This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
No presente relatório, nós descrevemos a implementação do fluoróforo sondas marcadas do infravermelho próximo para validação de experimentos in vivo de imagem xenograft usando ex vivo citometria de fluxo e microscopia de fluorescência dos tumores de xenotransplante dissecados. Nós comparar um único nanocorpo domínio (s + 16a, 17 kDa) 1 e um anticorpo monoclonal (Nika102, 150 kDa) 2,3 dirigido para o mesmo antigénio alvo específico para in vivo no infravermelho próximo de imagens por fluorescência em um modelo de xenotransplante de linfoma. O antigénio alvo ADP-ribosiltransferase ARTC2.2 é expressa como uma GPI ancoradas na superfície celular ecto-enzima em células de linfoma de 4-9.
Nanobodies derivados de camelídeo de cadeia pesada-anticorpos só são os menores fragmentos de ligação ao antigénio disponíveis 10,11. Com apenas ~ 15 kDa, estes pequenos fragmentos de anticorpo são solúveis, e são muito estáveis eliminada da circulação pelos rins 8,10. Tpropriedades stas tornam particularmente adequado para o direcionamento específico e eficiente de antígenos tumorais in vivo 12-20. Antigénios alvos comuns de nanocorpos disponíveis são o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR1 ou HER-1), factor de crescimento epidérmico humano tipo 2 (HER-2 ou CD340), antigénio carcinoembrionário (CEA) e molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1 ) 21. Nanocorpo conjugados são ferramentas promissoras para a imunoterapia do cancro e tratamento de doenças inflamatórias 22.
Estudos recentes têm mostrado que nanocorpos permitir maior tumor-para-fundo (T / B) -ratios de anticorpos convencionais em aplicações de imagiologia in vivo moleculares 8,17,19. Isso é explicado, principalmente, pela penetração do tecido relativamente pobre e lenta de anticorpos convencionais, desembaraço lento da circulação e longo retenção nos tecidos não-alvo 23. Além disso, o excesso de anticorpos convencionais conduz a acumulação não específica itumores de antigénio-negativas alvo n causados pela permeabilidade aumentada e retenção (EPR) efectuar 24,25. Isto significa que as doses mais elevadas de anticorpos convencionais pode aumentar não só sinais específicos, mas também sinais não específicos, reduzindo, assim, a proporção máxima possível do tumor-para-fundo. Em contraste, o aumento da dose de nanocorpos aumenta os sinais de tumores antigénio-positivo mas não de tumores ou tecido normal de antigénio-negativo (dados não publicados).
Para além da comparação de nanocorpos e anticorpos convencionais, que descrevem intraindividual uma avaliação de xenoenxertos de antígeno positivos e negativos no mesmo ratos para comparação directa de sinais específicos e não-específicos, devido ao efeito EPR. Os near-infrared fluoróforo sondas conjugadas nos permitiu explorar uma única sonda in vivo e ex vivo usando imagens de fluorescência de infravermelho próximo, citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Aplicando nossos protocolos permite nãootimização radioativo, altamente sensível, e barato de experimentos in vivo de imagem molecular, tais como avaliação de novas construções de anticorpo para tumor direcionada.
O objetivo deste estudo tutorial é destacar o uso de NIRF-imaging para avaliação de novas construções de anticorpo em imagem molecular pré-clínica.
Neste protocolo, todas as experiências foram realizadas com um sistema de pequenos animais NIRF-Imaging, um classificador de células activadas por fluorescência (FACS) citómetro de fluxo, e um microscópio confocal.
Utilizou-se um fluoróforo nanocorpos marcadas próximo do infravermelho e anticorpos monoclonais convencionais dirigidos contra o mesmo alvo em células de linfoma de um comparador de multimodal em vivo e ex vivo análises. Mostrámos que nanocorpos são bem adequados como ferramentas de diagnóstico para a detecção rápida e específica in vivo de linfomas.
In vivo, s + 16a 680 permitiu a detecção rápida e mais específica de xenografts ARTC2-positivo. Para além dos diferentes cinéticas para melhor visualização do tumor in vivo, a grande desvantagem de Nika102 680 foi elevado a um sinal não específico de tumores ARTC2-negativos e os sinais espontâneos não específicos.
Analisa Ex vivo de citometria de fluxo de células dispersas de tumores dissecados não mostrou nenhuma ligação não específica de células de linfoma ARTC2 negativos de injetados AF680-conjugados. Ex vivo fluorescência revelaram forte e quase homogenous coloração de células em secções de tumor ART2C-positivo em caso de + 16a nanocorpo s, confirmando que o nanocorpo foi capaz de chegar a áreas remotas, mesmo dentro do tumor após 6 h. Em contraste, o anticorpo monoclonal mostrou coloração mais fraca e não homogénea de células em tumores ARTC2-positiva após 6 h. Os melhores resultados de imagiologia com o anticorpo convencional pode ser atingida após 24 horas ou 48 horas (dados não mostrados). A fim de realizar uma comparação exaustiva de dois constructos de tamanhos diferentes, a imagem em diferentes pontos no tempo (série de imagiologia) tem de ser realizada para identificar o ponto de tempo de imagem óptima para cada constructo.
À semelhança de outros estudos anteriores, os resultados relatados aqui enfatizar que in vivo de imagem molecular com nanobodies marcados permite imagens tumor no mesmo dia rápida e específica com alta tumor-a-fundo rácios 12-15,17-19. Ao contrário, os anticorpos convencionais resultar em baixos índices de tumor-a-fundo e sinais inespecíficos de antitumores gen-negativos início após a injeção, devido à sua lenta liberação do corpo. A fim de obter resultados de imagem ideais com anticorpos convencionais, tempo de imagem aponta 24 horas ou mesmo 48 horas após a injeção são comumente necessário. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores que sugeriram que os anticorpos convencionais com comprovado benefício terapêutico têm utilidade limitada em imagem molecular 17,19,26. Portanto anticorpos convencionais pode ser bastante adequado para fins terapêuticos, devido à sua semi-vida no plasma longa enquanto nanocorpos são bastante adequados para fins de imagem devido à sua rápida depuração da circulação. Estas diferenças são devidas ao facto de que qualquer excesso de nanocorpos as pequenas (15-17 kDa) é rapidamente eliminado através da eliminação renal enquanto o excesso de anticorpos convencionais maiores (150 kDa) é mantido na circulação. Assim, a grande vantagem do nanobodies para imagiologia molecular é o baixo sinal de fundo em pontos de tempo de imagem primeiros regardless da dose injectada. Isso permite que mesmo imaging dia e pode ser transponível para o clínico definição. Ao contrário, os anticorpos convencionais têm de ser exatamente titulada para minimizar sinais de fundo inespecíficos, mantendo sinal específico o suficiente do tecido alvo (dados não publicados).
Uma das limitações da técnica NIRF-imagiologia, in vivo, é a baixa profundidade de penetração que permitem geralmente apenas de imagiologia por via subcutânea mas não de modelos de tumores ortotópicos. Entretanto, esta limitação pode ser superada em um ambiente experimental pelas técnicas foto-acústica tomográficos recentemente desenvolvidas que permitem geração de imagens de corpo inteiro de ratos 27 vivendo. Outra limitação da técnica NIRF-imaging é a avaliação da dose de tecido em relação à geração de imagens mediada por radionuclídeo. No entanto, os nanobodies podem ser radiomarcados para a tomografia por emissão de pósitrons (PET) de modelos de xenotransplante e avaliação quantitativa exata debiodistribuição traçador. De fato, os nossos resultados NIRF-imagem estão de acordo com um recente estudo que comparou nanobodies e anticorpos convencionais para imagens de PET. Os autores também chegou à conclusão de que nanobodies permitir imagens no mesmo dia com alta tumor-a-fundo rácios 15.
No entanto, apenas a rotulagem de construções de anticorpo com o infravermelho próximo AF680 corante fluorescente permitiu a exaustiva, in vitro, in vivo e ex vivo comparação infravermelho próximo imagiologia por fluorescência por citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, e NIRF-imagiologia. Por esta razão, e porque é não radioativo, altamente sensível, barato, e usa relativamente fácil de produzir sondas específicas, defendemos o uso da técnica de NIRF-imaging para avaliação de novas construções de anticorpo em imagem molecular pré-clínica.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela escola de pós-graduação "Inflamação e regeneração" do Centro de Pesquisa Colaborativa 841 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), pelo Centro de Pesquisa Colaborativa 877 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , pela Fundação Werner Otto (Peter Bannas), pela Fundação Wilhelm Sander (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), e pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag e Friedrich Koch-Nolte). Agradecemos a University Cancer Center Hamburg (UCCH) In Vivo imagens ópticas Núcleo Facility ea equipe UKE para consulta e seu serviço de alta qualidade. A Facilidade Núcleo foi apoiado em parte por doações do Deutsche Krebshilfe (German Cancer Aid).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |