Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجربة من قبل اللجنة تجارب على الحيوانات والأخلاق الفرنسية والتحقق من صحتها من قبل "حماية خدمة آخرون سانتيه Animales، للبيئة" مع عدد A-75-2065. ويتم اختيار عينة الأحجام لضمان استنساخ التجارب، وفقا ل3R التنظيم أخلاقيات الحيوان.
1. إعداد الماوس
- التخدير
- لفترة قصيرة من التصوير (أقل من 1 ساعة)، تخدير الماوس مع حقنة داخل الصفاق من 200 ميكرولتر من محلول ملحي يحتوي على الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ).
- بدلا من ذلك، لفترة أطول من التصوير (تصل إلى 4 ساعات)، تخدير الماوس مع استنشاق الأيزوفلورين 2.5٪ المتبخرة في 70/30 خليط من O 2 / N 2 O، من خلال قناع تكييفها.
- ملاحظة: توفر هذه الطريق لفقدان الوعي أكثر استقرارا ويتجنب التسلسلي حقن داخل الصفاق من المخدرات. مرة واحدة يتم تخدير الماوس، تحقق من فقدان الوعي من خلال تحفيز لوحة القدم مع كماشة.
- تلطيخ الأوعية الدموية / تلطيخ إضافية
- لتلطيخ الأوعية الدموية: حقن عن طريق الوريد في الوريد الذيل، 200 ميكرولتر من Rhodamin-ديكستران (2 نجمة داود الحمراء، و 10 ملغ / مل في المخزن المالحة).
- لالعدلات تلطيخ: حقن 2 ميكروغرام من Ly6G-PE (استنساخ 1A8) في 100 ميكرولتر من محلول ملحي في الوريد في الوريد الذيل.
- تجميد
- لتجميد، واستخدام حامل المجسم العرف تتكيف مع المجهر وإلى نشوق الغاز مخدر.
ملاحظة: حامل sterotactic هو دعم المعدن مع اثنين من الأقواس لوحة معدنية، واحد يجري الثابتة والأخرى القابلة للنقل وقابلة للتكيف، لتشديد رأس الحيوان. - تثبيت رأس الفأر بين لوحات الاحتفاظ لضمان بمعزل عن الحركات التنفس. تشديد آذان بين الإبقاء على لوحات ورئيس لتمتد كورونافي تحقق الاستقرار والرفاه في التنفس من الحيوان.
- لتجميد، واستخدام حامل المجسم العرف تتكيف مع المجهر وإلى نشوق الغاز مخدر.
- إزالة فروة الرأس
- استخدام بعناية الايثانول 70٪ لترطيب الشعر من فروة الرأس مع قضيب المعقم، وتجنب ملامسة العينين.
- قطع الجلد مع مقص العقيمة وكماشة لإزالة بشكل كامل فروة الرأس من الخلف من العظم الجداري حتى العظم الجبهي. الابتعاد تصل إلى 3 ملم من عيون وآذان لمنع النزيف واسعة النطاق. إزالة النسيج الضام فضفاضة تغطي الجمجمة (السمحاق). تغسل الشعر المتبقية مع دافئة منشفة ورقية PBS غارقة.
- تعيين نظام الغمر يصل
- لصق حلقة مطاطية من 18MM قطر مع الغراء الجراحية مباشرة على الجمجمة باستخدام إبرة قياس صغيرة للتحكم في التوزيع. الغراء محيط كامل من الحلبة المطاطية لمنع تسرب (يجب أن يكون 30 ميكرولتر كافية).
- تنظيف الجمجمة تحت الحلبة للمرة الأخيرة مع منشفة ورقية PBS غارقة ثم قم بإضافة 37 درجة مئوية برنامج تلفزيوني لمدة الغمر الكامل للالجمجمة. إضافة قطرة من كلوريد الصوديوم حل 0.9٪ أو مرهم للعين بشكل خاص على كل عين من الفأرة لتجنب جفاف العين. اسحب حامل المجسم في إطار الهدف.
- وضع حوالي مجال استخدام بصري المجهر من خلال نقل مباشر.
2. ثنائي الفوتون اقتناء التصوير
- استخدام المجهر multiphoton إلى جانب وجود تي: ليزر الياقوت الكريستال، والتي توفر 140fs نبضات من ضوء الجرد الوطني، الانضباطي بشكل انتقائي من 680 إلى 1،080 نانومتر، والمغير صوتية البصرية للسيطرة على قوة الليزر. استخدام تكوين بينهم 3 كاشفات الخارجية غير descanned (NDD) (أن تمكن من تسجيل وقت واحد من 3 قنوات الفلورسنت) مع مزيج من 2 المرايا مزدوج اللون (565 نانومتر و 690 نانومتر)، 565/610 500/550 ومرشحات ممر الموجة، و 485 قصيرة تمرير مرشح، مع امزيغ خطة × 20 (NA = 1) الهدف الغمر بالماء.
- تعيين غرفة التدفئة للسماح ثبات الحرارة الجيد للanaesالماوس thetized.،
يمكن ضبط درجة الحرارة 1 ساعة قبل جلسة التصوير للاستقرار أفضل: ملاحظة. في حالتنا، تم اختيار 32 ° C للحصول على درجة حرارة الجسم المثلى من الفأرة مخدرة (36-37 ° C) ويتم الحفاظ تصل إلى 4 ساعة. هذه الحرارة يمكن أن تتكيف مع النظام المستخدم (التحقيق الرقمي يمكن استخدامها للتحقق من هذه النقطة). وبالإضافة إلى ذلك، وغرفة التدفئة المستخدمة مظلمة / أسود، ويغطي جزء من نظام (الأهداف والآلية لوحة) لتجنب تلوث الضوء الخارجي. - تشغيل النظام
- بدوره على تي: ليزر الياقوت، ثم نظام المجهر كله. إطلاق برنامج الاستحواذ. تعيين نطاق الطول الموجي الليزر إلى 870 نانومتر. حدد NDD المناسب للتسجيل.
ملاحظة: في حالتنا، تم الكشف عن الجيل الثاني التوافقي (SHG) 19 و السماوي البروتين الفلوري (ECFP) من قبل NDD بعد 485 قصيرة تمرير مرشح. تم الكشف عن ECFP أيضا NDD بعد الكشف عن مرشح 500/550 ممر الموجة وrhodamin-ديكستران التي كتبها tانه NDD بعد تصفية 565/610 ممر الموجة.
- بدوره على تي: ليزر الياقوت، ثم نظام المجهر كله. إطلاق برنامج الاستحواذ. تعيين نطاق الطول الموجي الليزر إلى 870 نانومتر. حدد NDD المناسب للتسجيل.
- ضبط إعدادات اكتساب
- استخدام "اكتساب العيش" قيادة التصوير من البرنامج وباستخدام جهاز التحكم اتجاهي المجهر، وضبط التركيز على المنطقة مع ECFP ورودامين الإشارة. تعيين قوة الليزر إلى الحد الأدنى للحصول على نسبة أفضل إشارة إلى الضوضاء مع الحد الأدنى من الصور الضرر.
ملاحظة: الإعداد الطاقة المستخدمة تختلف وفقا لعمق المنطقة من الفائدة. وعادة ما يتم تعيين إعدادات AOM حوالي 20٪، وهو ما يمثل قوة الليزر وراء هدف حوالي 15 ميغاواط. فمن الأفضل لزيادة الطاقة مكاسب على هذه الفرق لكل NDD للحد من الصورة تبيض والصور والضرر. ضبط اكتساب النموذجية هي المسح واحد مع الوقت بكسل يسكن 1.58 ميكروثانية، وقرار من 512 × 512 بكسل مع التكبير 1.5.
- استخدام "اكتساب العيش" قيادة التصوير من البرنامج وباستخدام جهاز التحكم اتجاهي المجهر، وضبط التركيز على المنطقة مع ECFP ورودامين الإشارة. تعيين قوة الليزر إلى الحد الأدنى للحصول على نسبة أفضل إشارة إلى الضوضاء مع الحد الأدنى من الصور الضرر.
- حدد المناطق ذات الاهتمام
- مرة واحدة يتم تعيين المعلمات التسجيل، استخدام مرة أخرى "العيش" القيادة الاستحواذ،ومسح الأنسجة لاختيار المطلوب (س، ص، ض) ميدانية لرصد في الوقت الحقيقي.
ملاحظة: عادة، اخترنا حقل بما في ذلك الأوعية الدموية والمناطق متني. - تسجيل الميدان مع "الموقف" القيادة البرمجيات.
ملاحظة: هذا الأمر يستظهر X، Y، Z من الإحداثيات حقول بعيدة مختلفة. - اختيار وتسجيل حقول إضافية من الفائدة (إلى 3) باستخدام نفس الإجراء.
- تعيين 3D ض المكدس مع "ض المكدس" القيادة البرنامج على المركز الأول يحفظون وفقا لحجم المطلوبة مع التكبير الذي تم اختياره. حفظ الموقف أعمق أولا، ثم أعلى منصب. تطبيع قوة الليزر مع العمق.
ملاحظة: للحصول على عدة التصوير الحقل يصاحب ذلك، ونحن الحصول 5 شرائح مفصولة 3 ميكرون ض الخطوات لكل حقل للحصول على حجم 12 ميكرون سمك. يمكن تكييف هذه الإعدادات إلى نوع من الخلايا التي تمت دراستها.
- مرة واحدة يتم تعيين المعلمات التسجيل، استخدام مرة أخرى "العيش" القيادة الاستحواذ،ومسح الأنسجة لاختيار المطلوب (س، ص، ض) ميدانية لرصد في الوقت الحقيقي.
- اكتساب إطلاق
- حدد220؛ وقت سلسلة "القيادة البرمجيات واختيار مدة الفاصل الزمني وعدد من الدورات. تبدأ الوقت الفاصل بين التصوير وفقا لمرور الوقت والمدة المطلوبة عن طريق اختيار "تبدأ تجربة" القيادة البرمجيات.
ملاحظة: في حالتنا، ونحن الحصول مجلد واحد كل 30 ثانية خلال 60 دورة يمثلون 30 دقيقة في الوقت الحقيقي. أصغر الفاصل الزمني لا يمكن أن يؤديها على المسار السريع المتداول خلية في الأوعية الدموية. في هذه الحالة أرق ض المكدس وليس أكثر من 2 مجالات مختلفة يمكن تسجيلها في نفس الوقت. - الرصد المنتظم لمجموعة لأعلى.
- دائما رصد الحيوانات للتأكد من أنه فاقد الوعي.
ملاحظة: المصافحة من شعيرات أو أرجل الحيوان هي مؤشرات انتعاش. في حالة التنفس الحيوان هو متشنج، وكمية من الأيزوفلورين يمكن تخفيض قليلا. الانجراف الأنسجة قويا خلال الاستحواذ هو مؤشر الماوس إحياء. - ضمان الهدف هو مغمورة بشكل صحيح. تجديد 37 ° C PBS بين:ن عمليتي استحواذ (30 دقيقة).
ملاحظة: اختفاء التدريجي للإشارة خلال الاستحواذ هي مؤشر على تسرب PBS.
- دائما رصد الحيوانات للتأكد من أنه فاقد الوعي.
- حدد220؛ وقت سلسلة "القيادة البرمجيات واختيار مدة الفاصل الزمني وعدد من الدورات. تبدأ الوقت الفاصل بين التصوير وفقا لمرور الوقت والمدة المطلوبة عن طريق اختيار "تبدأ تجربة" القيادة البرمجيات.
- نهاية الداخلي
- مرة واحدة يتم تسجيل الفيديو المطلوبة، الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم بسرعة قبل الانعاش.
ملاحظة: التئام الجروح يؤدي إلى تشكيل جرب في 24 إلى 48 ساعة مما يحد من إمكانية لإجراء التصوير الطولي.
- مرة واحدة يتم تسجيل الفيديو المطلوبة، الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم بسرعة قبل الانعاش.
تحليل 3. البيانات
- تصحيح الانحراف
- استخدام Imaris Bitplane البرمجيات ل3D التتبع التلقائي.
- فتح تسلسل الصور 3D على Imaris. حدد "بقعة" الأوامر، وتوليد تتبع اليدوي (زر الماوس + التحول) لجميع نقاط زمنية مدة لا تقل عن 4 نقاط الربط المختلفة، إن أمكن توزيع متجانس في هذا المجال.
- تطبيق تصحيح الانحراف باستخدام قيادة "الانجراف الصحيح" في "تحرير المسار" علامة التبويب.
- التحقق من وجود ركان جودة التصحيح في X، Y وخاصة في ض لتجنب يرتعش مصطنع.
ملاحظة: إذا كان التصحيح ليست مرضية، حاول نقاط الربط الأخرى أو استبعاد الفيديو من التحليل.
- تتبع الخلية
- استخدام "إضافة البقع الجديدة" القيادة وتحديد "النقاط المسار مع مرور الوقت" وضع خوارزمية. انتقل إلى الخطوة التالية.
- تطبيق الإجراء التلقائي تتبع الخلية إما على قناة كاملة من الاهتمام باستخدام "قناة المصدر" القيادة. مجموعة الكائنات (أي الخلايا) قطرها إلى 10 ميكرون. انتقل إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: سوف يتوقف الاختيار على التمييز بين الأشياء وخصوصية إشارة قياسها. وباختصار، التتبع التلقائي على قناة كاملة غير ممكن إلا إذا الكشف عن إشارة محددة إلى كائن من الفائدة. لأن الكشف عن كل من SHG وECFP من قبل NDD بعد تصفية 485 تمريرة قصيرة، سوف تتبع تكون أكثر تحديدا وكفاءة استخدام إشارة ECFP التي سجلتها NDD بعد 500/550 ممر الموجة المرشحات. متفاوت المسافات أو سوف الأجسام معبأة كثيفة تتطلب اليدوية مختارة من كائنات فردية مماثلة إلى الخطوة 3.1.2. - حدد "جودة" نوع التصفية، تعيين عتبة لاستبعاد تتبع الأجسام غير محددة. انتقل إلى الخطوة التالية.
- اختيار "البراونية خوارزمية الحركة" مع المعلمات دقيقة من "ماكس المسافة" و "حجم الفجوة" بين اثنين من البقع. التحقق من صحة الجيل المسار الصحيح.
- مرة واحدة ويتم حساب المسارات تلقائيا، حدد "مدة المسار" نوع التصفية، تعيين عتبة للقضاء على مسارات أقصر من 120 ثانية (تمثل 4 نقاط الوقت).
- إلزامية: بعد التتبع التلقائي، والتحقق من جودة المسارات.
- انبسط شريط الوقت للتأكد من أن الكائنات تتبع مسارات المسار الصحيح. إذا لم يكن كذلك، استخدام خيارات التصحيح نقطة المسار المتوفرة في "تحرير" علامة التبويب: حذف مسارات خاطئة أو غير لائقة مع "حذف" الأمر (حذف أي مسار صoint بشكل فردي باستخدام قيادة "قطع"). إذا المسار المسار هو متقطع، إضافة نقاط الوقت المفقودة (زر الماوس + التحول)، وحدد كل نقاط على مسار معين، واستخدام "اتصال" القيادة في "تحرير المسار" علامة التبويب.
- المعلمات الكمي
- حدد "الاحصاء" علامة التبويب في "تفضيلات" القيادة، واختيار معلمات الحيوية التي تهم في القائمة. حدد "تصدير جميع الإحصاءات إلى ملف" القيادة وحفظ ملف اكسل ولدت.
ويتم الحصول على العديد من معلمات الحيوية مباشرة من البرنامج مثل أطوال المسار، السرعة اللحظية، متوسط السرعة، وتتبع استقامة: ملاحظة. الحركة معامل 6، 20 يمكن تحديد ولكن لم يتم توفير مباشرة من البرنامج. - لكل خلية، وحساب متوسط للنزوح عن كل فترة من الزمن (δt) (لمدة 30 ثانية الفاصل الزمني الفيلم، δt ستكون 30، 60، 90 ثانية، الخ).رسم متوسط تشريد مربع بوصفها وظيفة من الفاصل الزمني. الحصول على معامل الحركة عن طريق حساب المنحدر من الخطية جزء من المنحنى.
- حدد "الاحصاء" علامة التبويب في "تفضيلات" القيادة، واختيار معلمات الحيوية التي تهم في القائمة. حدد "تصدير جميع الإحصاءات إلى ملف" القيادة وحفظ ملف اكسل ولدت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر الماوس هيكل الجمجمة فرصة جيدة لدراسة علم وظائف الأعضاء نخاع العظام بواسطة التصوير حيوي داخلي. العظام كونها رقيقة في جميع أنحاء المنطقة الأمامية الجدارية، فمن الممكن للوصول إلى منافذ medullar دون تآكل العظام. الشكل 1 يمثل حقل 2D واسعة من الجمجمة من الماوس المعدلة وراثيا MacBlue. وتتكون المصفوفة العظام أساسا من الكولاجين I بسهولة كشفها بواسطة SHG 19. حقن rhodamin-ديكستران بقع شبكة الأوعية الدموية من نخاع العظام ويسمح لتحديد منافذ نخاع العظام متني بين مصفوفة العظام والأوعية 14. ويتم توزيع خلايا ECFP في اثنين من مقصورات للنخاع العظام، ولكنها غائبة عن مصفوفة العظام. تصنف حيدات يدويا وفقا لموقعها داخل الأنسجة. ويعرف الوحيدات الأوعية الدموية عند الخلية كلها داخل الأوعية الدموية، بغض النظر عن حجم السفينة. يتم استبعاد الأوردة جمع كبيرة فقط من وجهة نظرنا لnalysis. ويعرف متني الوحيدات عندما يقع الخلية بين الأوعية الدموية ومصفوفة العظام.
الوقت الفاصل بين التصوير من منطقة محددة من الفائدة (فيديو التكميلي 1 و 2) يسمح لحساب مسار الخلايا الفردية على مر الزمن إما الأوعية الدموية (الشكل 2A) أو متني (الشكل 2B) وحيدات. ويبين طول المسار الذي عرض حيدات متني تخفيض النزوح مقارنة حيدات الأوعية الدموية. تحليل للنزوح مع مرور الوقت يقارن سرعة يعني من وحيدات في كل من المقصورات (الشكل 2C). تشريد مربع متوسط بوصفها وظيفة من الزمن هو مقياس لمدى المكاني للحركة عشوائية. يتم تحديد معامل القدرة على الحركة من قبل المنحدر من الخطية جزء من منحنى، ويقدم فكرة أفضل عن تشريد الخلية (انظر القسم مناقشة). معامل القدرة على الحركة من وحيدات الأوعية الدموية (MC = 71μm² / ق) هو أعلى من coefficie الحركةالإقليم الشمالي من وحيدات متني (MC = 4.4μm² / ث).
يجب أن تتكيف القرار وقت الاستحواذ على متوسط سرعة الخلية. يمكن حيدات الأوعية الدموية المتداول جعل النزوح مهم داخل فترة زمنية قصيرة. لتتبع الخلايا أكثر دقة، والحد الفاصل الزمني من الاستحواذ هو الأفضل. ويبين الشكل 3 مثال على تتبع الوحيدات مع اثنين مختلفة، القرارات الوقت. A 30 ثانية الوقت الفاصل يقلل من دقة فضلا عن طول الممرات (في خط متقطع الأخضر) مقارنة ب 10 ثانية الوقت الفاصل.
وأخيرا، يوضح الشكل (4) إمكانية تحليل فرعية خلية أخرى متزامنة إلى حيدات. Ly6G هو علامة محددة من العدلات الماوس ناضجة. الحقن المضادة للLy6G جنبا إلى جنب مع تألقي (في هذه الحالة Phyco-erythrin) 5 دقائق قبل العدلات وصمة عار تسلسل التصوير مباشرة في الجسم الحي. ويوفر هذا النهج وقاتمة إضافية ension التحليل وإمكانية للمقارنة بين سلوك مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا. ويمكن استخدام هذا النهج لتحديد مجموعات فرعية في المقصورات الوحيدات.
الشكل 1. حقل واسع من منظمة نخاع العظم الجمجمة. في الجسم الحي اثنين الفوتون المسح الضوئي ليزر صورة مجهرية من الجمجمة ثابتة للدولة نخاع العظم من MacBlue الماوس. اتسخت الأوعية الدموية (باللون الأحمر) من خلال الذيل حقن الباطل من 2MDa Rhodamin-ديكستران 5 دقائق قبل جلسة التصوير. هو تصور العظام بواسطة الجيل الثاني التوافقي (الأزرق). وتقع ECFP + حيدات (سماوي) داخل محاريب متني (المناطق المظلمة بين الأوعية الدموية والعظام) وداخل الأوعية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. الوقت الحقيقي تتبع الخلية. مسارات المسار التمثيلية طول الوقت من وحيدات داخل (A) في الأوعية الدموية و(B) لحمة. يتم إنشاء السكك الحديدية (الخط الأخضر) لكل خلية تلقائيا من قبل البرنامج. بقع حمراء تمثل مركز كتلة من الخلايا تتبعها. (C) متوسط سرعة المقارنة بين الأوعية الدموية ومتني وحيدات. وقد تم إجراء مان ويتني التحليل الإحصائي، *** يمثل ف <0،001. (D) يعني تشريد التربيعية (MSD) بوصفها وظيفة من الزمن ويمثل لالأوعية الدموية ومتني وحيدات. منحنى مقارب يشير إلى النزوح مقيدة من الخلايا مع مرور الوقت، في حين أن منحنى خطي يشير المشي العشوائي في بيئة غير مقيدة. معامل الحركة يشير إلى مدى النزوح الخلية ويتم تحديد من قبل المنحدر من ج ايرفى تحسب على الانحدار الخطي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. قرار الفاصل الزمني في دراسة حيدات المتداول. متواليات صورة الممثل تظهر أن زيادة دقة الوقت يحسن الدقة في مسار الخلايا المتداول. (حتى) تسلسل الصور مع فترات زمنية 10 ثانية. (أسفل) تسلسل الصور مع فترات زمنية 30 ثانية. تم تحسين نوعية مسار المسار ويتم تقليل خطر النظر خليتين مختلفة لنفسه أو العكس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. ويبين هذا الشكل الشكل 4. في الجسم الحي شارك في توطين العدلات medullar وحيدات إمكانية للكشف عن مجموعة فرعية خلية أخرى في الجسم الحي بالتزامن مع حيدات، عن طريق حقن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة جنبا إلى جنب مع تألقي. 2 ميكروغرام من Ly6G-PE الأجسام المضادة قد تم حقنها عن طريق الوريد 5 دقائق قبل الجمجمة نخاع العظام التصوير من MacBlue الماوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو التكميلي 1. السلوك المهاجرة من وحيدات متني. في الجسم الحي 3D التصوير النشاط المهاجرة ثابتة للدولة من وحيدات في نخاع العظام حمة الجمجمة على فأرة الحاسوب MacBlue. إشارة ECFP + هي في السماوي. ويبدو أن مسارات الهجرة لكل خلية (النقطة الحمراء) باللون الأخضر.
= "jove_content"> التكميلي الفيديو 2. السلوك المهاجرة من وحيدات الأوعية الدموية. في الجسم الحي 3D التصوير النشاط المهاجرة ثابتة للدولة من وحيدات في نخاع العظام الأوعية الدموية الجمجمة من MacBlue الماوس. إشارة ECFP + هي في السماوي. (2M تم حقن دا) رودامين-ديكستران قبل الدورة التصوير لتمييز الأوعية الدموية نخاع العظم (أحمر). ويبدو أن مسارات الهجرة لكل خلية (النقطة الحمراء) باللون الأخضر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النقاط الحرجة للفي الجسم الحي منهجية التصوير في ضمان الاستقرار في التركيز من أجل تحقيق أقصى مدة التصوير والتقليل من خطر التلوث الجرثومي والتهاب، والتي قد تؤثر على ديناميات الخلايا الالتهابية. التصوير من نخاع عظم الجمجمة يتبع هذه الأهداف كما أجريت عملية جراحية للوصول إلى نخاع العظم هو الحد الأدنى. استخدام المواد المعقمة والمطهرات أمر ضروري للحد من خطر العدوى التي يمكن أن تحفز اضطراب في توازن الخلية.
تطوير حامل المجسم قد يكون تحديا ويتطلب التخصيص المحدد لكل نظام (المسافة بين مرحلة موضوعية والآلية المجهر، واستخدام نشوق الغاز للتخدير). من المهم أن يحصل رئيس الماوس كما الأفقي ممكن عن وصول سطح التصوير أوسع. مرة واحدة يتم وضع الحيوان، فمن المرجح أن عدة دقائق يمكن أن يكون اشتراطاتإد للحصول على الاستقرار جيدة للالبؤري. لذلك، فمن المستحسن للتحقق من الانجراف الأنسجة قبل شن تسجيل الاستحواذ. لأن هذه العملية جنبا إلى جنب مع اختيار المناطق ذات الاهتمام يمكن أن تستمر بعض الوقت، فمن المستحسن أيضا إلى التحقق دائما من أن هذا الحيوان هو فاقد الوعي إذا استخدمت Ketamin / Xylazin، وللتحقق من الغمر السليم للهدف كما التسرب والتبخر يمكن تحدث.
المواقع الجيد للحلقة مطاطية على الجمجمة يمثل خطوة حاسمة أخرى في العملية. يوفر الغراء cyanoacrylate نتائج جيدة من حيث الاستقرار والختم، ولكن يحتاج المرء لمنع التحميل الزائد من الغراء، والتي يمكن أن تغطي الجمجمة ومنع الوصول إلى المنطقة من مصلحة الأنسجة. ميزة الغمر المباشر من الجمجمة دون ساترة الزجاج هو الحصول على الوصول إلى المناطق العميقة من العظام. وبالإضافة إلى ذلك، منذ الجمجمة ليست سطح عادي، وهذا لن يحد من مجال التصوير ليخدعسطح براعة بين الجمجمة وساترة، مما يسمح حقل التصوير واسعة، كما هو معروض في الشكل 1.
لجميع تقنيات التصوير، واختيار بين سرعة اكتساب وجودة قرار تمثل حلا وسطا. وهكذا، فإن عدد ونوعية الصور في كل وحدة زمنية محدودة، ويتوقف الاختيار على السؤال العلمي معالجتها. عادة، وحيدات الأوعية الدموية تدور بسرعة الخلايا، في حين حيدات متني هي متحركة بطيئة أو لاطئة. وتتبع دقيق لخلايا المتداول يتطلب قرار الوقت أعلى من الاستحواذ، كما هو مبين في الشكل (2). ارتفاع معدل التصوير للخلايا لاطئة هو عديمة الفائدة وارتفاع X، Y، Z قرار يمكن أن يكون من المفضل لتحليل النشاط تبارزي من التشعبات على سبيل المثال. أن خلايا سريعة تتطلب حجم سمكا للحصول على تتبع أطول من نزوحهم في ض.
لم يتم توفير تشريد مربع متوسط بوصفها وظيفة من الزمن من قبل Imaris البرمجيات. وبرينسيبلو هذا التمثيل استنادا إلى حقيقة أن لكائن السفر المقذوفات دون أي لقاء أو انقباض الهيكلي، والمسافة التي سافر سيكون متناسبا مع الفاصل الزمني (الشكل 2D). وهكذا الخطي المنحدر تشير إلى المشي العشوائي في بيئة غير مقيدة. في المقابل، فإن شكل مقارب للمنحنى يعكس النزوح مقيدة على مر الزمن من السكان الخلية. الميزة الثانية لهذا الحساب هي أن سرعة والمبالغة في بعض الأحيان من النزوح مصطنع من مركز الكتلة. هذا مهم بشكل خاص لبطء خلية متحركة مع النشاط تبارزي. وهكذا، وحساب معامل القدرة على الحركة من قبل المنحدر من منحنى تحسب على الانحدار الخطي يشير إلى النزوح الحقيقي من الوقت cellover 21.
Ly6G تلطيخ في الجسم الحي يوضح إمكانية إضافة معلمة جديدة في التحليل أثناء عملية التصوير (الشكل 3 آخرون تحت الطبع). على الرغم من أن أكثر من 98٪ من العدلات الأوعية الدموية وصفت بشكل صحيح، وتلطيخ من العدلات نخاع العظام هو أقل كفاءة، ويتم تقليل كثافة مضان متوسط بقوة، مما يشير إلى انخفاض صول الأجسام المضادة نحو لحمة نخاع العظام (لا تظهر البيانات). Rhodamin ديكستران، النقاط الكمومية، أو الأصباغ محددة أخرى من الخلايا الميتة أو الميتة مثل دابي، يوديد propidium، sytox 22، أو مراسل الفلورسنت لوظائف الخلية مثل إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية 23، ويمكن أن يضاف عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل أثناء التصوير عملية وتوفر فرصة جيدة لقياس الخصائص الوظيفية مثل موت الخلية، البلعمة وفخ خارج الخلية العدلة. مازو وآخرون 12 تستخدم لطيف اثنين من الأصباغ الأوعية الدموية المختلفةمع انخفاض وارتفاع الوزن الجزيئي لتحسين حمة التباين والأوعية الدموية. اختيار صبغة الفلورسنت أمر حاسم للسماح اكتساب ما يصاحب ذلك من صحفيين الفلورسنت مختلفة. في الواقع، وسيتم اختيار الطول الموجي الإثارة وفقا لذلك للحصول على أفضل حل وسط بين جميع الأصباغ الفلورية المستخدمة.
بروتوكول المستخدمة هنا يجعل من الممكن لتحليل في الجسم الحي النشاط البيولوجي للحجرة الخلية، ودراسة التي كان من الصعب حتى الآن. التحليل النسيجي للنسيج نخاع العظم وعادة ما يتطلب إعداد طويل من زوال الكلس العظام للسماح قسم رقيقة، وانها لا تقدم سوى وجهة نظر ثابتة من الأنسجة. وجهة نظر ديناميكية يسلط الضوء على معدل الصرف بين خلية لحمة والجيوب نخاع العظام. هذه العملية السريعة هي خطوة حاسمة على فك من أجل الحصول على فهم أفضل لآلية تعبئة خلية على إشارة التهابات 5 أو شروط مسبقة العلاج الكيميائي myeloaplasiveنظام 6. لقد ذكرت الحدث من الخلايا دخول الوعاء 6 ولكن هذه العملية هو بالكاد يمكن كشفها بسبب التردد المنخفض في حالة مستقرة. ومع ذلك، فمن المرجح أن يتعزز على إشارات التهابات. مستقبلات Chemokine مثل CCR2، CX3CR1 أو CXCR4 متورطين للغاية في عملية دخول الوعاء، وبالتالي استخدام إبطال الجيني هذه المستقبلات يجب تقديم رؤى الأساسية الرواية في مسارات الهجرة الخلية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر آن دارون وبيير لويس Loyher للحصول على المساعدة التحرير، وPlateforme IMAGERIE بيتييه-Salpêtrière (PICPS) للحصول على المساعدة مع المجهر ثنائي الفوتون ومرفق الحيوان "NAC" وكميل Baudesson بالنسبة للفئران تربية المساعدة. تلقت الأبحاث الرائدة لهذه النتائج بتمويل من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) بموجب اتفاقية منحة رقم 304810 - الغارات، و n ° 241440-Endostem، من INSERM، من جامعة بيير وماري كوري "ظهور "من لا" الدوري الفرنسي مناهضة جنيه السرطان "، من" جمعية صب لا بحوث سور جنيه السرطان "ومن" الوكالة الوطنية للبحوث "ظهور برنامج عام 2012 (ANR-EMMA-050). وأيد PH التي كتبها la "الدوري الفرنسي مناهضة جنيه السرطان".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
- Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
- Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
- Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
- Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
- Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
- Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).
