This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
I denne rapporten beskriver vi gjennomføringen av nær-infrarøde fluoroformerket prober for validering av in vivo xenograft bildebehandling eksperimenter ved hjelp av ex vivo flowcytometri og fluorescens mikroskopi av de dissekerte xenografttumorer. Vi sammenligner et enkelt domene nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 og et monoklonalt antistoff (Nika102, 150 kDa) 2,3 rettet mot samme mål antigen for spesifikk in vivo nær-infrarøde fluorescens bildebehandling i en lymfom xenograft modell. Målantigenet ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 uttrykkes som et GPI-forankret celleoverflate ecto-enzym ved lymfomceller 4-9.
Nanobodies avledet fra camelid tungkjede-antistoffer er bare de minste tilgjengelige antigenbindende fragmenter 10,11. Med bare ~ 15 kDa, disse små antistoffragmenter er løselig, veldig stabil og er nedsatt fjernet fra sirkulasjon 8,10. These egenskaper gjør dem spesielt egnet for spesifikke og effektiv målretting av tumorantigener in vivo 12-20. Vanlige antigen mål av tilgjengelige Nanobodies er den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR1 eller HER-1), human epidermal vekstfaktor type 2 (HER-2 eller CD340), karsinoembryonalt antigen (CEA) og vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody konjugater er lovende verktøy for kreftimmunterapi og behandling av inflammatoriske sykdommer 22.
Nyere studier har vist at Nanobodies tillate høyere tumor-til-bakgrunn (T / B) -ratios enn konvensjonelle antistoffer i in vivo molekylavbildningsapplikasjoner 8,17,19. Dette forklares hovedsakelig av forholdsvis dårlig og treg vevspenetrasjon av konvensjonelle antistoffer, langsom klaring fra sirkulasjon, og lang oppholdstid i ikke-målrettede vev 23. Videre overskudd av konvensjonelle antistoffer fører til ikke-spesifikk akkumulering in target antigennegative svulster forårsaket av økt permeabilitet og oppbevaring (EPJ) effekt 24,25. Dette betyr at høyere doser av konvensjonelle antistoffer kan øke ikke bare bestemte signaler, men også ikke-spesifikke signaler, og dermed redusere den maksimale oppnåelige tumor-til-bakgrunnsforhold. I motsetning til dette, å øke dosen av Nanobodies øker signalene fra antigen-positive tumorer, men ikke fra normalt vev eller antigen-negative tumorer (upubliserte data).
Utover sammenligning av Nanobodies og konvensjonelle antistoffer, vi skissere en intra-individuell vurdering av antigen-positive og -negative xenotransplantater i samme mus for direkte sammenligning av spesifikke og ikke-spesifikke signaler på grunn av EPR virkning. De nær-infrarødt fluoroforpar konjugerte sonder tillatt oss å utnytte en enkelt sonde in vivo og ex vivo bruker nær-infrarødt fluorescens bildebehandling, flowcytometri, og fluorescens mikroskopi. Anvende våre protokoller tillater ikkeradioaktive, svært følsom, og billig optimalisering av in vivo molekylær avbildning eksperimenter slik som evaluering av nye antistoff konstruksjoner for spesifikk svulst målretting.
Målet med denne opplæringen studien er å synliggjøre bruken av NIRF-avbildning for evaluering av nye antistoff konstruksjoner i preklinisk molekylær avbildning.
I denne protokoll ble alle eksperimenter utført med en liten dyre NIRF-avbildningssystem, en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) strømningscytometer og et konfokalt mikroskop.
Vi brukte nær-infrarøde fluoroformerket Nanobodies og konvensjonelle monoklonale antistoffer rettet mot det samme mål på lymfomceller for en multimodal sammenligning av in vivo og ex vivo-analyser. Vi viste at Nanobodies er godt egnet som diagnostisk verktøy for rask og spesifikk in vivo påvisning av lymfomer.
In vivo, s + 16a 680 tillates en rask og mer spesifikk påvisning av ARTC2-positive xenotransplantater. Bortsett fra de forskjellige kinetikk for beste tumor visualisering in vivo, den store ulempen med Nika102 680 var høy spesifikk signal fra ARTC2-negative tumorer og ikke-spesifikke bakgrunnssignaler.
Ex vivo flowcytometrisk analyser av spredte celler fra dissekert svulster viste ingen spesifikk binding til ARTC2-negative lymfomaceller av injisert AF680-konjugater. Ex vivo fluorescens avdekket sterk og nesten homogenOUS farging av celler i ART2C-positive tumorsnitt i tilfelle nanobody s + 16a, som bekrefter at nanobody var i stand til å nå enda fjerntliggende områder innen svulsten etter 6 timer. I motsetning til dette, det monoklonale antistoff viste svakere og inhomogene farging av celler i ARTC2-positive tumorer etter 6 timer. Bedre avbildningsresultater med den konvensjonelle antistoff kan oppnås etter 24 timer eller 48 timer (data ikke vist). For å utføre en grundig sammenligning av to forskjellige størrelser konstruksjoner, har avbildning ved forskjellige tidspunkter (seriell-imaging) som skal utføres for å finne optimale avbildnings tidspunkt for hver konstruksjon.
Som andre tidligere studier, resultatene som presenteres her understreke at in vivo molekylær avbildning med merkede Nanobodies tillater rask og bestemt samme dag svulst bildebehandling med høy tumor-til-bakgrunn forholdstall 12-15,17-19. Tvert imot, konvensjonelle antistoffer føre til lave tumor-til-bakgrunn forholdstall og uspesifikke signaler fra antigen-negative svulster tidlig etter injeksjon på grunn av deres sakte klaring fra kroppen. For å oppnå optimale bilderesultater med konvensjonelle antistoffer, påpeker bildebehandling tid 24 timer eller 48 timer etter injeksjon er ofte nødvendig. Disse funnene er i tråd med tidligere studier som har antydet at konvensjonelle antistoffer med bevist terapeutisk effekt har begrenset nytte i molekylær avbildning 17,19,26. Derfor er konvensjonelle antistoffer kan være ganske egnet for terapeutiske formål på grunn av sin lange halveringstid i plasma, mens Nanobodies er ganske egnet for avbildningsformål på grunn av deres hurtige clearance fra sirkulasjonen. Disse forskjellene skyldes det faktum at en hvilken som helst overskudd av de mindre Nanobodies (15-17 kDa) blir raskt fjernet via renal utskillelse, mens overskudd av større konvensjonelle antistoffer (150 kDa) er holdt tilbake i sirkulasjon. Så den store fordelen av Nanobodies for molekylær avbildning er den lave bakgrunnssignal ved tidlige bilde tidspunkter regardless av den injiserte dose. Dette gjør at samme dag avbildning og kan være forflyttbar i klinisk sammenheng. Omvendt, konvensjonelle antistoffer må nøyaktig kontrolleres for å minimalisere ikke-spesifikke bakgrunnssignaler, og samtidig opprettholde tilstrekkelig spesifikke signal fra målvevet (upubliserte data).
En av begrensningene i den in vivo NIRF-avbildningsteknikk er den lave inntrengningsdybde som generelt bare tillater avbildning av subkutan, men ikke av ortotopiske tumormodeller. Imidlertid kan denne begrensningen overvinnes i en eksperimentell innstilling av den nylig utviklede tomografiske fotoakustiske teknikker som gjør at hele kroppen avbildning av levende mus 27. En annen begrensning av NIRF-avbildningsteknikk er vurderingen av vev dose i forhold til radionuklide-mediert bildebehandling. Imidlertid kan Nanobodies bli radiomerket for positronemisjonstomografi (PET) avbildning av xenograft-modeller og presis kvantitativ vurdering avtracer biodistribusjon. Faktisk våre NIRF-MRI-resultatene er i samsvar med en fersk studie som sammenlignet Nanobodies og konvensjonelle antistoffer for PET billeddiagnostikk. Forfatterne kom også til den konklusjon at Nanobodies tillate samme dag bildebehandling med høy tumor-til-bakgrunn forholdstall 15.
Men bare merking av antistoff konstruksjoner med nær-infrarød fluorescerende fargestoff AF680 tillatt oss den omfattende in vitro, in vivo og ex vivo nær-infrarødt fluorescens bildebehandling sammenligning ved hjelp av flowcytometri, fluorescens mikroskopi, og NIRF-bildebehandling. Av denne grunn, og fordi det er ikke-radioaktivt, svært følsom, billig, og bruker relativt enkel å produsere målrettede sonder, vi argumentere for bruk av NIRF-avbildningsteknikk for evaluering av nye antistoff konstruksjoner i preklinisk molekylær avbildning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av graduate school "Betennelse og regenerering" av Collaborative Research Centre 841 av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William fumey), av Collaborative Research Centre 877 av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , av Werner Otto Foundation (Peter Bannas), ved Wilhelm Sander Foundation (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), og ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag og Friedrich Koch-Nolte). Vi takker Universitetet Cancer Center Hamburg (UCCH) In Vivo Optisk Imaging Core Facility og ansatte ved UKE for konsultasjon og sin høye kvalitet. The Core Facility ble støttet delvis med tilskudd fra Deutsche Krebshilfe (tysk Cancer Aid).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |