi bir lenfoma ksenogreft modelinde floresan görüntüleme. Hedef antijeni ADP-riboziltransferaz ARTC2.2 lenfoma hücreleri 4-9 tarafından bir GPI-ankorlu hücre yüzeyi ekto-enzim olarak ifade edilir.
Camelid türetilen nanoantikorlar ağır zincir sadece antikorlar en küçük antijen bağlanma fragmanları, 10,11 vardır. Sadece ~ 15 kDa, bu küçük antikor fragmanları, çözünür, çok stabil olan ve böbrek yoluyla dolaşım 8,10 temizlenir. These özellikleri, in vivo 12-20 tümör antijenlerinin spesifik ve etkin bir hedefleme için özellikle uygun hale gelir. Mevcut nanoantikorlar ortak antijen hedefleri (EGFR1 veya HER-1), insan epidermal büyüme faktörü tip 2 (HER-2 veya CD340), karsinoembriyonik antijen (CEA) ve vasküler hücre yapışma molekülü-1 (VCAM-1, epidermal büyüme faktörü reseptörünün ) 21. Nanobody birleşikleri enflamatuar hastalıklar 22 kanseri immünoterapisi ve tedavisi için gelecek vaat eden araçlar.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, daha yüksek tümör-zemin (T / B) 'de in vivo moleküler görüntüleme uygulamalarında 8,17,19 geleneksel antikorlara göre -ratios nanoantikorlar izin göstermiştir. Bu hedefli olmayan dokularda 23 geleneksel antikorlar dolaşımdan yavaş açıklık ve uzun tutma nispeten zayıf ve yavaş doku penetrasyonu ile ağırlıklı olarak açıklanmıştır. Ayrıca, geleneksel antikor fazla spesifik olmayan birikimi i açarGelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) neden n hedef antijen-negatif tümörler 24,25 etkilemektedir. Bu durum, bilinen antikor yüksek dozlarda bu şekilde elde edilebilen maksimum tümör-zemin oranını daha da azaltmak, belirli sinyallerini değil, aynı zamanda non-spesifik sinyaller sadece artış anlamına gelir. Bunun aksine, nanoantikorlar dozunun artırılması, normal dokuda değil veya antijen negatif tümör (yayınlanmamış veriler) antijen pozitif tümörlerinin sinyalleri arttırır.
Nanoantikorlar ve konvansiyonel antikorlarla karşılaştırılması ötesinde, bağlı EPR etkisi, spesifik ve spesifik olmayan sinyallerin doğrudan bir karşılaştırma için, aynı farelerde antijen pozitif ve negatif ksenograftlarının bir bireyin kendi içindeki değerlendirme özetlemektedir. yakın kızılötesi fluorofor konjuge sondalar bize, yakın kızıl ötesi floresan görüntüleme kullanılarak yapılan in vivo ve ex vivo tek bir prob yararlanma akış sitometrisi, ve floresan mikroskobu bırakıldı. Bizim protokolleri uygulamak dışı için izin verirBu tür spesifik tümör hedefleme için yeni antikor yapıları değerlendirilmesi gibi in vivo moleküler görüntüleme deneyler, radyoaktif, son derece hassas ve ucuz bir optimizasyonu.
Bu öğretici çalışmanın amacı klinik öncesi moleküler görüntülemede yeni antikor yapılarının değerlendirilmesi için NIRF-görüntüleme kullanımını vurgulamak için.
Bu protokol, tüm deneyler, bir küçük hayvan NIRF-görüntüleme sistemi ile yapıldı, bir floresan aktive hücre ayırıcı (FACS) akış sitometresi ve konfokal mikroskop.
Bu, in vivo ve ex vivo analizler çok yönlü bir karşılaştırma için limfoma hücreleri üzerinde aynı hedefe karşı yakın kızılötesi flüorofor etiketli nanoantikorlar ve konvansiyonel monoklonal antikorlar kullanılır. Biz nanoantikorlar de lenfomaların hızlı ve spesifik in vivo tespiti için tanı araçları olarak uygun olduğunu göstermiştir.
İn vivo olarak, + 16a 680 ARTC2 pozitif ksenograftlarının hızlı ve daha özel saptanmasına olanak s. Apart in vivo iyi tümör görselleştirme için farklı kinetik, Nika102 680 büyük dezavantajı ARTC2-negatif tümörler ve spesifik olmayan arka plan sinyalleri yüksek nonspesifik sinyal oldu.
Kesilmiş tümör enjekte AF680-konjugatlarının ARTC2 negatif lenfoma hücrelerine herhangi bir spesifik olmayan bağlanma gösterdi gelen ex vivo akış sitometrik dağılmış hücrelerin analiz eder. Ex vivo floresan hemen hemen homojen güçlü ortaya çıktı venanobody 6 saat sonra tümör içinde hatta uzaktan bölgelere ulaşmak mümkün olduğunu teyit nanobody s + 16a durumunda ART2C-pozitif tümör bölümlerinde hücrelerin lı boyama. Bunun tersine, tek klonlu antikor, 6 saat sonra ARTC2-pozitif tümörlerde hücre artmış ve homojen olmayan bir lekelenme göstermiştir. Geleneksel antikor ile daha iyi görüntüleme sonuçları 24 saat ya da 48 saat sonra elde edilebilir (veri gösterilmemiştir). Iki farklı boyutlu yapıların tam bir karşılaştırma yapmak için, farklı zaman noktalarında (seri görüntüleme) ile görüntüleme, her bir yapı için en uygun görüntü zaman noktasını tanımlamak üzere gerçekleştirilebilir zorundadır.
Önceki diğer çalışmalarda olduğu gibi, burada bildirilen sonuçlar in vivo etiketli nanoantikorlar moleküler görüntüleme yüksek tümör-zemin oranları 12-15,17-19 ile hızlı ve spesifik aynı gün tümör görüntüleme sağlar vurgulamak. Tersine, geleneksel antikorlar düşük tümör-to-arka oranları ve anti-gelen nonspesifik sinyallerine nedennedeniyle vücuttan onların yavaş açıklık erken enjeksiyondan sonra jeneratör negatif tümörler. Konvansiyonel antikorlarla uygun görüntüleme sonuçları elde etmek için, bir görüntüleme süresi 24 saat ya da enjeksiyon çok ihtiyaç duyulan sonra da 48 saat işaret eder. Bu bulgular, kanıtlanmış terapötik bir fayda ile, geleneksel antikorlar moleküler görüntüleme 17,19,26 kullanıma sınırlı olduğunu ileri sürmüşlerdir önceki çalışmalar ile uyum içindedir. Nanoantikorlar bağlı dolaşımından hızlı bir temizlenme için görüntüleme amaçları için oldukça uygundur iken Bu nedenle, geleneksel antikorlar nedeniyle uzun plazma yarı-ömrü için terapötik amaçlar için oldukça uygun olabilir. Bu farklılıklar, daha büyük, konvansiyonel antikorlarla (150 kDa), fazla dolaşımdan tutulmaya devam edildiği halde daha küçük nanoantikorlar (15-17 kDa) herhangi bir aşırı hızlı bir şekilde renal eliminasyon yoluyla temizlenir olmasından kaynaklanmaktadır. Yani moleküler görüntüleme için nanoantikorlar büyük avantajı erken görüntüleme zaman noktalarında düşük arka plan sinyali regardlenjekte edilen dozun ess. Aynı gün görüntüleme sağlar ve klinik bir ortam. Tersine çevrilebilir olabilir, geleneksel antikorlar tam olarak hedef dokuya (yayınlanmamış veriler) yeterli belirli bir sinyal korurken spesifik olmayan arka plan sinyalleri en aza indirmek için titre edilmelidir.
In vivo NIRF-görüntüleme tekniği sınırlamalardan biri, genel değil ortotopik tümör modellerinin deri altı tek görüntüleme izin veren düşük penetrasyon derinliği. Ancak, bu sınırlama fareler 27 yaşam tüm vücut görüntüleme izin son zamanlarda geliştirilen tomografik fotoğraf-akustik teknikler ile deneysel bir ortamda üstesinden olabilir. Radyonüklid-aracılı görüntüleme ile karşılaştırıldığında NIRF-görüntüleme tekniği başka sınırlama doku doz değerlendirilmesidir. Ancak, nanoantikorlar ksenogref modelleri ve tam kantitatif değerlendirme pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme için radyo-etiketli olabilirizleyici biyodağılımı. Gerçekten de, NIRF görüntüleme sonuçları nanoantikorlar PET görüntülemesi için geleneksel antikor göre yeni bir çalışma ile uygun olarak sunulmuştur. Yazarlar ayrıca nanoantikorlar yüksek tümör-zemin oranları 15 ile aynı gün görüntüleme izin sonuca geldi.
Ancak, yakın-kızılötesi floresan boya AF680 ile antikor yapılarının yalnızca etiketleme in vivo, in vitro bize kapsamlı izin ve ex vivo yakın kızılötesi floresan görüntüleme karşılaştırma, akım sitometri floresan mikroskopi ve NIRF-görüntüleme kullanarak. O, radyoaktif olmayan ucuz, son derece hassas ve nispeten kolay üretmek hedeflenen problar kullanır, çünkü bu nedenle, ve biz preklinik moleküler görüntülemede yeni antikor yapılarının değerlendirilmesi için NIRF-görüntüleme tekniği kullanımını savunmaktadırlar.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft İşbirlikçi Araştırma Merkezi 877 (Friedrich Koch-Nolte) tarafından okuldan mezun 'Enflamasyon ve rejenerasyon' Deutsche Forschungsgemeinschaft İşbirlikçi Araştırma Merkezi 841 (Alexander Lenz, Valentin KUNICK, William Fumey) olarak, tarafından desteklenen Wilhelm Sander Vakfı tarafından Werner Otto Vakfı (Peter bannas), (Peter bannas, Friedrich Koch-Nolte), tarafından ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel Çağlar'la, Friedrich Haag ve Friedrich Koch-Nolte) tarafından. Biz Vivo Optik Görüntüleme Çekirdek Tesisi ve personel Uke de istişare ve yüksek kaliteli hizmet Üniversite Kanser Merkezi Hamburg (UCCH) teşekkür ederim. Çekirdek Tesisi Deutsche Krebshilfe (Alman Kanser Yardım) hibe tarafından kısmen desteklenmiştir.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |