This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
I den foreliggende rapport beskriver vi implementeringen af nær-infrarøde fluorophormærket prober til validering af in vivo xenograft billeddannelse eksperimenter ved hjælp af ex vivo flowcytometri og fluorescens mikroskopi af de dissekerede xenotransplantattumorer. Vi sammenligner et enkelt domæne nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 og et monoklonalt antistof (Nika102, 150 kDa) 2,3 rettet mod det samme mål antigen til specifik in vivo nær-infrarød fluorescens billeddannelse i et lymfom xenograft model. Målantigenet ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 udtrykkes som et GPI-forankret celleoverflade ecto-enzymet ved lymfomceller 4-9.
Nanobodies afledt fra kamel tung-kæde kun antistoffer er den mindste tilgængelige antigenbindende fragmenter 10,11. Med kun ~ 15 kDa, disse små antistoffragmenter er opløselige, meget stabil og er renalt fjernet fra omløb 8,10. Tisse egenskaber gør dem særligt velegnede til specifik og effektiv målretning af tumorantigener in vivo 12-20. Fælles antigen mål for tilgængelige nanobodies er epidermal vækstfaktor receptor (EGFR1 eller HER-1), human epidermal vækstfaktor type 2 (HER-2 eller CD340), carcinoembryonisk antigen (CEA) og vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody konjugater er lovende redskaber til cancerimmunterapi og behandling af inflammatoriske sygdomme 22.
Nylige undersøgelser har vist, at nanobodies tillader højere tumor-til-baggrund (T / B) -ratios end konventionelle antistoffer i in vivo molekylære billeddannelsesanvendelser 8,17,19. Dette forklares hovedsageligt af den relativt dårlige og langsomme vævspenetration af konventionelle antistoffer, langsom clearance af cirkulation og lang opholdstid i ikke-målrettet væv 23. Desuden overskud af konventionelle antistoffer fører til uspecifik akkumulering in målantigen-negative tumorer forårsaget af den øgede permeabilitet og fastholdelse (EPR) effektuere 24,25. Dette betyder, at højere doser af konventionelle antistoffer kan øge ikke kun specifikke signaler, men også ikke-specifikke signaler, hvorved den maksimalt opnåelige tumor-til-baggrund-forholdet. I modsætning hertil at øge dosis af nanobodies øger signalerne fra antigen-positive tumorer, men ikke af normalt væv eller antigen-negative tumorer (upublicerede data).
Ud over sammenligningen af nanobodies og konventionelle antistoffer, vi skitsere en intraindividuelle vurdering af antigen-positive og -negative xenotransplantater i samme mus til direkte sammenligning af konkrete og uspecifikke signaler på grund af EPR effekt. De nær-infrarøde fluorofor konjugerede prober tilladt os at udnytte en enkelt probe in vivo og ex vivo under anvendelse af nær-infrarødt fluorescensimagografi, flowcytometri, og fluorescensmikroskopi. Anvende vores protokoller giver mulighed for ikkeradioaktive, meget følsomme, og billig optimering af in vivo molekylære billeddiagnostiske eksperimenter såsom evaluering af nye antistofkonstruktioner for målretning specifik tumor.
Formålet med denne tutorial undersøgelse er at fremhæve brugen af NIRF-billeddannelse til vurdering af nye antistofkonstruktioner i præklinisk molekylær billeddannelse.
I denne protokol, blev alle eksperimenter udført med et lille dyr NIRF-Imaging-system, en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) flowcytometer og et konfokalt mikroskop.
Vi brugte nærinfrarøde fluorophormærket nanobodies og konventionelle monoklonale antistoffer rettet mod det samme mål om lymfomceller til en multimodal sammenligning af in vivo og ex vivo analyser. Vi viste, at nanobodies er velegnede som diagnostiske værktøjer til hurtig og specifik in vivo detektion af lymfomer.
In vivo, S + 16a 680 tillod en hurtig og mere specifik påvisning af ARTC2-positive xenotransplantater. Bortset fra de forskellige kinetik for bedste tumor visualisering in vivo, den største ulempe ved Nika102 680 var den høje uspecifik signal fra ARTC2-negative tumorer og ikke-specifikke baggrundssignaler.
Ex vivo flowcytometrisk analyse af dispergerede celler fra dissekerede tumorer viste ingen specifik binding til ARTC2-negative lymfomceller af indsprøjtet AF680-konjugater. Ex vivo fluorescens afslørede stærk og næsten homogeneskellige farvning af celler i ART2C-positive tumorsnit i tilfælde af nanobody s + 16a, der bekræfter, at nanobody kunne nå endnu fjerntliggende områder i tumoren efter 6 timer. I modsætning hertil det monoklonale antistof viste svagere og uhomogen farvning af celler i ARTC2-positive tumorer efter 6 timer. Bedre imaging resultater med den konventionelle antistof kan opnås efter 24 timer eller 48 timer (data ikke vist). For at udføre en grundig sammenligning af to forskellige størrelser konstruktioner billeddannelse på forskellige tidspunkter (seriel-billeddannelse) skal udføres for at identificere den optimale imaging tidspunktet for hver konstruktion.
Ligesom andre tidligere undersøgelser, hvis resultater rapporteret her understrege, at in vivo-molekylær billeddannelse med mærkede nanobodies muliggør hurtig og konkret samme dag tumorafbildning med høj tumor-til-baggrund nøgletal 12-15,17-19. Omvendt konventionelle antistoffer resulterer i lave tumor-til-baggrund nøgletal og ikke-specifikke signaler fra antiGen-negative tumorer tidligt efter injektion på grund af deres langsomme clearance fra kroppen. For at opnå optimale billeddannende resultater med konventionelle antistoffer, afbildningstiden punkt 24 timer eller endda 48 timer efter injektion er almindeligvis nødvendig. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der har foreslået, at konventionelle antistoffer med dokumenteret terapeutisk fordel har begrænset anvendelighed i molekylær billeddannelse 17,19,26. Derfor konventionelle antistoffer kan være temmelig egnet til terapeutiske formål på grund af deres lange plasmahalveringstid mens nanobodies er temmelig egnet til billeddannelsesformål på grund af deres hurtige clearance fra kredsløbet. Disse forskelle skyldes, at eventuelle overskydende af de mindre nanobodies (15-17 kDa) hurtigt ryddes via renal elimination mens over større konventionelle antistoffer (150 kDa) fastholdes i kredsløbet. Så den store fordel af nanobodies for molekylær billeddannelse er den lave baggrund signal på tidlige imaging tidspunkter regardless af den injicerede dosis. Dette giver samme dag billeddannelse og kan være overføres til et klinisk miljø. Omvendt konventionelle antistoffer at være nøjagtigt titreres for at minimere ikke-specifikke baggrundssignaler, samtidig med at tilstrækkeligt specifikt signal fra målvævet (upublicerede data).
En af begrænsningerne for in vivo NIRF-imaging teknik er lav indtrængningsdybde som generelt kun tillader billeddannelse af subkutan men ikke ortotopisk tumormodeller. Men denne begrænsning overvindes i en eksperimentel indstilling fra de nyligt udviklede tomografiske foto-akustiske teknikker, der tillader hele kroppen billeddannelse af levende mus 27. En anden begrænsning af NIRF-imaging teknik er vurderingen af dosis væv sammenlignet med radionuklid-medieret billeddannelse. Imidlertid kan nanobodies mærkes radioaktivt til positronemissionstomografi (PET) billeddannelse af xenograftmodeller og præcis kvantitativ vurdering afsporstof biofordeling. Faktisk vores NIRF billeddannelse resultater er i overensstemmelse med en nylig undersøgelse, som sammenlignede nanobodies og konventionelle antistoffer for PET imaging. Forfatterne kom også til den konklusion, at nanobodies tillader samme dag billeddannelse med høj tumor-til-baggrund nøgletal 15.
Men kun mærkning af antistof-konstruktioner med nær-infrarødt fluorescerende farvestof AF680 tilladt os omfattende in vitro, in vivo og ex vivo nærinfrarøde fluorescensimagografi sammenligning ved anvendelse af flowcytometri, fluorescensmikroskopi, og NIRF-billeddannelse. Af denne grund, og fordi det er ikke-radioaktiv, meget følsom, billig og anvender forholdsvis let at fremstille målrettede prober, vi går anvendelsen af NIRF-imaging teknik til evaluering af nye antistofkonstruktioner i præklinisk molekylær billeddannelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af forskerskolen "Inflammation og regenerering« af Collaborative Research Centre 841 af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin kunick, William fumey), ved Collaborative Research Centre 877 af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) ved Werner Otto Foundation (Peter bannas), som Wilhelm Sander Foundation (Peter bannas, Friedrich Koch-Nolte), og af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag og Friedrich Koch-Nolte). Vi takker University Cancer Center Hamburg (UCCH) In vivo Optical Imaging Core Facility og personale på UKE til høring, og deres service af høj kvalitet. Core Facility blev støttet delvist af tilskud fra Deutsche Krebshilfe (tysk Cancer Aid).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |