This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
वर्तमान रिपोर्ट में, हम पूर्व vivo विच्छेदित xenograft ट्यूमर के प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इन विवो xenograft इमेजिंग प्रयोगों के सत्यापन के लिए लगभग अवरक्त फ्लोरोफोरे में लेबल जांच के कार्यान्वयन का वर्णन है। हम एक डोमेन nanobody (एस + 16A, 17 केडीए) एक और vivo में विशिष्ट के लिए एक ही लक्ष्य प्रतिजन के लिए निर्देशित एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (Nika102, 150 केडीए) 2,3 तुलना अवरक्त के पास एक लिंफोमा xenograft मॉडल में प्रतिदीप्ति इमेजिंग। लक्ष्य प्रतिजन ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 लिंफोमा कोशिकाओं 4-9 से एक जीपीआई-लंगर कोशिका की सतह Ecto-एंजाइम के रूप में व्यक्त किया जाता है।
Camelid से निकाली गई Nanobodies भारी चेन केवल एंटीबॉडी सबसे छोटी उपलब्ध प्रतिजन बाध्यकारी टुकड़े 10,11 हैं। केवल ~ 15 केडीए के साथ, इन छोटे एंटीबॉडी टुकड़े, घुलनशील बहुत स्थिर रहे हैं और renally परिसंचरण 8,10 से मंजूरी दे दी है। टीhese गुण विवो 12-20 में ट्यूमर एंटीजन के विशिष्ट और कुशल लक्ष्यीकरण के लिए उन्हें विशेष रूप से अनुकूल बनाते हैं। उपलब्ध nanobodies की आम प्रतिजन लक्ष्य (EGFR1 या उसके -1), मानव epidermal वृद्धि कारक टाइप 2 (उसे-2 या CD340), एंटीजन (सीईए) और नाड़ी कोशिका आसंजन अणु-1 (Vcam-एक epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर हैं ) 21। Nanobody conjugates के भड़काऊ रोगों 22 के कैंसर प्रतिरक्षा चिकित्सा और उपचार के लिए होनहार उपकरण हैं।
हाल के अध्ययनों से उच्च ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि (टी / बी) में विवो आणविक इमेजिंग अनुप्रयोगों 8,17,19 में पारंपरिक एंटीबॉडी से -ratios nanobodies अनुमति देते हैं कि पता चला है। इस गैर-लक्षित ऊतकों 23 में पारंपरिक एंटीबॉडी, प्रचलन से धीमी गति से निकासी, और लंबे समय तक बनाए रखने के अपेक्षाकृत गरीब और धीमी गति से ऊतक पैठ द्वारा मुख्य रूप से समझाया गया है। इसके अलावा, पारंपरिक एंटीबॉडी के अतिरिक्त गैर विशिष्ट संचय मैं करने के लिए सुरागबढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) की वजह से एन लक्ष्य प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर 24,25 प्रभाव। इस पारंपरिक एंटीबॉडी की अधिक मात्रा इस प्रकार अधिकतम प्राप्त ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात को कम करने, विशिष्ट संकेतों लेकिन यह भी अविशिष्ट संकेतों को न केवल वृद्धि हो सकती है कि इसका मतलब है। इसके विपरीत, nanobodies की खुराक में वृद्धि नहीं बल्कि सामान्य ऊतक या प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर (अप्रकाशित डेटा) के प्रतिजन पॉजिटिव ट्यूमर के संकेत बढ़ जाती है।
Nanobodies और पारंपरिक एंटीबॉडी की तुलना से परे है, हम कारण EPR प्रभाव के लिए विशिष्ट और nonspecific संकेतों के प्रत्यक्ष तुलना के लिए एक ही चूहों में प्रतिजन सकारात्मक और -negative xenografts की एक intraindividual आकलन रूपरेखा। लगभग अवरक्त फ्लोरोफोरे संयुग्मित जांच में अमेरिका, लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग vivo और पूर्व vivo में एक भी जांच का फायदा उठाने के प्रवाह cytometry, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की अनुमति दी। हमारे प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए गैर की अनुमति देता हैऐसे विशिष्ट ट्यूमर लक्षित करने के लिए नई एंटीबॉडी निर्माणों के मूल्यांकन के रूप में विवो आणविक इमेजिंग प्रयोगों की, रेडियोधर्मी अत्यधिक संवेदनशील है, और सस्ती अनुकूलन।
इस ट्यूटोरियल अध्ययन का उद्देश्य पूर्व नैदानिक आणविक इमेजिंग में नई एंटीबॉडी निर्माणों के मूल्यांकन के लिए NIRF-इमेजिंग के उपयोग पर प्रकाश डाला है।
इस प्रोटोकॉल में, सभी प्रयोगों एक छोटे पशु NIRF-इमेजिंग प्रणाली के साथ प्रदर्शन कर रहे थे, एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) कोशिकामापी प्रवाह है, और एक confocal खुर्दबीन।
हम इन विवो और पूर्व vivo विश्लेषण के बहुविध तुलना के लिए लिंफोमा कोशिकाओं पर एक ही लक्ष्य के खिलाफ निर्देशित लगभग अवरक्त फ्लोरोफोरे में लेबल nanobodies और पारंपरिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। हम nanobodies अच्छी तरह से लिम्फोमा के तेजी से और विशिष्ट vivo में पता लगाने के लिए नैदानिक उपकरण के रूप में उपयुक्त हैं कि पता चला है।
विवो में, + 16A 680 ARTC2 पॉजिटिव xenografts की एक तेजी से और अधिक विशिष्ट पहचान के लिए अनुमति दी है। इसके अलावा इन विवो में सबसे अच्छा ट्यूमर दृश्य के लिए अलग कैनेटीक्स से, Nika102 680 की बड़ी खामी ARTC2 नकारात्मक ट्यूमर और अविशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों से उच्च अविशिष्ट संकेत था।
विच्छेदित ट्यूमर इंजेक्ट AF680-conjugates की ARTC2 नकारात्मक लिंफोमा कोशिकाओं को कोई अविशिष्ट बंधन दिखाया से पूर्व vivo प्रवाह cytometric छितरी कोशिकाओं का विश्लेषण करती है। पूर्व vivo प्रतिदीप्ति लगभग homogen मजबूत पता चला है औरnanobody 6 घंटे के बाद ट्यूमर के भीतर भी दूरदराज के क्षेत्रों तक पहुँचने में सक्षम था कि इस बात की पुष्टि nanobody एस + 16A के मामले में ART2C पॉजिटिव ट्यूमर वर्गों में कोशिकाओं के ous धुंधला,। इसके विपरीत, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 6 घंटा बाद ARTC2 पॉजिटिव ट्यूमर में कोशिकाओं के कमजोर और inhomogeneous धुंधला दिखाया। पारंपरिक एंटीबॉडी के साथ बेहतर इमेजिंग परिणाम 24 घंटा या 48 घंटे के बाद हासिल किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया। दो अलग आकार निर्माणों की एक पूरी तरह से तुलना प्रदर्शन करने के लिए आदेश में, अलग अलग समय बिंदुओं (धारावाहिक-इमेजिंग) में इमेजिंग प्रत्येक निर्माण के लिए इष्टतम इमेजिंग समय बिंदु की पहचान करने के लिए किया जाना है।
अन्य पिछले अध्ययनों की तरह, यहां बताया परिणामों विवो में लेबल nanobodies साथ आणविक इमेजिंग उच्च ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात 12-15,17-19 के साथ तेजी से और विशिष्ट उसी दिन ट्यूमर इमेजिंग की अनुमति देता है कि जोर। उल्टे, पारंपरिक एंटीबॉडी कम ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात और विरोधी से अविशिष्ट संकेतों में परिणामकारण शरीर से उनकी धीमी गति से निकासी के लिए जल्दी इंजेक्शन के बाद जनरल नकारात्मक ट्यूमर। पारंपरिक एंटीबॉडी के साथ इष्टतम इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए, इमेजिंग समय 24 घंटा या इंजेक्शन आमतौर पर आवश्यक हैं के बाद भी 48 घंटा बताते हैं। इन निष्कर्षों को सिद्ध चिकित्सीय लाभ के साथ पारंपरिक एंटीबॉडी आणविक इमेजिंग 17,19,26 में उपयोगिता सीमित है कि सुझाव दिया है कि पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में हैं। Nanobodies कारण प्रचलन से उनके तेजी से निकासी के लिए इमेजिंग उद्देश्यों के लिए नहीं बल्कि अनुकूल हैं, जबकि इसलिए पारंपरिक एंटीबॉडी की वजह से उनकी लंबी प्लाज्मा आधा जीवन के लिए उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए नहीं बल्कि उपयुक्त हो सकता है। इन मतभेदों को बड़ा पारंपरिक एंटीबॉडी (150 केडीए) से अधिक प्रचलन में बरकरार रखा गया है, जबकि छोटे nanobodies (15-17 केडीए) के किसी भी अधिक तेजी से गुर्दे उन्मूलन के माध्यम से मंजूरी दे दी है कि इस तथ्य के कारण हैं। तो आणविक इमेजिंग के लिए nanobodies के प्रमुख लाभ जल्दी इमेजिंग समय बिंदुओं पर कम पृष्ठभूमि संकेत है regardlइंजेक्शन की खुराक की ईएसएस। यह वही दिन इमेजिंग की अनुमति देता है और नैदानिक सेटिंग। उल्टे करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है, पारंपरिक एंटीबॉडी बिल्कुल लक्षित ऊतक (अप्रकाशित डेटा) से काफी विशिष्ट संकेत बनाए रखते हुए, अविशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों को कम से कम करने के लिए titrated किया जाना है।
इन विवो NIRF-इमेजिंग तकनीक की सीमाओं में से एक आम तौर पर नहीं बल्कि Orthotopic ट्यूमर मॉडल के चमड़े के नीचे का केवल इमेजिंग की अनुमति देता है जो कम प्रवेश गहराई है। हालांकि, इस सीमा चूहों 27 रहने के पूरे शरीर इमेजिंग की अनुमति है कि हाल ही में विकसित tomographic तस्वीर ध्वनिक तकनीक से एक प्रयोगात्मक सेटिंग में दूर किया जा सकता है। रेडियोन्यूक्लाइड की मध्यस्थता इमेजिंग की तुलना में NIRF-इमेजिंग तकनीक की एक और सीमा ऊतक खुराक का आकलन है। हालांकि, nanobodies xenograft मॉडल और की सटीक मात्रात्मक मूल्यांकन के पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग के लिए radiolabelled किया जा सकता हैदरियाफ्त biodistribution। दरअसल, हमारे NIRF-इमेजिंग परिणाम nanobodies और पीईटी इमेजिंग के लिए पारंपरिक एंटीबॉडी की तुलना में है कि हाल के एक अध्ययन के अनुसार कर रहे हैं। लेखकों को भी nanobodies उच्च ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात 15 के साथ एक ही दिन इमेजिंग की अनुमति देते हैं कि इस निष्कर्ष पर आया था।
हालांकि, लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक AF680 के साथ एंटीबॉडी निर्माणों में से सिर्फ लेबलिंग विवो में, हमें इन विट्रो में व्यापक अनुमति दी है और पूर्व vivo लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति इमेजिंग तुलना, प्रवाह cytometry प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और NIRF-इमेजिंग का उपयोग। यह nonradioactive सस्ती, अत्यधिक संवेदनशील है, और अपेक्षाकृत आसान करने के लिए उत्पादन लक्षित जांच का उपयोग करता है, क्योंकि इस कारण से, और, हम पूर्व नैदानिक आणविक इमेजिंग में नई एंटीबॉडी निर्माणों के मूल्यांकन के लिए NIRF-इमेजिंग तकनीक के उपयोग की वकालत।
The authors have nothing to disclose.
इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft की सहयोगात्मक अनुसंधान केन्द्र 877 (फ्रेडरिक कोच-नोल्टे) से ग्रेजुएट स्कूल 'शोथ और उत्थान' ड्यूश Forschungsgemeinschaft की सहयोगात्मक अनुसंधान केन्द्र 841 (सिकंदर लेन्ज, वैलेन्टिन Kunick, विलियम Fumey) के द्वारा समर्थित किया गया , विल्हेम Sander फाउंडेशन द्वारा वर्नर ओटो फाउंडेशन (पीटर Bannas), (पीटर Bannas, फ्रेडरिक कोच-नोल्टे), द्वारा और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (मार्टिन Trepel, फ्रेडरिक हाग और फ्रेडरिक कोच-नोल्टे) द्वारा। हम विवो ऑप्टिकल इमेजिंग कोर सुविधा और कर्मचारियों uke पर परामर्श के लिए और उनके उच्च गुणवत्ता सेवा में विश्वविद्यालय के कैंसर केंद्र हैम्बर्ग (UCCH) धन्यवाद। कोर सुविधा ड्यूश Krebshilfe (जर्मन कैंसर चिकित्सा) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |