This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
Dans le présent rapport, nous décrivons la mise en œuvre du proche infrarouge fluorophores sondes marquées pour la validation des expériences in vivo dans d'imagerie de xénogreffe en utilisant ex vivo cytométrie en flux et microscopie de fluorescence des tumeurs de xénogreffe disséqués. Nous comparons une seule Nanobodies de domaine (s + 16a, 17 kDa) 1 et un anticorps monoclonal (Nika102, 150 kDa) 2,3 dirigés vers le même antigène cible pour spécifique in vivo dans le proche infrarouge imagerie de fluorescence dans un modèle de lymphome de xénogreffe. L'antigène cible ADP-ribosyltransférase ARTC2.2 est exprimée en surface cellulaire ecto-enzyme GPI ancrée par des cellules de lymphome 4-9.
Nanobodies dérivés de chaîne lourde de camélidé seule anticorps sont les plus petits disponibles fragments de liaison d'antigène 10,11. Avec seulement ~ 15 kDa, ces petits fragments d'anticorps sont solubles, très stable et sont effacés de la circulation rénale 8,10. Tes propriétés les rendent particulièrement appropriés pour le ciblage spécifique et efficace des antigènes tumoraux in vivo 12-20. Les cibles antigéniques communs de Nanobodies disponibles sont le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR1 ou HER-1), humaine croissance épidermique de type facteur 2 (HER-2 ou CD340), l'antigène carcino-embryonnaire (CEA) et l'adhésion cellulaire vasculaire molécule-1 (VCAM-1 ) 21. conjugués Nanobodies sont des outils prometteurs pour l'immunothérapie du cancer et le traitement des maladies inflammatoires 22.
Des études récentes ont montré que plus la tumeur nanocorps permettent à fond (T / B) -ratios que les anticorps classiques dans les applications d'imagerie moléculaire in vivo 8,17,19. Ceci se explique principalement par la pénétration de tissu relativement pauvre et lente des anticorps conventionnels, lente clairance de la circulation, et de longue rétention dans les tissus non ciblés 23. En outre, l'excès d'anticorps conventionnels conduit à l'accumulation non spécifique itumeurs antigène négative n cibles causées par la perméabilité et une meilleure rétention (EPR) Effet 24,25. Cela signifie que des doses plus élevées d'anticorps classiques peuvent augmenter non seulement les signaux spécifiques, mais également des signaux non spécifiques, ce qui réduit le rapport maximal réalisable tumeur à fond. En revanche, l'augmentation de la dose de Nanobodies augmente les signaux de tumeurs positives à l'antigène mais non de tissu normal ou des tumeurs de l'antigène négatif (données non publiées).
Au-delà de la comparaison des Nanobodies et anticorps classiques, nous présentons une évaluation intra-individuelle de xénogreffes antigène-positives que négatives dans la même souris pour une comparaison directe de signaux spécifiques et non spécifiques en raison de l'effet EPR. Les sondes conjugués fluorophores proche infrarouge nous a permis d'exploiter une seule sonde in vivo et ex vivo utilisant l'imagerie de fluorescence dans le proche infrarouge, cytométrie de flux, et la microscopie de fluorescence. L'application de nos protocoles permet nonoptimisation radioactive, très sensible, et peu coûteuse des expériences in vivo moléculaires d'imagerie telles que l'évaluation de nouvelles constructions d'anticorps spécifique de la tumeur pour le ciblage.
L'objectif de cette étude de tutoriel est de mettre en évidence l'utilisation de NIRF-imagerie pour l'évaluation de nouvelles constructions d'anticorps dans l'imagerie moléculaire préclinique.
Dans ce protocole, toutes les expériences ont été réalisées avec un système NIRF-imagerie des petits animaux, un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS) cytomètre en flux, et un microscope confocal.
Nous avons utilisé le proche infrarouge fluorophores nanocorps marqués et d'anticorps monoclonaux conventionnels dirigés contre la même cible sur les cellules de lymphome pour une comparaison multimodale in vivo et ex vivo analyses. Nous avons montré que nanocorps sont bien adaptés comme outils de diagnostic pour la détection rapide et spécifique in vivo des lymphomes.
In vivo, s + 16a 680 permis une détection rapide et plus spécifique de xénogreffes de ARTC2 positif. Outre les différentes cinétiques pour un affichage optimal de la tumeur in vivo, l'inconvénient majeur de Nika102 680 était le signal non spécifique élevée de tumeurs et de signaux de fond non spécifiques ARTC2 négatif.
Analyse ex vivo cytométrie de flux de cellules dispersées provenant de tumeurs disséquées ont montré aucune liaison non spécifique à des cellules de lymphome ARTC2 négatif de AF680-conjugués injectés. Ex vivo ont révélé une forte fluorescence et presque homogèneous coloration des cellules tumorales dans les sections ART2C-positive en cas de + 16a de la nanocorps, confirmant que le nanocorps était en mesure d'atteindre les zones reculées, même au sein de la tumeur après 6 h. En revanche, l'anticorps monoclonal a présenté une coloration plus faible et homogène de cellules dans les tumeurs ARTC2 positif après 6 heures. Résultats de l'imagerie mieux avec les anticorps classique peuvent être atteints après 24 h ou 48 h (données non présentées). Pour effectuer une comparaison approfondie des deux constructions différentes tailles, imagerie à des moments différents (série-imagerie) doit être effectuée pour identifier le point de temps d'imagerie optimale pour chaque construction.
Comme d'autres études antérieures, les résultats présentés ici soulignent que in vivo l'imagerie moléculaire avec nanocorps marqués permet l'imagerie de la tumeur même jour rapide et spécifique avec une grande tumeur à-fond ratios 12-15,17-19. Au contraire, les anticorps conventionnels aboutissent à de faibles ratios tumeur à-fond et les signaux non spécifiques de lutte contretumeurs gen-négatives début après l'injection en raison de leur lente clairance du corps. Afin d'obtenir des résultats d'imagerie optimales avec des anticorps conventionnels, le temps d'imagerie fait 24 heures ou même 48 heures après l'injection sont généralement nécessaires. Ces résultats sont en accord avec les études antérieures qui ont suggéré que les anticorps classiques avec un bénéfice thérapeutique avéré ont une utilité limitée en imagerie moléculaire 17,19,26. Par conséquent anticorps conventionnels pourraient être plutôt adapté à des fins thérapeutiques en raison de leur longue demi-vie plasmatique tout nanocorps sont plutôt adaptés à des fins d'imagerie en raison de leur élimination rapide de la circulation. Ces différences sont dues au fait que l'excédent des petits nanocorps (15-17 kDa) est rapidement éliminé par l'élimination rénale tout excès d'anticorps conventionnels plus grands (150 kDa) est retenu dans la circulation. Donc, l'avantage majeur de nanocorps pour l'imagerie moléculaire est le signal de fond bas à des moments d'imagerie début regardless de la dose injectée. Cela permet même imagerie par jour et pourrait être traduisible au réglage. Au contraire cliniques, les anticorps conventionnels doivent être exactement titré à minimiser les signaux de fond non spécifiques, tout en conservant suffisamment de signal spécifique du tissu ciblé (données non publiées).
L'une des limitations de la technique in vivo d'imagerie NIRF est la faible profondeur de pénétration qui permet généralement de l'imagerie sous-cutanée uniquement mais non de modèles de tumeur orthotopique. Toutefois, cette limitation pourrait être surmonté dans un cadre expérimental par les techniques de photo-acoustique tomographiques récemment développées qui permettent imagerie du corps entier de la vie des souris 27. Une autre limite de la technique d'imagerie NIRF est l'évaluation de la dose de tissu par rapport à l'imagerie par radionucléide médiée. Cependant, les Nanobodies peuvent être radiomarqués pour la tomographie par émission de positons (TEP) de modèles de xénogreffes et évaluation quantitative exacte detraceur biodistribution. En effet, nos résultats NIRF-imagerie sont conformes à une récente étude qui a comparé nanocorps et des anticorps conventionnels pour l'imagerie PET. Les auteurs sont également venus à la conclusion que nanocorps permettent imagerie même jour avec une grande tumeur à-fond rapports 15.
Cependant, seul le marquage de produits d'assemblage d'anticorps avec le proche infrarouge de colorant fluorescent AF680 nous a permis la complète in vitro, in vivo et ex vivo comparaison proche infrarouge imagerie par fluorescence en utilisant la cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, et NIRF-imagerie. Pour cette raison, et parce qu'il est non radioactif, très sensible, peu coûteux, et utilise relativement facile à produire des sondes ciblées, nous préconisons l'utilisation de la technique NIRF-imagerie pour l'évaluation de nouvelles constructions d'anticorps dans l'imagerie moléculaire préclinique.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l'école doctorale «Inflammation et la régénération» du Centre de recherche en collaboration 841 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), par le Centre de recherche en collaboration 877 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , par la Fondation Werner Otto (Peter Bannas), par la Fondation Wilhelm Sander (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), et par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag et Friedrich Koch-Nolte). Nous remercions l'Université Cancer Center Hamburg (UCCH) dans un établissement de Vivo optique Imaging Core et le personnel de l'UKE de consultation et de leur service de haute qualité. L'installation de base a été financé en partie par des subventions de Deutsche Krebshilfe (Aide allemande contre le cancer).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |