Protocol
OBS: Samtliga experimentprotokoll godkändes av den franska djurförsöks och etikkommittén och godkänts av den "Service Protection et Santé Animales, Environnement" med nummer A-75-2065. Provstorlekar är valda för att säkerställa reproducerbarhet av experimenten, och enligt 3R djuretik reglering.
1. Beredning av Mouse
- Anestesi
- För kort period av avbildning (mindre än en timme), söva musen med en intraperitoneal injektion av 200 | il av en saltlösning innehållande ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg).
- Alternativt, för längre period av avbildning (upp till 4 timmar), söva musen med en inandning av isofluran 2,5% förångas i en 70/30 blandning av O2 / N2O, genom ett anpassat masken.
- OBS: Detta sätt ger stabilare medvetslöshet och undviker serie intraperitoneal injektion av narkotika. När musen är sövd, kontrollera medvetslöshet genom stimulering av foten pad med avbitartång.
- Vaskulär färgning / ytterligare färgning
- För vaskulär färgning: Injicera intravenöst i svansvenen, 200 pl av rodamin-dextran (2 MDA 10 mg / ml i koksaltbuffert).
- För neutrofil färgning: injicera 2 pg av Ly6G-PE (klon 1A8) i 100 | il koksaltlösning intravenöst i svansvenen.
- Immobilisering
- För immobilisering, använd en skräddarsydd stereotaktisk innehavaren anpassad till mikroskop och till anestesigasen inhalator.
OBS: sterotactic innehavaren är ett metallfäste med två metallplatta konsoler, en är fast och den andra flyttbara och anpassnings, att strama djurets huvud. - Installera huvudet av musen mellan fästplattorna för att säkerställa isolering från andningsrörelser. Dra öronen mellan fästplattor och huvudet att sträcka ski. Kontrollera om stabilitet och andas djurens välbefinnande.
- För immobilisering, använd en skräddarsydd stereotaktisk innehavaren anpassad till mikroskop och till anestesigasen inhalator.
- Ta hårbotten
- Använd försiktigt etanol 70% att väta håret i hårbotten med en steril applikator, undvika kontakt med ögonen.
- Skär huden med steril sax och avbitartång för att helt ta bort hårbotten från bakåt i hjässben till pannbenet. Håll borta upp till 3 mm från ögon och öron för att förhindra omfattande blödning. Avlägsna lös bindväv som täcker skallen (benhinnan). Tvätta ut resterande håret med varmt PBS-indränkt pappershandduk.
- Immersion system som inrättats
- Klistra in en gummiring med 18 mm diameter med kirurgisk lim direkt på skallen med hjälp av en liten nål för att kontrollera distributionen. Limma hela periferin av gummiringen för att förhindra läckage (30 pl bör vara tillräckligt).
- Rengör skallen under ringen en sista gång med PBS-indränkt pappershandduk och sedan lägga 37 ° C PBS för fullständig nedsänkning avskalle. Lägg en droppe NaCl 0,9% lösning eller specifik oftalmisk salva på varje öga på musen för att undvika ögon torrhet. Dra stereotaktisk hållare under målet.
- Ungefär placera fältet med hjälp av mikroskop okular genom direkt överföring.
2. Två-foton Imaging Acquisition
- Använd en multifotonmikroskop tillsammans med en Ti: Safirglas laser, vilket ger 140fs pulser av NIR ljus, selektivt avstämbara från 680 till 1.080 nm, och en akustisk-optisk modulator för lasereffektstyrning. Använd en konfiguration inklusive 3 externa icke-descanned detektorer (NDD) (som möjliggör samtidig inspelning av 3 fluorescerande kanaler) med en kombination av två dikroiska speglar (565 nm och 690 nm), 565/610 och 500/550 bandpassfilter, och ett 485 kort passfilter, med en plan Apochromat × 20 (NA = 1) vattenimmersionsobjektiv.
- Ställ in värmekammare för att tillåta god homeothermy av anaesthetized mus.,
OBS: Temperatur kan ställas in 1 timme innan avbildning session för bättre stabilitet. I vårt fall, har 32 ° C valts för att få en optimal kroppstemperatur sövda mus (36-37 ° C) och hålls upp till 4 tim. Denna temperatur kan anpassas till det system som används (digitala sonden kan användas för att kontrollera denna punkt). Dessutom är värmekammaren används mörk / svart och täcker en del av systemet (mål och motoriserade plattan) för att undvika extern kontamine ljus. - Slå på systemet
- Slå på Ti: Sapphire laser, då hela mikroskopsystemet. Starta förvärv programvara. Ställ laservåglängdsområdet till 870 nm. Välj lämplig NDD för inspelning.
OBS: I vårt fall är andra harmoniska generationen (SHG) 19 och cyan fluorescerande protein (ECFP) detekteras av NDD efter 485 kort passfiltret. ECFP detekteras också av NDD efter 500/550 bandpassfiltret och rodamin-dextran detekteras genom than NDD efter 565/610 bandpassfiltret.
- Slå på Ti: Sapphire laser, då hela mikroskopsystemet. Starta förvärv programvara. Ställ laservåglängdsområdet till 870 nm. Välj lämplig NDD för inspelning.
- Justera förvärvs inställningar
- Använd "live förvärvet" imaging behärskar programvaran och använda mikroskopet styr, ställa in skärpan på en region med ECFP och Rodamin signal. Ställ in lasereffekten till ett minimum för att erhålla bästa signal-till-brusförhållandet med minimal fotoskada.
OBS: Den effektinställning som används varierar beroende på djupet av regionen av intresse. Typiskt AOM inställningarna ligger runt 20%, vilket motsvarar en lasereffekt utöver målet runt 15 mW. Det är bättre att öka vinsten makten på PMTs för varje NDD att minska fotoblekning och foto skador. Typiska förvärvs inställningar är singel skanning med en pixel uppehållstid av 1.58 ps, och en upplösning på 512 x 512 pixlar med en 1,5 gångers förstoring.
- Använd "live förvärvet" imaging behärskar programvaran och använda mikroskopet styr, ställa in skärpan på en region med ECFP och Rodamin signal. Ställ in lasereffekten till ett minimum för att erhålla bästa signal-till-brusförhållandet med minimal fotoskada.
- Välj regioner av intresse
- När inspelningsparametrar är inställda, använda igen den "live" förvärvs kommandot,och kartlägga vävnaden att välja en önskad (x, y, z) fält som ska övervakas i realtid.
OBS: Vanligtvis valde vi ett fält inkluderande såväl kärl- och parenkyma områden. - Registrera fältet med "positionen" programkommando.
NOTERA: Detta kommando memorerar x, y, z-koordinater för olika avlägsna områden. - Välj och registrera ytterligare intresseområden (upp till 3) med samma metod.
- Ställ en 3D z-stack med "z-stack" kommando programvara på den första memorerade läget efter önskad volym med valt förstoring. Memorera djupare läge först, och sedan det högsta läget. Normalisera lasereffekt med djupet.
OBS: För flera samtidig fält avbildning, vi förvärvar fem skivor åtskilda av 3 ìm z-steg för varje fält för att förvärva en volym på 12 um tjocklek. Dessa inställningar kan anpassas till den typ av cell studeras.
- När inspelningsparametrar är inställda, använda igen den "live" förvärvs kommandot,och kartlägga vävnaden att välja en önskad (x, y, z) fält som ska övervakas i realtid.
- Starta förvärv
- Välj220; tidsserier "programvara kommandot och välj hur länge tidsintervall och antal cykler. Börja tidsförlopp avbildning enligt tidsförlopp och varaktighet som krävs genom att välja "starta experimentet" programkommando.
OBS: I vårt fall, vi förvärva en volym vardera 30 sek under 60 cykler som representerar 30 min realtid. Mindre tid förfaller kan utföras för att spåra snabb cellvalsning i blodkärlet. I detta fall tunnare z-stack och högst 2 olika områden kan spelas in samtidigt. - Regelbunden kontroll av inrättandet.
- Övervaka alltid djuret att se till att den är medvetslös.
OBS: Skaka av whiskers eller ben av djuret är indikatorer på väckelse. I fall djurets andning är ryckig, kan kvantiteten av isofluran vara något reducerad. Stark vävnad Avvikelsen under Förvärvet är en indikator på mus väckelse. - Se till målet är ordentligt nedsänkt. Förnya 37 ° C PBS between två förvärv (30 min).
OBS: Progressiv försvinnande signal under förvärvet är indikator på PBS läckage.
- Övervaka alltid djuret att se till att den är medvetslös.
- Välj220; tidsserier "programvara kommandot och välj hur länge tidsintervall och antal cykler. Börja tidsförlopp avbildning enligt tidsförlopp och varaktighet som krävs genom att välja "starta experimentet" programkommando.
- Slutet av förfarande
- När de nödvändiga videor registreras, avliva djuret genom halsdislokation snabbt innan återupplivning.
OBS: sårläkning leder till bildning av en sårskorpa i 24-48 h, vilket begränsar möjligheten att utföra längsgående avbildning.
- När de nödvändiga videor registreras, avliva djuret genom halsdislokation snabbt innan återupplivning.
3. Dataanalys
- Drift korrigering
- Använd Imaris Bitplane programvara för 3D automatisk spårning.
- Öppna 3D bildsekvensen på Imaris. Välj "spot" kommandot, och generera manuell spårning (musklick + shift) för alla tidpunkter i minst fyra olika fästpunkter, om möjligt homogent fördelade i fält.
- Applicera avdrift korrigering med hjälp av "rätt drift" kommando i "edit spåret" -fliken.
- Kontrollera om tHan kvaliteten av korrigeringen i x, y och särskilt i z för att undvika artefactual vacklan.
OBS: Om korrigeringen inte är tillfredsställande, prova andra ankarpunkter eller utesluta videon från analysen.
- Cell spårning
- Använd "lägga till nya fläckar" kommandot och välj "spår fläckar över tiden" algoritm inställning. Gå till nästa steg.
- Applicera automatisk spårning cellförfarandet antingen på hela kanal av intresse att använda "källkanalen" kommandot. Set föremål (dvs celler) i diameter till 10 um. Gå till nästa steg.
OBS: Valet kommer att bero på skillnaden mellan objekt och specificitet för den uppmätta signalen. Kort sagt, är möjlig automatisk spårning på hela kanalen endast om detekterade signalen är specifik för föremålet av intresse. Eftersom både SHG och ECFP detekteras av NDD efter 485 korta pass filter, kommer spårning vara mer specifik och effektiv användning av ECFP signalen registreras av NDD efter 500/550 bandpassfilter. Klustrade eller tät packade objekt kommer att kräva manuellt val av enskilda objekt som liknar steg 3.1.2. - Välj "kvalitet" filtertyp, sätta gränsen för att utesluta spårning av ospecifika föremål. Gå till nästa steg.
- Välj "Brownsk Algoritm Motion" med exakta parametrar för "Max avstånd" och "Gap storlek" mellan två punkter. Validera spår generation.
- När spåren beräknas automatiskt, välj "track längd" filtertyp, sätta gränsen för att eliminera spår kortare än 120 sek (representerande fyra tidpunkter).
- Obligatorisk: Efter automatisk spårning, kontrollera kvaliteten på spåren.
- Rulla ut tidsfältet för att kontrollera att objekten följer spårvägarna. Om inte, använd alternativen spårpunkt korrigering tillgängliga i "redigera", fliken: Radera falska eller felaktiga spår med "radera" kommandot (ta bort alla spår point individuellt med "koppla från" kommando). Om spårbana är diskontinuerlig, lägga saknade tidpunkter (musklick + shift), markera alla punkter på en viss bana, och använd "connect" kommando i "edit spåret" -fliken.
- Kvantifieringsmetoder parametrar
- Välj "Statistik" fliken i "Inställningar" kommandot, välj de dynamiska parametrarna av intresse i listan. Välj "Exportera all statistik till fil" kommando och spara Excel-fil som genereras.
OBS: Flera dynamiska parametrar direkt erhålls från program som spårlängder, momentan hastighet, medelhastighet, och spåra rakhet. Motilitet koefficienten 6, kan 20 bestämmas men tillhandahålls inte direkt av programvaran. - För varje cell, beräkna medelvärdet av förskjutningarna för varje tidsperiod (AT) (för en 30 sek tid förfaller film, kommer At att vara 30, 60, 90 sek, etc).Rita medelvärdet av torget förskjutning som funktion av tidsintervallet. Erhåll motilitet koefficient genom att beräkna lutningen av den linjära delen av kurvan.
- Välj "Statistik" fliken i "Inställningar" kommandot, välj de dynamiska parametrarna av intresse i listan. Välj "Exportera all statistik till fil" kommando och spara Excel-fil som genereras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus skallen struktur ger ett bra tillfälle att studera benmärgen fysiologi genom intravital avbildning. Benet är tunna runt front parietalceller området, är det möjligt att få tillgång till medullär nischer utan nötning av benet. Figur 1 representerar ett brett 2D fält skallen av en MacBlue transgen mus. Matrisen ben består huvudsakligen av kollagen jag lätt detekterbar med SHG 19. Injektion av rodamin-dextran fläckar kärlnätet i benmärgen och möjliggör identifiering av parenkymal benmärgs nischer mellan matris ben och kärlen 14. ECFP Cellerna fördelas i de två facken i benmärgen, men är frånvarande från benmatrisen. Monocyter manuellt klassificeras enligt deras placering i vävnaden. Vaskulär monocyt definieras när hela cellen är inom vaskulaturen, bortsett från storleken på kärlet. Endast stora uppsamlings venoler utesluts från vår aNALYS. Parenkymal monocyt definieras när cellen är belägen mellan vaskulaturen och benmatrisen.
Time-lapse avbildning av specifik region av intresse (tilläggs video 1 och 2) gör det möjligt att beräkna individuella cell bana över tid för antingen vaskulär (Figur 2A) eller parenkyma (Figur 2B) monocyter. Spårlängd visar att parenkyma monocyter display reducerade förskjutning jämfört med kärl monocyter. Analys av förskjutningen över tid jämför medelhastigheten av monocyter i båda fack (Figur 2C). Medelkvadrat förskjutning som en funktion av tiden är ett mått på den geografiska omfattningen av slumpmässig rörelse. Motilitet koefficient bestäms av lutningen hos den linjära delen av kurvan och ger en bättre uppfattning om cellförskjutning (se diskussion avsnitt). Den motilitet koefficient kärl monocyter (MC = 71μm² / s) är högre än motilitet coefficient av parenkyma monocyter (MC = 4.4μm² / s).
Den tidsupplösning på förvärv skall anpassas till den genomsnittliga cellhastigheten. Rolling kärl monocyter kan göra viktiga förskjutning inom en kort tidsfördröjning. För en mer exakt cell spårning, minska tidsintervallet förvärvs är att föredra. Figur 3 visar en illustration av monocyt spårning med två olika tids upplösningar. En 30 sek tidsintervall minskar noggrannheten liksom längden av banorna (i grönt streckad linje) jämfört med 10 sek tidsintervall.
Slutligen visar figur 4 illustrerar en möjlighet att analysera en annan cell delmängd samtidigt till monocyter. Ly6G är en specifik markör av mogna mus neutrofiler. Injektionen av anti-Ly6G kombinerat med en fluorokrom (i det här fallet Phyco-erythrin) 5 min innan bildsekvens fläcken neutrofiler direkt in vivo. Detta tillvägagångssätt ger en ytterligare dimension av analys och möjligheten att jämföra beteendet hos de olika cellgrupper. Sådan strategi skulle kunna användas för att definiera delmängder i monocyten fack.
Figur 1. Brett fält av skallen benmärgs organisation. In vivo två-foton-lasersvepmikroskopbild av skallen steady state benmärg från MacBlue mus. Kärl (i rött) färgas med svansen förgäves injektion av 2MDa rodamin-dextran 5 min innan avbildning session. Benet visualiseras genom andra harmoniska generationen (blå). ECFP + monocyter (Cyan) ligger inom parenkyma nischer (mörka områden mellan kärl och ben) och inom kärlen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Real tidredovisning cell. Representativa spårvägarna längs tid av monocyter inom (A) kärl och (B) parenkymet. Spår (grön linje) för varje cell genereras automatiskt av programvaran. Röda prickar representerar masscentrum spårade celler. (C) Mean hastighets jämförelse mellan vaskulära och parenkyma monocyter. Mann-Whitney statistisk analys har utförts, *** betecknar p <0,001. (D) medelkvadrat förskjutning (MSD) som en funktion av tiden representeras för vaskulära och parenkyma monocyter. Asymptotisk kurvan anger den begränsade förflyttningen av cellerna över tiden, medan linjär kurva indikerar slumpvandring i en icke-constrained miljö. Motilitet koefficient indikerar omfattningen av cellförskjutning och bestäms av lutningen på c Urve beräknas genom linjär regression. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Tidsintervall upplösning i studien av rullande monocyter. Representativa bildsekvenser visar att ökad tidsupplösning förbättrar precisionen i den rullande cell bana. (Upp) Bild sekvens med 10 sek tidsintervall. (Ned) Bild sekvens med 30 sek tidsintervall. Kvaliteten på spårbanan förbättras och risken för överväger två olika celler för samma eller motsatt minskas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. In vivo samlokalisering av medullär neutrofiler och monocyter. Illustrerar Denna siffra möjligheten att upptäcka en annan cell delmängd in vivo samtidigt med monocyter, genom att injicera specifik monoklonal antikropp i kombination med en fluorokrom. 2 pg av Ly6G-PE-antikroppen har injicerats intravenöst 5 min innan skallen benmärgs avbildning av MacBlue musen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1. flyttande beteende parenkyma monocyter. In vivo 3D-avbildning av steady-state flyttande aktivitet monocyter i skallen benmärgen parenkymet av en MacBlue mus. Den ECFP + signalen är i cyan. Flytt vägar för varje cell (röd prick) visas i grönt.
Kompletterande video 2. flyttande beteende kärl monocyter. In vivo 3D-avbildning av steady-state flyttande aktivitet monocyter i skallen benmärgen kärl av en MacBlue mus. Den ECFP + signalen är i cyan. (2M Da) rodamin-dextran injicerades innan avbildning session att skilja benmärgen vaskulaturen (röd). Flytt vägar för varje cell (röd prick) visas i grönt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska punkterna i in vivo imaging metodik är att säkerställa stabiliteten i fokus för att maximera längden på avbildning och för att minimera risken för bakterieangrepp och inflammation, vilket kan påverka dynamiken i de inflammatoriska cellerna. Imaging av skallen benmärg följer dessa mål som operationen utförs för att få tillgång till benmärgen är minimal. Användandet av sterilt material och antiseptika är viktigt att begränsa risken för infektion som kan framkalla störningar i cell homeostas.
Utvecklingen av den stereotaktiska innehavaren kan vara utmanande och kräver särskild anpassning för varje system (avståndet mellan objektiv och motoriserad skede av mikroskop, användning av gas inhalator för anestesi). Det är viktigt att få huvudet av musen så horisontell som möjligt för en bredare tillgång bildyta. När djuret är placerat, är det sannolikt att flera minuter kan vara required att få god stabilitet fokalplanet. Därför rekommenderas det att kontrollera om vävnads drift innan du startar förvärvs inspelningen. Eftersom denna process tillsammans med valet av regioner av intresse kan pågå ett tag, är det också rekommenderas att regelbundet kontrollera att djuret är medvetslöst om Ketamin / Xylazin har använts, samt att kontrollera för korrekt nedsänkning av målet som läckage och avdunstning kan inträffa.
Den goda placeringen av gummiringen på skallen representerar annan avgörande steg i processen. Cyanoakrylatlim ger goda resultat i form av stabilitet och tätning, men man måste förhindra överdriven belastning av lim, vilket skulle kunna täcka skallen och blockera åtkomst till området av intresse av vävnaden. Fördelen med direkt nedsänkning av skallen utan ett täckglas är att få tillgång till djupare regioner av benet. Dessutom, eftersom skallen är inte en plan yta, kommer detta inte att begränsa avbildningsområdet till conkontaktyta mellan skallen och täckglas, vilket gör att en bred bildfältet, som det visas i figur 1.
För alla avbildningstekniker, är valet mellan förvärvs hastighet och upplösning kvalitet en kompromiss. Således är antalet och kvaliteten på bilder per tidsenhet begränsad, och valet beror på den vetenskapliga frågan behandlas. Normalt är kärl monocyter snabbt rullande celler, medan parenkyma monocyter är långsamma rörliga eller fastsittande. En exakt spårning av böljande celler kräver högre tidsupplösning förvärvs, som visas i figur 2. Hög bildhastighet för fastsittande celler är värdelös och höga x, y, z kan upplösningen vara att föredra för att analysera UTSTÅENDE aktivitet dendriter till exempel. Snabba celler skulle kräva tjockare volym för att få en längre spårning av deras förskjutning i z.
Medelkvadrat förskjutning som funktion av tid är inte tillhandahålls av programvaran Imaris. Den Principle i denna representation grundas på det faktum att det för ett föremål som reser ballistiskt utan möte eller strukturell förträngning, skulle avståndet den reste stå i proportion till tidsintervallet (Figur 2D). Således linearitet lutningen indikerar en slumpvandring i en icke-ansträngd miljö. Däremot skulle asymptotisk formen på kurvan avspeglar en begränsad förskjutning över tiden av cellpopulationen. Den andra fördelen med denna beräkning är att hastigheten ibland överskattas med artefactual förskjutning av tyngdpunkten. Detta är särskilt viktigt för långsam rörliga cell med UTSTÅENDE aktivitet. Sålunda indikerar beräkning av motilitet koefficienten av lutningen av kurvan beräknades genom linjär regression en verklig förskjutning av cellover tiden 21.
Ly6G färgning in vivo visar möjligheten att lägga till en ny parameter för analys under avbildningsprocessen (Figur 3 et al i press). Även om mer än 98% av den vaskulära neutrofiler är korrekt märkta, är mindre effektiv färgning av benmärgs neutrofiler, och den genomsnittliga fluorescensintensiteten är starkt reducerad, vilket tyder minskad tillgång av antikroppen mot benmärgs parenkymet (data visas ej). Rodamin dextran, kvantprickar eller andra specifika färgämnen av apoptotiska eller nekrotiska celler såsom Dapi, Propidiumjodid, Sytox 22, eller fluorescerande reporter för cellfunktioner såsom produktion av reaktiva syreradikaler 23, kan läggas intravenöst genom svansvenen under avbildning processen och erbjuder ett bra tillfälle att kvantifiera funktionella egenskaper såsom celldöd, fagocytos och neutrofil extracellulär fälla. Mazo et al 12 använde fint två olika vaskulära färgämnenmed låg och hög molekylvikt för att bättre kontrast parenkymet och vaskulatur. Valet av det fluorescerande färgämnet är kritisk för att möjliggöra samtidig förvärv av de olika fluorescerande reportrar. I själva verket kommer excitationsvåglängden väljas därefter att få den bästa kompromissen mellan alla begagnade fluorescerande färger.
Det protokoll som används häri gör det möjligt att analysera in vivo biologiska aktiviteten hos en cellavdelning, studie av vilka var svårt hittills. Histologisk analys av benmärgsvävnad kräver oftast en lång förberedelse av ben avkalkning att tillåta tunt avsnitt, och det bara ger en statisk bild av vävnaden. Den dynamiska uppfattning belyser graden av cellutbytet mellan parenkymet och benmärgs sinusoiderna. Denna snabb process är ett viktigt steg för att dechiffrera för att få en bättre förståelse av cellmobilisering mekanismen vid inflammatorisk signal 5 eller konditionering myeloaplasive kemoterapiregim 6. Vi har rapporterat fall av cell intravasering 6 men denna process är knappt detekterbar på grund av den låga frekvensen vid steady state. Det är dock sannolikt att förbättras på inflammatorisk signalering. Kemokinreceptorer såsom CCR2, CX3CR1 eller CXCR4 är mycket delaktiga i processen för intravasering, därav användningen av genetisk ogiltigförklarande av dessa receptorer skulle ge nya grundläggande insikter i banorna av cellmigration
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Anne Daron och Pierre Louis Loyher för redaktionellt bistånd Plateforme imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) för hjälp med de två-photon mikroskop och djuret Facility "NAC" och Camille Baudesson för möss avel hjälp. Den forskning som leder till dessa resultat har erhållit finansiering från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7 / 2007-2013) under bidragsavtal n ° 304.810 - RAID, och n ° 241.440-Endostem, från Inserm, från Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", från la" Ligue contre le cancer ", från" Föreningen pour la Recherche sur le Cancer "och från" Agence Nationale de la Recherche Programme Emergence "2012 (ANR-EMMA-050). PH stöddes av la "Ligue contre le cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
- Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
- Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
- Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
- Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
- Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
- Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).
