Protocol
BEMÆRK: Alle eksperimentet protokoller blev godkendt af den franske Dyreforsøg og etiske komité og valideret af "Service Protection et Santé Animales, Environnement" med nummer A-75-2065. Sample størrelser valgt for at sikre reproducerbarhed af forsøgene, og ifølge 3R af animalsk etiske regulering.
1. Forberedelse af Mouse
- Anæstesi
- For kort periode imaging (mindre end 1 time), bedøve musen med en intraperitoneal injektion af 200 pi af en saltopløsning indeholdende ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg).
- Alternativt i længere imaging (op til 4 timer), bedøve musen med en inhalation af isofluran 2,5% fordampet i en 70/30 blanding af O 2 / N 2 O gennem en tilpasset maske.
- BEMÆRK: Denne måde giver mulighed for en mere stabil bevidstløshed og undgår seriel intraperitoneal injektion af narkotika. Når musen er bedøvet, så tjek for bevidstløshed gennem stimulering af foden puden med Nippers.
- Vaskulær farvning / ekstra farvning
- For vaskulær farvning: Injicer intravenøst i halevenen, 200 pi rhodamin-dextran (2 MDA, 10 mg / ml i saltvand buffer).
- For neutrofil farvning: injicere 2 ug Ly6G-PE (klon 1A8) i 100 pi saltvand intravenøst i halevenen.
- Immobilisering
- For immobilisering, brug en skræddersyet stereotaktisk holder tilpasset mikroskopet og den bedøvende gas inhalatoren.
BEMÆRK: sterotactic holder er et metal support med to metal plade beslag, ene er fastgjort, og den anden aftagelige og fleksible, at skærpe de dyrets hoved. - Installer lederen af musen mellem holdepladerne at sikre isolation fra vejrtrækning bevægelser. Spænd ørerne mellem holdeplader og hoved til at strække ski. Kontroller for stabilitet og vejrtrækning dyrenes velfærd.
- For immobilisering, brug en skræddersyet stereotaktisk holder tilpasset mikroskopet og den bedøvende gas inhalatoren.
- Fjern hovedbunden
- Brug forsigtigt ethanol 70% at fugte håret i hovedbunden med en steril applikator, undgå kontakt med øjnene.
- Skær huden med steril saks og Nippers til fuldt ud at fjerne hovedbunden fra tilbagestående den parietale knogler til frontal knoglen. Holdes væk op til 3 mm fra øjne og ører til at forhindre omfattende blødning. Fjern løst bindevæv dækker kraniet (periosteum). Skyl resterende hår med varmt PBS-gennemblødt køkkenrulle.
- Immersion system, der oprettes
- Indsæt en gummiring på 18mm diameter med kirurgisk lim direkte på kraniet med en lille kanyle til at styre distribution. Lim hele periferien af gummiringen at forhindre lækage (30 pi bør være tilstrækkelig).
- Rengør kraniet under ringen en sidste gang med PBS-gennemblødt papir håndklæde og derefter tilføje 37 ° C PBS for fuldstændig nedsænkning afkraniet. Tilføj en dråbe NaCl 0,9% opløsning eller specifik oftalmisk salve på hvert øje af musen for at undgå øjet tørhed. Træk stereotaktisk holder under mål.
- Ca. placere feltet ved hjælp af mikroskop okular gennem direkte transmission.
2. To-foton Imaging Acquisition
- Brug en multiphoton mikroskop kombineret med en Ti: Sapphire crystal laser, som giver 140fs pulser af NIR lys, selektiv, variabelt fra 680 til 1.080 nm, og en akustisk-optisk modulator til laser effektstyring. Brug en konfiguration med 3 eksterne ikke-descanned detektorer (NDD) (der muliggør samtidig optagelse af 3 fluorescerende kanaler) med en kombination af 2 dikroiske spejle (565 nm og 690 nm), 565/610 og 500/550 båndpasfiltre, og en 485 kort pass filter, med en plan Apochromat × 20 (NA = 1) vand nedsænkning mål.
- Indstil varmekammeret at tillade god homeothermy af anaesthetized mus.,
BEMÆRK: Temperaturen kan være indstillet 1 time før billeddannelse session for bedre stabilitet. I vores tilfælde er 32 ° C er valgt for at få optimal kropstemperatur af bedøvede mus (36-37 ° C) og holdes op til 4 timer. Denne temperatur kan tilpasses til det anvendte system (digital sonde kan anvendes til at kontrollere dette punkt). Desuden opvarmningskammeret anvendte mørk / sort og dækker en del af systemet (mål og motoriseret plade) for at undgå lys forurening eksterne. - Tænd for systemet
- Tænd Ti: Sapphire laser, så hele mikroskop system. Start erhvervelse software. Indstil laser bølgelængdeområde til 870 nm. Vælg passende NDD til optagelse.
BEMÆRK: I vores tilfælde er anden harmonisk generation (SHG) 19 og cyan fluorescerende protein (ECFP) detekteret af NDD efter 485 korte pass filter. ECFP også detekteres af NDD efter 500/550 båndpasfilter og rhodamin-dextran detekteres af than NDD efter 565/610 båndpasfilter.
- Tænd Ti: Sapphire laser, så hele mikroskop system. Start erhvervelse software. Indstil laser bølgelængdeområde til 870 nm. Vælg passende NDD til optagelse.
- Justering af indstillinger erhvervelse
- Brug "live erhvervelse" imaging kommando af softwaren og brug af mikroskop retningsbestemt kontrol, justere fokus på et område med ECFP og Rhodamin signal. Indstil laser strøm til minimum for at opnå den bedste signal-til-støj-forhold med minimal foto-skader.
BEMÆRK: Den effekt indstilling, varierer alt efter dybden af området af interesse. Typisk AOM er indstillet omkring 20%, hvilket er en laser magt over målet omkring 15 mW. Det er bedre at øge gain magt på PMT'er for hver NDD at reducere foto-blegning og foto-skader. Typiske indstillinger køb er single scanning med en pixel opholdstid på 1,58 mikrosekunder, og en opløsning på 512 x 512 pixels med en 1,5 forstørrelse.
- Brug "live erhvervelse" imaging kommando af softwaren og brug af mikroskop retningsbestemt kontrol, justere fokus på et område med ECFP og Rhodamin signal. Indstil laser strøm til minimum for at opnå den bedste signal-til-støj-forhold med minimal foto-skader.
- Vælg områder af interesse
- Når optagelse parametre er indstillet, bruge igen den "live" kommando erhvervelse,og kortlægge vævet til at vælge en ønsket (x y z,,) felt, der skal overvåges i realtid.
BEMÆRK: Typisk, valgte vi et felt, herunder både kar og parenkymale områder. - Registrer feltet med "position" software kommando.
BEMÆRK: Denne kommando husker x, y, z koordinater af forskellige fjerntliggende områder. - Vælg og registrere yderligere områder af interesse (op til 3) ved hjælp af den samme procedure.
- Sæt et 3D z-stak med "z-stack" software kommando på den første lagrede position i henhold til den nødvendige volumen med valgte forstørrelse. Huske dybere position først, og derefter den højeste position. Normalize laser magt med dybden.
BEMÆRK: flere samtidige felt billeddannelse, vi erhverver 5 skiver adskilt af 3 um z-trin for hvert felt til at erhverve et volumen på 12 um tykkelse. Disse indstillinger kan tilpasses til den type celle undersøgt.
- Når optagelse parametre er indstillet, bruge igen den "live" kommando erhvervelse,og kortlægge vævet til at vælge en ønsket (x y z,,) felt, der skal overvåges i realtid.
- Lancering erhvervelse
- Vælg220; tidsserier "software kommando, og vælg varigheden af tidsinterval og antallet af cykler. Begynd time-lapse billeddannelse henhold til den tid bortfalder og varighed, der kræves ved at vælge "start eksperimentet" software kommando.
BEMÆRK: I vores tilfælde, vi erhverve et volumen hver 30 sek i 60 cykler, der repræsenterer 30 min realtid. Mindre tid bortfalder kan udføres for at spore hurtige celle rullende i blodkarret. I dette tilfælde tyndere Z-stakken og ikke mere end 2 forskellige områder kan optages på samme tid. - Regelmæssig overvågning af sættet op.
- Overvåge altid dyret for at sikre det er bevidstløs.
BEMÆRK: Rystelser af whiskers eller ben på dyret er indikatorer for vækkelse. I tilfælde af dyrets vejrtrækning er rykvis, kan mængden af isofluran blive reduceret en smule. Stærk væv afdrift under erhvervelse er en indikator for mus genoplivning. - Sørg målet er korrekt nedsænket. Forny 37 ° C PBS between to akkvisitioner (30 min).
BEMÆRK: Progressive forsvinden af signal under køb er indikator for PBS lækage.
- Overvåge altid dyret for at sikre det er bevidstløs.
- Vælg220; tidsserier "software kommando, og vælg varigheden af tidsinterval og antallet af cykler. Begynd time-lapse billeddannelse henhold til den tid bortfalder og varighed, der kræves ved at vælge "start eksperimentet" software kommando.
- Slutningen af procedure
- Når den ønskede videoer er optaget, aflive dyret ved cervikal dislokation hurtigt før genoplivning.
BEMÆRK: sårheling fører til dannelsen af en sårskorpe i 24 til 48 timer, hvilket begrænser muligheden for at udføre langsgående billeddannelse.
- Når den ønskede videoer er optaget, aflive dyret ved cervikal dislokation hurtigt før genoplivning.
3. Data Analysis
- Drift korrektion
- Brug Imaris Bitplane software til 3D automatisk tracking.
- Åbn 3D-billede sekvens på Imaris. Vælg "spot" kommando, og generere manuel sporing (museklik + shift) for alle tidspunkter i minimum 4 forskellige ankerpunkter, om muligt homogent fordelt i marken.
- Påfør korrektionen afdrift hjælp kommandoen "rigtige drift" i fanen "Rediger track".
- Check for tHan kvalitet af korrektionen i x, y og især i z for at undgå kulturgenstandsspor vaklen.
BEMÆRK: Hvis korrektionen ikke er tilfredsstillende, kan du prøve andre ankerpunkter eller udelukke video fra analysen.
- Cellesporing
- Brug "tilføje nye spots" kommando, og vælg "track pletter over tid" algoritme indstilling. Gå til næste trin.
- Anvend automatisk celle sporing procedure enten på hele kanal af interesse ved anvendelse kommandoen "kilde kanal". Set objekter (dvs. celler) i diameter til 10 um. Gå til næste trin.
BEMÆRK: Valget vil afhænge af sondringen mellem genstande og specificitet det målte signal. Kort sagt, automatisk sporing på hele kanal er kun mulig, hvis detekterede signal er specifik for genstanden af interesse. Fordi både SHG og ECFP detekteres af NDD efter 485 korte pass filter, vil sporing være mere specifik og effektiv brug af ECFP signal registreret af NDD efter 500/550 båndpasfiltre. Klynger eller tætte pakket objekter kræver manuelt valg af individuelle objekter svarende til trin 3.1.2. - Vælg "kvalitet" filtertype, indstille tærsklen til at udelukke sporing af uspecifikke objekter. Gå til næste trin.
- Vælg "Brownske algoritme Motion" med præcise parametre for "Max distance" og "Gap størrelse" mellem to pletter. Godkend track generation.
- Når sporene er automatisk beregnet, skal du vælge "Lyt Varighed" filtertype, indstille tærsklen til at fjerne spor kortere end 120 sek (der repræsenterer 4 tidspunkter).
- Obligatorisk: Efter automatisk sporing, kontrollere kvaliteten af sporene.
- Rul på tidslinjen for at kontrollere, at genstandene Følg sporet stier. Hvis ikke, skal du bruge indstillinger af sporet punkt korrektion tilgængelige under fanen "Rediger": Slet falske eller forkerte spor med "delete" kommando (slette spor pFælles individuelt ved hjælp af kommandoen "afkobling"). Hvis sporet vej er diskontinuert, tilsættes manglende tidspunkter (museklik + skift), skal du vælge alle punkter på en given bane, og brug "forbinde" kommando under fanen "Rediger track".
- Kvantificering parametre
- Vælg "Statistik" fanen i kommandoen "Indstillinger", vælg de dynamiske parametre af interesse på listen. Vælg "Eksporter alle statistikker til fil" kommando- og gemme Excel-fil genereret.
BEMÆRK: Flere dynamiske parametre er direkte fremstillet af softwaren såsom spor længder, øjeblikkelige hastighed, gennemsnitlig hastighed, og spore rethed. Motilitet koefficient 6 kan 20 bestemmes, men er ikke direkte af softwaren. - For hver celle, beregne gennemsnit af forskydninger for hver periode (* t) (for en 30 sek tid bortfalder film, vil * t være 30, 60, 90 sek, osv).Plot middelværdien af kvadratet forskydning som en funktion af tidsintervallet. Opnå motilitet koefficient ved at beregne hældningen af den lineære del af kurven.
- Vælg "Statistik" fanen i kommandoen "Indstillinger", vælg de dynamiske parametre af interesse på listen. Vælg "Eksporter alle statistikker til fil" kommando- og gemme Excel-fil genereret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus kranium struktur giver en god mulighed for at studere knoglemarven fysiologi ved intravital billeddannelse. Knoglen være tynd omkring front-parietale område, er det muligt at få adgang til medullær nicher uden afslidning af knoglen. Figur 1 repræsenterer en bred 2D område af kraniet af en MacBlue transgen mus. Knoglematrixen består hovedsagelig af kollagen I let kan påvises ved SHG 19. Injektion af rhodamin-dextran farver det vaskulære netværk af knoglemarven og giver mulighed for identifikation af parenchymale knoglemarvsceller nicher mellem knoglematrix og beholderne 14. ECFP celler fordeles i de to rum i knoglemarv, men er fraværende fra knoglematrix. Monocytter manuelt klassificeres efter deres placering i vævet. Vaskulær monocyt defineres når hele cellen er i vaskulaturen, der ses bort fra fartøjets størrelse. Kun store indsamling venuler er udelukket fra vores aNALYSE. Parenchymale monocyt defineres, når cellen er beliggende mellem vaskulaturen og knoglematrix.
Time-lapse billeddannelse af specifikke område af interesse (supplerende video 1 og 2) giver mulighed for beregning af enkelte celle bane over tid for enten vaskulære (figur 2A) eller parenkymale (figur 2B) monocytter. Længde Sporet viser, at parenkymale monocytter display reduceret forskydning i forhold til vaskulære monocytter. Analyse af forskydningen over tid sammenligner den gennemsnitlige hastighed af monocytter i begge rum (figur 2C). Middelkvadratet på forskydningen som en funktion af tid er et mål for den rumlige udstrækning af tilfældig bevægelse. Motilitet koefficient bestemmes af hældningen af den lineære del af kurven og giver en bedre idé af cellen forskydning (se diskussion afsnit). Den motilitet koefficient på vaskulære monocytter (MC = 71μm² / S) er højere end motilitet coefficient af parenkymale monocytter (MC = 4.4μm² / s).
Den tidsopløsning for erhvervelsen skal tilpasses til den gennemsnitlige celle hastighed. Rolling vaskulære monocytter kan gøre vigtig forskydning inden for en kort tidsforsinkelse. For en mere nøjagtig cellesporing reducere tidsintervallet for erhvervelsen er at foretrække. Figur 3 viser en illustration af monocyt sporing med to forskellige tidspunkter-opløsninger. En 30 sek tidsinterval reducerer nøjagtigheden samt længden af veje (i grøn stiplet linie) sammenlignet med 10 sek tidsinterval.
Endelig Figur 4 illustrerer muligheden for at analysere en anden celle delmængde samtidig til monocytter. Ly6G er en specifik markør af modne mus neutrofiler. Injektion af anti-Ly6G kombineret med et fluorochrom (i dette tilfælde Phyco-erythrin) 5 minutter før billeddannelse sekvens plet neutrofiler direkte in vivo. Denne fremgangsmåde giver en ekstra dimension analyse og muligheden for at sammenligne adfærden af de forskellige celledelmængder. En sådan fremgangsmåde kan anvendes til at definere undergrupper i monocytaktiveringsassayet rum.
Figur 1. bredt felt af kraniet knoglemarv organisation. In vivo to-foton laser scanning mikroskopi billede af kraniet steady-state knoglemarv fra MacBlue mus. Kar (i rødt) er plettet af hale forgæves injektion af 2MDa rhodamin-dextran 5 min før billeddannelse session. Knoglen visualiseres ved anden harmoniske generation (blå). ECFP + monocytter (Cyan) er placeret inden parenkymale nicher (mørke områder mellem vaskulatur og ben) og inden for de fartøjer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Real time celle sporing. Repræsentative spor stier langs tid af monocytter inden (A) karrene og (B) parenkym. Tracks (grøn linje) for hver celle er automatisk genereret af softwaren. Røde pletter repræsenterer centrum af massen af sporede celler. (C) Mean hastighed sammenligning mellem vaskulære og parenkymale monocytter. Mann-Whitney statistisk analyse er blevet udført, *** betegner p <0,001. (D) Mean kvadrerede fortrængning (MSD) som en funktion af tid er repræsenteret vaskulære og parenkymale monocytter. Asymptotisk kurven angiver indspændt forskydning af celler over tid, mens lineær kurve angiver random walk i et ikke-begrænset miljø. Motilitet koefficient angiver omfanget af cellen forskydning og bestemmes af hældningen af c Urve beregnet ved lineær regression. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Tidsinterval opløsning i studiet af rullende monocytter. Repræsentative billedsekvenser viser, at øget tidsopløsning forbedrer præcision rullende celle bane. (Op) Billede sekvens med 10 sek tidsintervaller. (Ned) Billede sekvens med 30 sek tidsintervaller. Kvaliteten af sporet vej forbedres, og risikoen for at overveje to forskellige celler til det samme eller det modsatte er reduceret. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. In vivo co-lokalisering af medullær neutrofiler og monocytter. Denne figur illustrerer muligheden for at detektere en anden celle delmængde in vivo samtidig med monocytter, ved at injicere specifikt monoklonalt antistof kombineret med en fluorochrom. 2 ug Ly6G-PE antistof er blevet injiceret intravenøst 5 min før kraniet knoglemarv billeddannelse af MacBlue musen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Supplerende video 1. vandrende adfærd parenkymale monocytter. In vivo 3D-billeddannelse af steady-state vandrende aktivitet af monocytter i kraniet knoglemarven parenkym af en MacBlue mus. Den ECFP + signalet er i cyan. Vandrende stier for hver celle (rød prik) vises med grønt.
Supplerende video 2. vandringsadfærd af vaskulære monocytter. In vivo 3D-afbildning af steady-state vandrende aktivitet af monocytter i kraniet knoglemarv vaskulatur en MacBlue mus. Den ECFP + signalet er i cyan. (2M Da) rhodamin-dextran blev injiceret før billeddannelse session at adskille knoglemarven vaskulatur (rød). Vandrende stier for hver celle (rød prik) vises med grønt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske punkter i in vivo imaging metode er at sikre stabilitet i fokus for at maksimere varigheden af billedbehandling og at minimere risikoen for bakteriel forurening og inflammation, som kunne påvirke dynamikken i de inflammatoriske celler. Imaging af kraniet knoglemarv følger disse mål som kirurgi udføres for at få adgang til knoglemarven er minimal. Brugen af sterile materialer og antiseptiske er afgørende for at begrænse risikoen for infektion, der kan fremkalde forstyrrelse i celle homeostase.
Udviklingen af stereotaktisk indehaver kunne være udfordrende og kræver særlig tilpasning for hvert system (afstanden mellem objektiv og motoriseret etape af mikroskopet, brug af gas inhalator til anæstesi). Det er vigtigt at få hovedet på musen så vandret som muligt for en bredere afbildningsoverfladen adgang. Når dyret er anbragt, er det sandsynligt, at flere minutter kan være required at opnå god stabilitet brændplanet. Derfor anbefales det, at kontrollere for væv afdrift inden lanceringen optagelsen købet. Fordi denne proces sammen med udvælgelsen af områder af interesse kan vare et stykke tid, er det også anbefales at regelmæssigt kontrollere, at dyret er bevidstløst hvis Ketamin / xylazin er blevet anvendt, og for at kontrollere for korrekt nedsænkning af objektiv som lækage og fordampning kan forekomme.
Den gode placering af gummiring på kraniet er endnu et vigtigt skridt i processen. Cyanoacrylat lim giver gode resultater i form af stabilitet og forsegling, men man skal undgå overdreven belastning af lim, som kan dække kraniet og blokere adgangen til området af interesse af vævet. Fordelen ved direkte nedsænkning af kraniet uden et dækglas er at få adgang til dybere områder af knoglen. Eftersom kraniet er ikke en plan overflade, vil dette ikke begrænse den billeddannende område til contact overflade mellem kraniet og dækglasset, som tillader en bred billeddannelse felt, som vist i figur 1.
For alle billedteknologi, valget mellem erhvervelse hastighed og opløsning kvalitet er et kompromis. Således er antallet og kvaliteten af de billeder pr tidsenhed er begrænset, og valget afhænger af den videnskabelige spørgsmål behandles. Typisk vaskulære monocytter hurtigt rullende celler, hvorimod parenkymale monocytter er langsomme bevægelige eller siddende. En nøjagtig sporing af rullende celler kræver højere tidsopløsning overtagelsestidspunktet, som vist i figur 2. Høj billedbehandling sats for fastsiddende celler er ubrugelig og høje x, y, kan z opløsning foretrækkes at analysere protrusive aktivitet af dendritter f.eks. Hurtig celler ville kræve tykkere volumen for at få en længere sporing af deres fordrivelse i z.
Den gennemsnitlige firkantede forskydning som en funktion af tiden ikke er fastsat af softwaren Imaris. Det Principle af denne repræsentation baseret på det faktum, at for et objekt rejser ballistisk uden møde eller strukturel konstriktion, ville afstanden det rejste være proportional med tidsintervallet (figur 2D). Således linearitet hældningen angiver en random walk i et ikke begrænset miljø. I modsætning hertil ville asymptotisk kurvens form afspejle en begrænset forskydning over tid af cellepopulationen. Den anden fordel ved denne beregning er, at hastigheden undertiden overvurderet med kulturgenstandsspor forskydning af tyngdepunkt. Dette er især vigtigt for langsom motile celle med protrusive aktivitet. Således beregning af motilitet koefficient af kurvens hældning beregnes ved lineær regression indikerer en reel forskydning af cellover tid 21.
Ly6G farvning in vivo illustrerer muligheden for at tilføje en ny parameter analyse under den billeddannende proces (Figur 3 et al i pressen). Selv om mere end 98% af vaskulære neutrofiler mærkes korrekt, farvningen af knoglemarv neutrofiler er mindre effektiv, og den gennemsnitlige fluorescensintensitet er stærkt reduceret, hvilket tyder på reduceret adgang af antistoffet mod knoglemarven parenkym (data ikke vist). Rhodamin dextran, quantum dots, eller andre særlige farvestoffer af apoptotiske eller nekrotiske celler, såsom Dapi propidiumiodid, sytox 22 eller fluorescerende reporter for cellefunktioner såsom produktion af reaktive oxygenarter 23, kan tilsættes intravenøst gennem halevenen under billedbehandling proces og giver en god mulighed for at kvantificere funktionelle egenskaber såsom celledød, fagocytose og neutrofil ekstracellulære fælde. Mazo et al 12 pænt brugt to forskellige vaskulære farvestoffermed lav og høj molekylvægt til bedre kontrast parenkym og vaskulaturen. Valget af det fluorescerende farvestof er kritisk for at tillade samtidig erhvervelse af forskellige fluorescerende reportere. Faktisk vil excitationsbølgelængden vælges i overensstemmelse hermed for at få det bedste kompromis mellem alle brugte fluorescerende farvestoffer.
Protokollen anvendt heri gør det muligt at analysere in vivo biologiske aktivitet af en celle rum, studie, som var vanskeligt hidtil. Histologisk analyse af knoglemarvsvæv normalt kræver en lang forberedelse af knogle afkalkning at tillade tynd sektion, og det kun giver en statisk opfattelse af vævet. Den dynamiske opfattelse fremhæver hastigheden af celle udveksling mellem parenkym og knoglemarv sinusoids. Denne hurtige proces er et vigtigt skridt til at dechifrere for at få en bedre forståelse af celle mobilisering mekanisme ved inflammatorisk signal 5 eller prækonditionering myeloaplasive kemoterapiregime 6. Vi har rapporteret tilfælde af celle intravasation 6, men denne proces er næppe påviselig grund af den lave frekvens ved steady state. Det er imidlertid sandsynligt, at blive styrket ved inflammatorisk signalering. Kemokinreceptorer såsom CCR2, CX3CR1 eller CXCR4 er stærkt impliceret i processen intravasation dermed anvendelse af genetisk ugyldiggørelse af disse receptorer bør give hidtil ukendte grundlæggende indsigt i veje cellemigrering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Anne Daron og Pierre Louis Loyher til redaktionel bistand, Plateforme imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) for at få hjælp med to-foton mikroskop og dyret Facility "NAC" og Camille Baudesson for mus avl assistance. Den forskning, der fører til disse resultater, er udført med støtte fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskudsaftale n ° 304810 - razziaer, og n ° 241440-Endostem, fra Inserm, fra Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", fra la" Ligue contre le cancer ", fra" Foreningen pour la Recherche sur le Cancer "og fra" Agence Nationale de la Recherche "Program Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). PH blev støttet af la "Ligue contre le cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
- Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
- Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
- Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
- Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
- Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
- Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).
