Summary
发炎的内皮从流动招募白细胞的能力是由间充质基质细胞调节。我们描述两个体外结合原代人细胞，它可以用于从流动评估中性粒细胞募集和检查的作用是间充质基质细胞在调节这个过程中发挥的模型。
Abstract
基质细胞调节通过与邻近血管内皮细胞的串扰炎症时白细胞流传的招聘。在这里，我们介绍两个体外 “血管”模型研究了发炎的内皮细胞流动循环中性粒细胞的招募。这些模型的一个主要优点是分析中的白细胞粘附级联的每个步骤，以便，如将发生在体内的能力。我们还描述了这两种模式如何可以适于研究的基质细胞的作用，在这种情况下，间充质干细胞（MSC），在调节白细胞募集。
初级内皮细胞单独或一起进行培养与人类的MSC在Ibidi microslides或在Transwell滤膜24小时的相对侧直接接触。培养物刺激肿瘤坏死因子（TNFα）4小时，掺入基于流的粘附试验。嗜中性粒细胞的丸灌注在内皮4分钟。嗜中性粒细胞流入和它们与内皮相互作用的捕获是可视化通过相衬显微镜。
在这两种模式，细胞因子刺激增加流动中性粒细胞内皮招聘呈剂量依赖性。招募嗜中性粒细胞的行为的分析表明剂量依赖性减少轧制和通过内皮的剂量依赖性增加轮回。在共培养，MSC抑制中性粒细胞粘附到TNFα刺激的内皮细胞。
我们基于流的粘连模型模拟白细胞招聘的初始阶段的循环。除了白细胞，它们可以被用来检查其它类型的细胞，如治疗给药的MSC或循环肿瘤细胞的募集。我们的多层共培养模型已经表明，MSC与内皮通信以修改其响应于促炎细胞因子，alteri纳克中性粒细胞的招募。采用这种模式需要进一步研究，充分了解来自不同组织和条件（炎症性疾病或癌症）如何基质细胞在炎症过程中影响白细胞的招募。
Introduction
炎症是对微生物感染或组织损伤的保护性反应，需要白细胞条目的紧调节进入和退出从发炎组织，以允许第1,2。内皮细胞（EC），该行的血管，循环白细胞和组织驻留基质细胞之间的串扰是用于协调该过程3是必不可少的。然而，白细胞不受控制招聘和他们的无效间隙支撑的慢性炎症性疾病4的开发。我们目前在健康和疾病白细胞募集的理解是不完整的，还需要更可靠的模型来分析该过程。
通过血管EC的毛细血管后静脉支持从血液内白血球的招聘机制已经很好地描述1,2,5。循环白细胞是通过专门的受体（ 例如，VCAM-1，E-选择素，P-选择素）捕获该正在上调对发炎内皮。这些短暂的相互作用使白细胞与表面结合趋化因子和脂质衍生的介质（或内皮细胞间质或起源）的激活白细胞6 11表达整合互动。这反过来又稳定穿过内皮和进入组织12- 15粘附和驱动器迁移。在组织，招募白细胞受到影响他们的运动，功能和存活16,17基质衍生剂。越来越多的证据有力地表明，信号在招聘过程中条件的白细胞在接下来的每个阶段获得。然而，我们的白细胞招聘的认识仍然不完整，很少有人知道组织内的组件整形白细胞的运动。
在伯明翰，我们已经开发出多种体外 “血管”的车型，从研究白细胞招聘流9,18,19。我们现在明白了，白细胞募集血管EC充当即时监管响应变化的局部微环境。具体地，组织驻留基质细胞可以通过与邻近血管EC交谈来影响在招募3的作用积极调节炎症反应，这部分。我们以前曾表明，各种基质细胞调制EC中以支持粘附和白细胞的迁移以组织特异性方式的能力，而且，这些效果变得改变在慢性疾病13,16,20,21。因此，基质细胞建立组织'地址代码'定义每个炎性应答22的上下文中。最近，我们已经表明，骨髓来源的MSC（BMMSC）有力地下调欧盟的细胞因子的反应，导致减少在这两个中性粒细胞的招募和淋巴细胞23。
该机制GOVerning招聘阐明在体外已大量使用纳入一个单一的细胞类型（ 例如，EC）或蛋白质隔离检测。然而，这些研究并没有考虑到局部组织环境的影响（ 即，基质细胞的存在下）对招募白细胞及其随后迁移进入组织。在这里，我们描述了两个基于流的方法，其中的基质细胞，特异性间质干细胞（MSC），是共培养EC 23。这种模型允许我们检查基质细胞对内皮反应的影响，特别是它们从流支持白细胞募集的能力。
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Protocol
1.隔离初级人内皮细胞和间充质干细胞的培养和
- 分离和培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）：
- 放脐带上用纸巾托盘和喷雾用70％的乙醇。放置在组织培养罩。识别静脉导管插入并在两端。周围放置的空心端部的电缆扎带将其固定。
- 洗出静脉血使用PBS中的注射器。填充注射器与空气和通过静脉拆除和丢弃残留的PBS。
- 解冻10毫克/毫升胶原酶IA和稀释在PBS中1:10的（钙和氯化镁），以1毫克/毫升的最终浓度。通过胶原酶溶液注入静脉直到两个套管填充。合上套管夹子两端。
- 覆盖组织的托盘和喷雾用70％的乙醇。将线插入孵化20分钟，在37℃和5％的CO 2。
- 走线出来孵化器和收紧扎带。轻轻按摩线，持续1分钟。冲洗出的细胞悬浮液用10毫升PBS中，并收集在一50ml离心管中。
- 填注射器与空气和穿过静脉以除去任何残余的PBS两次，收集的PBS中，在步骤1.1.5中使用的50ml离心管中。离心，在400×g离心5分钟，在室温。
- 吸上清，重新悬浮颗粒1毫升完整的EC中。 EC介质由M199补充有35微克/ ml的硫酸庆大霉素，10纳克/ ml人表皮生长因子，1μg/ ml的氢化可的松，2.5微克/毫升两性霉素B，和20％胎牛血清的。
- 添加4毫升EC中，欧盟暂停了25 平方厘米烧瓶中。改变在翌日的介质中，然后每隔2天。
- EC表现出鹅卵石样形态（ 图1AI）。对于附着力测定，EC一般播种，当他们达到100％汇合（参见1.4节
- 孤立于人类脐带沃顿商学院的果冻间充质干细胞（WJMSC）的：
- 从新鲜脐带或从已经被用于分离乳油帘线隔离脐带胶质衍生的MSC（WJMSC）。剪脐带成5厘米长的段。削减每一块纵向揭示血管（动脉2 [白，刚性]和1静脉[黄，腹胀]）。
- 使用无菌剪刀和镊子除去血管并丢弃。切取组织为2 - 3 mm 3的碎片。使用镊子代替2 - 3 mm 3的片放入50毫升的离心管中。
- 解冻100毫克/毫升的库存胶原酶II型和稀释1：100在10毫升PBS中至1毫克/毫升的最终浓度。解冻20000 U / ml的透明质酸酶的库存和稀释1：400至50单位/毫升的胶原酶溶液的最终浓度。
- 添加酶鸡尾酒到含有组织碎片的离心管中。孵育组织fragmenTS 5小时，于37℃在缓慢旋转。
- 稀释细胞悬液1:5的PBS。放置一个100微米的微孔过滤到一个新的50ml离心管中。倾细胞悬液到100微米孔径的过滤器。
注：剩余的组织碎片会保留在过滤器上和细胞将被收集在50ml离心管中。 - 丢弃的过滤器。离心细胞悬浮液在400×g离心在室温10分钟。吸去上清液和重悬WJMSC沉淀于12ml完全WJMSC培养培养基（DMEM低葡萄糖，10％FCS和100U / ml青霉素+ 100微克/毫升链霉素的混合）。
- 种子在75 平方厘米的组织培养瓶中的所有细胞。 24小时，用12ml完全WJMSC培养基后改变介质。更换培养基，每2 - 3天。 2周内80％汇合 - 细胞应达到70。通过在WJMSC达到70％ - 80％汇合（参见1.4节 ）。
- 膨胀的骨髓来源的MSC（BMMSC）：
- 通过将在37℃的水浴中2分钟，解冻P2 BMMSC的小瓶。添加BMMSC悬浮于含有MSCGM的离心管中。吹打拌匀。
- 离心，在400×g离心5分钟，在室温。吸上清彻底。
- 重悬的细胞在1ml MSCGM和计数使用血球或数字计数器细胞的细胞，例如一个cellometer。
- 种子细胞成75cm 2的培养瓶中，在5000的密度-每cm 2 6000细胞于12ml MSCGM。 24小时，用12ml MSCGM后改变介质。料的细胞用12ml MSCGM每2 - 3天。
- 通过当BMMSC达到70％ - 80％汇合（参见1.4节 ）。细胞表现出成纤维细胞形态（ 图1Aii）。
- 对于MSC，3毫升培养液重新悬浮颗粒的传代。添加11毫升培养基成三个独立75cm 2的培养瓶中。加入1毫升细胞悬浮液，以每个培养瓶（1：3分割）。通道WJMSC和在共同培养测定使用前BMMSC 3次（P3）。
- 对于播种EC或MSC附着力试验-见第2和第3。
- 3代MSC分离在1.4节所描述的。吸上清，重悬在3毫升冰冷的CryoSFM。吸管1ml等分细胞悬浮到1.5毫升冰冷冷冻管。放冷冻管在冷冻容器中。
- 存储容器在-80°CO / N。转移到液氮中。 MSC的解冻小瓶（后续步骤1.3.1 - 1.3.6）。 MSC悬浮在5毫升培养液中（选择合适的介质WJMSC或BMMSC）和种子为25 平方厘米烧瓶中。
（二）建立内皮细胞间质干细胞共培养对Ibidi Microslides
- Trypsinize一个融合25厘米2瓶EC（约1.5×10 6细胞，如第1.4节 ）。悬浮EC 380微升MSCGM（1×25厘米2瓶将种子2个6声道Ibidi microslides（〜1.25×10 5 /通道），用于附着力测定的所有细胞TYPES是培养MSCGM）。加入30微升EC悬挂于每个通道（这将包括通过毛细作用的增长领域）。孵育Ibidi的MicroSlide在37℃和5％CO 2下1小时。
- 添加140微升MSCGM给每个信道，然后吸它关闭。总共3次洗涤重复两次。添加140微升MSCGM并且安置在培养箱中在37℃和5％CO 2的24小时。
- 对于共培养分离MSC（1.4节 ）。执行使用血球或cellometer细胞计数。调整的MSC的浓度为1.5×10 5个细胞/ ml。
- 吸干多余的介质从Ibidi通道（离开介质通道仅增长领域）。加入MSC暂停30μL到Ibidi渠道。吸被从通道的生长区域喷射的介质，并添加另外的30微升的MSC悬浮液。重复一次，然后将Ibidi的MicroSlide在孵化器在37℃和5％CO 2的</ SUB> 1小时。
- 添加140微升MSCGM给每个信道，然后吸它关闭。总共3次洗涤重复两次。添加140微升MSCGM终体积在培养箱每个通道和放置在37℃和5％CO 2的24小时。
- 解冻1×10 5 U / ml的库存TNFα和稀释1：1000在MSCGM至100U / ml的终浓度（相当于〜10毫微克/毫升）。在MSCGM稀释100 U / ml的TNFα由1:10获得10 U / ml的进行连续稀释。在MSCGM稀释10 U / ml的TNFα由1:10获得1 U / ml的。
- 治疗通道的TNFα在37℃之前，测定4小时。在细胞因子治疗温度的波动会改变中性粒细胞招募中观察到的模式。补充新鲜MSCGM未经处理的渠道。
3.建立内皮，间充质干滤清器细胞共培养
- WJ分离或BMMSC在1.4节所述。悬浮颗粒在1ml MSCGM。执行使用血球或cellometer细胞计数细胞。
- 调整体积使终浓度为5×10 5的MSC在500μlMSCGM的。
- 使用无菌镊子反转6孔，0.4微米的PET Transwell小过滤器并将其放置在无菌箱。
- 种子5×10 5的MSC到过滤器的外表面。孵育过滤，在37℃和5％CO 2下1小时。
- 从过滤器的外表面收集介质。计数非粘附的MSC中的媒体的数量。再倒置滤波器使用无菌镊子，并装在装有3毫升MSCGM匹配6孔板。
- 加2ml MSCGM的附着在过滤器（ 图1B）的内表面上。放置在培养箱中在37℃和5％CO 2的24小时。 Trypsinize一个融合25厘米2瓶EC（ 图1AI;如第1.4节 ）。
- 8毫升MSCGM悬浮EC（1×225厘米瓶无线LL种子4 6孔过滤器; 〜5×10 5的EC /过滤器）。从多孔过滤器的顶部和底部抽吸培养基。加3毫升新鲜MSCGM进入下腔（下面的过滤器）。加2ml EC悬浮到每个过滤器的内表面上。孵育1小时，在37℃和5％的CO 2。
- 吸媒体洗掉非贴壁EC和更换新鲜MSCGM。由种子细胞的内表面上没有第一播种MSC建立并行EC单一文化滤波器。孵育O / N在37℃和5％的CO 2。
- 检查EC单层的融合，不包含任何空白。子汇合单层不能使用用于粘附试验（ 图1B）。
- 处理的过滤器的上和下腔室1，10，或100 U / ml的TNFα（相当于〜10毫微克/毫升），在37℃4小时之前的测定法（ 第2部分所述）。
4.隔离白细胞
- 采取静脉血液健康志愿者和等分马上进入EDTA管。轻轻地反转管混合。
- 2.5层毫升的Histopaque 1077上2.5毫升的Histopaque 1119在10ml的圆底管中。层5毫升全血到的Histopaque梯度。离心，在800×g离心40分钟，在室温。
- 嘉实外围中性粒细胞（PMN）在1077的Histopaque 1119和的界面（红细胞层以上）。将在10圆底管，使多达10毫升PBSA。轻轻颠倒管和离心400 XG 5分钟在室温。
- 稀释的7.5％BSA溶液1:50的在100ml的PBS（钙和氯化镁），以0.15％的终浓度（重量/体积; PBSA）。吸上清，重悬在10毫升PBSA。离心，在400×g离心5分钟，在室温。
- 悬浮1毫升PBSA。取细胞悬浮液的20微升等分试样并加入到380微升PBSA（1:20稀释）。计数使用血球或cellometer细胞。稀释到所需concentration（1×10 6个/ ml的对Transwell小的过滤器和Ibidi的MicroSlide）在PBSA。维持中性粒细胞悬液在室温下，直到检测。
5.组装流程系统
- 设置了流动系统， 如图1C所示 。打开加热器，并设置到37℃。附上20ml的注射器（删除柱塞）和5毫升注射器向3路抽头。装上自来水使用微孔胶带有机玻璃室。
- 测量和切一根长的硅2/4毫米（厚）油管即大约在阀和抽头3路之间的距离。削减8 - 10mm长的一块1/3毫米（细）管和插入粗管的一端。厚管一侧连接到水龙头3路。
- 细管的一端连接到电子3路微型阀的一个端口。这是“洗水库”。切6 - 8毫米长一段同甘共苦管。
- 插入细管导入粗管的一端。 ATTACH厚管结束到2毫升注射器（去掉活塞）。
- 2毫升注射器的薄管的一端连接到端口上的电子微型使“样本库”。通过测量和切割一长条薄管是微型阀和显微镜载物台的中心之间的距离连接所述阀到过滤器流动室。
- 为模型的MicroSlide，附加一个8 - 10毫米片厚管到薄管的末端。放置形连接到粗管的端部的L。这将连接到的MicroSlide。为过滤器模型中，附加一个8 - 10毫米片Portex蓝线压力计的连接管连接到所述薄管的末端。
- 将细管一端安装到微型阀。这是用于在洗涤和试样槽的共同输出。填写水库PBSA。素油管通过它们流入PBSA以除去任何气泡。
- 安装压力表管到29毫米（50毫升）玻璃杯里yringe。总理注射器填充10毫升PBSA。倒置注射器，使得连接到所述管道的端部朝上，推动所有气泡。笔芯用5毫升PBSA。
- 对于只的MicroSlide模型，附加一个10 - 19毫米的试片厚管的压力计管道通向玻璃注射器的末端。将形连接器上厚厚的管端的L。放置玻璃注射器到注射器泵输注/撤出。
- 计算使用下面的公式0.1帕（Transwell小的过滤器），或0.05帕（Ibidi microslides）再填充流速（Q），以产生所希望的壁剪切应力所需（τ 瓦特在帕斯卡，帕）：
γW =（6.Q）/（WH 2）
τ=n.γ
其中w =内部宽度和h =内部流动通道的深度。 N =流动溶液的粘度PBSA为n = 0.7毫帕。对于平行板过滤流动室，所述宽度（w）为4毫米，深度（h）为0.133毫米。对D腔室的epth可以由于在所使用的封口膜密封垫的厚度的差异略有不同。为Ibidi的MicroSlide，宽度为3.8毫米，深度为0.4毫米。
注意：由于在流道的尺寸，并捕获动力学的差异，我们使用不同的剪切应力为的MicroSlide模型相比，过滤器模型6。
6.设置平行平板流动腔结合过滤器
- 切割用金属模板一块封口膜（大小相同的玻璃盖玻片）。切出20×4mm的槽，在封口膜使用金属模板（以创建流动通道）。使用垫片，以纪念在玻璃盖玻片的流道。
- 对准在玻璃盖玻片的6孔过滤器的边缘。确保过滤器覆盖所述流动通道的标记。仔细剪下使用类型10A手术刀的过滤器。
- 小心覆盖滤波器用封口膜密封垫，以确保流道槽是在过滤器（ 图1D）的中间。用一块干净的纸巾，并推出任何气泡。
- 放置盖玻片在有机玻璃流动室的底板的凹部中。定位顶部有机玻璃盘上垫片的顶部和螺钉将板一起（ 图1D）。
- 转3路抽头，以允许洗涤缓冲液（PBSA），以流过该阀。压力计管路连接到顶部Persex板的入口。运行PBSA通过流动通道，以允许气泡通过。
- 从注射泵入有机玻璃板的排出口连接管压力计。将注射泵来填充，按运行。清理已经滴到室的上板的任何PBSA。
- 放置在腔室上的倒置相差显微镜的阶段。调整焦距，以可视化上面的过滤器EC（ 图1B）。
7.设置Microslides的流量</ P>
- 放置的MicroSlide到一个倒置相差显微镜的阶段。连接的L形连接器插入一个信道的入口。通过流动通道运行PBSA。
- 放置从注射器泵入通道的出口形连接的升。将注射泵来填充，按运行。清理已经滴落到任何的MicroSlide PBSA。调整焦距，以可视化的EC单层。
8.灌注白细胞在内皮细胞
- 放2 ml纯化的中性粒细胞向样品贮器，离开预热2分钟。洗用PBSA内皮2分钟。
- 打开阀门ON灌注中性粒细胞在血管内皮细胞。交付的嗜中性粒细胞丸药4分钟。关闭阀关闭，并从清洗容器用于实验的其余部分灌注PBSA。
- 确保空气通过的流路的测定期间气泡不会通过在任何点，因为这会破坏乳油monolayER和中性粒细胞粘附的原因支队。
9.录音中性粒细胞捕获和行为
- 记录中性粒细胞招募要么中性粒细胞流或交灌注过程中。
- 使至少5的所有数字录音 - 在流道的中心10个字段。通过移动目标的信道的导入口的边缘，并确定该端口的中间标识信道的中心。
- 中性粒细胞流在录制过程中，采取单场每10秒的画面，持续1分钟。移动沿着通道和1分钟记录另一个字段。重复推的时间。
- 用于记录后灌注，使分10秒的记录 - 10字段向下流动通道的中心，以评估白细胞行为（嗜中性粒细胞丸剂结束后通常为2分钟）。拍摄图像的10秒的时间间隔内每一秒。这使得有足够的时间从流捕获和贴壁neutro的行为菲尔斯待分析。
- 记录至少含有10 transmigrated嗜中性粒细胞的单个场5分钟，拍摄图像，每隔30秒。这可以被用来计算迁移细胞（上面或内皮下方）的速度。
- 录制另一个系列10秒领域（通常为9分钟后灌注）。这使得嗜中性粒细胞的时间迁移穿过内皮细胞单层。
- 停止注射泵和取出管。拆卸流室，冲洗样品库和管道。重复随后的过滤器/渠道的MicroSlide。
白细胞招聘和行为10.分析
- 计数在各场的中性粒细胞在10秒记录在2分钟的时间点的数量。所有单元必须存在于所述第一，第二场以进行计数。细胞，部分地在现场上的视场的2边（ 例如，顶/右手边）被包括在的计数，只要它们留在现场为完整的10秒。
- 计算每场粘着嗜中性粒细胞的平均数量。测量记录字段的长度和宽度。计算字段的面积。计算有多少领域有1 平方毫米。相乘的平均中性粒细胞计数由字段数为1 平方毫米。
- 计算中性粒细胞中性粒细胞的灌注量乘以灌注的总数目（ 例如，2×10 6个 / ml * Q [ 例如，0.0999毫升/分钟为平行平板流动腔]）由丸药的持续时间（ 例如，4分钟）。
- 由嗜中性粒细胞灌注，以确定已粘附细胞的总数量（贴壁细胞/ 2/10 6灌流）的总数除以中性粒细胞计数/ mm 2的。
- 评估中性粒细胞粘附是否滚动，牢牢附着或transmigrated（ 附视频1和2）。
- 一滚动的中性粒细胞是相明亮，会慢慢沿着单层内皮细胞移动（1 - 10微米/秒; 补充视频1）。
- 紧紧贴壁细胞是相明亮并绑定到EC表面，要么保持静止（ 即录制过程中不动），或已发生了形态变化和迁移在EC表面（ 图1Ei）。
- 一个transmigrated中性粒细胞是相暗和EC层（ 图1Eii）所示。
- 计算被轧制，文具和transmigrated贴壁细胞的百分比。可替代地，嗜中性粒细胞的行为可以被表示为显示出通过将用于计算总的附着力（如在步骤10.6中描述- 10.7）相同的公式的不同行为的总细胞数。
- 标记的嗜中性粒细胞轧制的前缘。标记相同的细胞的前缘在10秒的序列的结束。画一条线的赌注吐温的2点和衡量该电池已经走过的距离。
- 通过在该小区所轧制的记录（ 即，10秒）的持续时间除以该值。尽量选择中性粒细胞是在现场对整个10秒间隔。
- 为了计算迁移的中性粒细胞在表面（形改变相亮）或内皮（相暗）下方的速度用5分钟记录（ 附视频2）。
- 绘制迁移细胞的概要，在该序列的开始和整个序列跟踪他们的运动。记的质心的X和Y位置在每个1分钟的时间间隔对每个小区。从在第二图像中的值的序列的第一图像中减去X和Y位置的值。这是基于毕达哥拉斯定理。
- 从第三图像减去第二图像的值。做到这一点的序列中的所有图像。广场吨他x和y的值，并把它们相加。
- 平方根所得到的值。通过平均在每分钟间隔中计算出的速度计算速度为每个小区。轨道10迁移中性粒细胞和计算平均速度。
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Representative Results
最初，我们分析了在使用Ibidi的MicroSlide模型（ 第7 - 9）从流嗜中性粒细胞的募集刺激EC与TNFα的影响。在不存在TNFα，如果小任何中性白细胞粘附到内皮细胞单层（ 图2A）的。这是意料之中的，因为未处理的/休息EC不表达必需的粘附分子（选择素）或趋化因子，以支持结合25,26。与此相反，细胞因子的刺激显著增加中性粒细胞粘附到内皮细胞中以剂量依赖的方式（ 图2A）。密合性，通常保持稳定的测定过程。白细胞对内皮未处理的结合表明，无论是EC被激活（ 即，混有在培养过程中，LPS）和/或嗜中性粒细胞中分离的过程被激活。事实上，内毒素已被证明能增加E-选择的表达，ICAM-1和VCAM-1 月25日至27日 EC的表面，让他们结合嗜中性粒细胞上。
当分析招募嗜中性粒细胞的行为，我们通常观察到的剂量依赖性降低嗜中性粒细胞轧制（ 图2B）与嗜中性粒细胞通过内皮细胞单层（ 图2C）迁移的百分比伴随剂量依赖性增加的百分比。在较低剂量的TNFα刺激（1U / ml）的嗜中性粒细胞的比例较大出现相亮，指示它们所连接的内皮（ 图2B）的顶表面上。与此相反，在10和100单位/毫升（高剂量）的招募嗜中性粒细胞的约40％出现相黑暗中在2分钟表明这些细胞已通过内皮单层迁移并且是内皮（ 图2C）的下方。嗜中性粒细胞能够通过EC迁移中的1 - 2分钟，用轮回达到米aximal水平〜10分钟后灌注28。在这里，我们通过9分钟后的灌注（ 图2C）观察到的增加嗜中性粒细胞轮回从40％在2分钟至60％。我们观察到在滚动（〜3微米/秒）或迁移（〜10 - 12微米/分钟）的速度的TNFα浓度没有影响嗜中性粒细胞。
在过滤器基模型，TNFα刺激增加中性粒细胞粘附以类似于使用Ibidi的MicroSlide模型（ 图3A）观察的剂量依赖性。在行为方面，嗜中性粒细胞轧制是不受TNFα的剂量（ 图3B），而剂量依赖性增加百分比轮回观察（ 图3C）。在这一系列的实验中，我们观察到的时间对嗜中性粒细胞的轮回（ 图3C）无显著影响。
我们提供了有关如何生成两个不同的共培养构建体的方法中，每个这是设计来回答具体问题。在Ibidi的MicroSlide模型，乳油和MSC是在彼此直接接触的单个单层培养的。这种模式是用于检查治疗性注射MSC的效果进入血液，并随后将其融入EC单层有用。在基于过滤器的模型对比，乳油和MSC是在靠近过滤器的相对侧上培养的，但不一定是直接接触。这更类似于组织，与内皮细胞形成表示血管的单层，和MSC居住在内皮下室中。这使我们能够审视组织居民MSC对EC的细胞因子刺激的反应的影响。
根据我们的经验，我们观察到，当EC刺激与100 U / ml的TNFα最大的中性粒细胞招聘和内皮迁移发生。因此，我们已经用这种浓度检查的MSC共培养的效果从流动中性粒细胞内皮招聘。在这里，我们在共培养呈现数据BMMSC使用EC号的MicroSlide和过滤器为基础的模型然而，其他类型的MSC还可以检查如 WJMSC。在这两种模式BMMSC的存在相比，EC单独培养（ 图4A），中性粒细胞粘附显著降低到欧盟。共培养对招募嗜中性粒细胞的行为没有任何影响，用轧和轮回相似水平上观察到EC单独或与MSC（ 图4B和C）的培养。因此，MSC可以修改EC反应的细胞因子的刺激，从而抑制其从流支持中性粒细胞的招聘能力。
图1.建立的EC-MSC共培养，并使用基于流的粘附实验分析中性粒细胞募集。（A）中 （ⅰ）初级EC和（ⅱ）通道3 BMMSC的生长在组织培养瓶中。乳油和MSC（B）的显微照片上培养6孔Transwell滤膜插入。灌注系统（C）的示意图用于产生（一）牢牢地附着（FA）及（ii）transmigrated（TM）以下的中性粒细胞从流通招聘EC流动。（D）平行板式过滤器流室的示意图。（E）显微照片100 U / ml的TNFα刺激。 图片C和D是从图2和图3中的方法对分子生物学采取：T细胞贩运，2010年，第53-54页28与施普林格科学与商业媒体类型的许可， 请点击这里查看这是一个更大的版本数字。
。使用Ibidi microslides图2.中性粒细胞募集，从流TNFα刺激的EC指令被刺激浓度的TNFα的增加（0 - 100U / ml）处理4小时。 A 4分钟丸粒细胞灌注在EC单层0.05帕。（A）中性粒细胞粘附在2分钟评估。方差分析表明TNFα治疗对中性粒细胞粘附，P <0.01显著效果。嗜中性粒细胞的行为进行评估，在2和9分钟，并表示为贴壁细胞的百分比分别是（B）的轧制或（C）transmigrated。方差分析显示对中性粒细胞粘附，P <0.001的行为TNFα治疗的显著效果。在C，ANOVA表现出显著的时间transmigrated中性粒细胞P <0.01。数据是平均值±SEM从n = 3的实验。 * P <0.05和**P <0.01相对于未刺激的（0单位/毫升）乳油控制进行Dunnett试验后的## P <0.01和### P <0.001相对于1U / ml的EC在由邦弗朗尼后相同时间点试验。
从流动到TNFα刺激的EC使用滤波器为基础的检测图3.中性粒细胞募集乳油刺激与浓度的TNFα的增加（0 - 100U / ml）处理4小时。 A 4分钟丸粒细胞灌注在EC单层为0.1Pa。（A）中性粒细胞粘附在2分钟评估。方差分析表明TNFα治疗对中性粒细胞粘附，P <0.001一个显著的效果。嗜中性粒细胞的行为进行评估，在2和9分钟，并表示为贴壁细胞的百分比分别是（B）的轧制或（C）transmigrated。在C，ANOVA笑结婚对中性粒细胞轮回，P <0.05的时间和细胞因子治疗显著效果。数据是平均值±SEM从n = 3的实验。 ** P <0.01和*** P <0.001相对于未刺激的（0单位/毫升）乳油控制进行Dunnett试验后的。＃P <0.05相比于1U / ml的EC在由邦弗朗尼交同一时间点-test。
图4.中性粒细胞募集，从流TNFα刺激的EC-BMMSC共培养物。BMMSC共培养与EC 24小时刺激之前用100U / ml的TNFα4小时。 A 4分钟丸粒细胞灌注在EC单层0.05霸为（A，C，E）microslides和0.1帕的（B，D，F）的过滤器。（AB）中性粒细胞粘附在2分钟评估。中性粒细胞的行为在2和9米评估并表示为贴壁细胞的百分比分别为：（CD）或滚动（EF）transmigrated。在C和D，方差分析显示培养条件对嗜中性粒细胞的滚动，P <0.05显著效果。在E和 F，方差分析结果表明中性粒细胞轮回，P <0.05的时间显著的效果。然而，没有显著差异由邦弗朗尼检测后，观察在个别处理之间轮回。数据是平均值±SEM从N = 5次实验。 * P <0.05相比，EC单一配对t检验或邦费罗尼后的测试。
中性粒细胞的滚动速度的 EC对Transwell滤膜培养补充视频1.分析。刺激用100 U / ml的TNFα4小时。嗜中性粒细胞的丸灌注在EC为4分钟。一个10秒的领域有代表性的数字序列，采取2分钟后灌注。在从开始到10秒的序列的末端的单个轧制嗜中性粒细胞的位置的变化可被用于计算速度，在该嗜中性粒细胞是滚动。
的中性粒细胞迁移的速度补充视频2.分析。乳油培养在Transwell滤膜进行刺激以100U / ml的TNFα4小时。嗜中性粒细胞的丸灌注在EC 4分钟。单个5分钟字段代表数字化的序列，以跟踪transmigrated嗜中性粒细胞的移动。这可以被用来计算速度。
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Discussion
在这里，我们介绍两个体外 “血管”的模型来研究由内皮细胞发炎循环中性粒细胞的招募。这些模型的一个主要优点是分析中的白细胞粘附级联的每个步骤，以便，如将发生在体内的能力。我们先前观察到的剂量依赖性增加中性粒细胞粘附和轮回通过TNFα刺激的EC 9,29。我们还描述了这两种模式如何适应学习基质细胞对白细胞招聘的影响。这里，MSC共培养用乳油在Ibidi的MicroSlide或多孔过滤器的相对侧。这使得这两种类型的细胞，以相互通信，从而改变彼此的表型和响应。我们在这里显示，在以往的研究23，即MSC的存在抑制中性粒细胞粘附到TNFα刺激的EC。这表明，基质细胞修改EC响应细胞因子，并随后改变循环中的白细胞招聘。
除了上面描述的模式，Cellix生物芯片，Bioflux板和Glyotech平行平板流动腔室可商，对于培养的内皮和观察招募提供一种表面可用流路系统。在所有系统中，特定的参数，应考虑而建立内皮培养物并进行基于流的密合性试验中，其中一些在下面突出并在以往的报告30,31。任何抗炎剂，如氢化可的松，可能影响细胞因子应答应当由用于培养和测定18,29的持续时间的介质被省略。当使用Ibidi保证的MicroSlide有欧盟的培养过程中无气泡存在于流道，因为这些会破坏EC单层。内皮单层的完整性应该确认之前cytokiNE-治疗，嗜中性粒细胞将结合在了BSA已涂的MicroSlide /过滤器单层的空白。此外，还必须确保EC在整个细胞因子刺激维持在37℃，因为TNFα是温度敏感的，只有在37℃下的最大效果。对于流量检测本身，选择合适的洗涤液中，我们通常使用PBSA短期分析（少于30分钟）和M199培养基中添加BSA（0.15％），更长的分析（1 - 48小时）30,31。最后确保有在测定期间没有气泡存在于所述流动通道，因为这会破坏流率，损害欧共体单层和激活嗜中性粒细胞粘附。
一此处所述的多细胞的体外模型的主要优点是它们的复制EC和基质细胞之间的体内相互作用的能力。它是难以分离的体内特异性基质成分的作用并修改它们以可控的方式。在我们的模型中，基质细胞可以被操纵以阐明它们与EC如何进行通信，并影响炎症过程的健康和疾病。例如，使用siRNA的技术，我们以前曾表明，生产的IL-6由MSC在共培养物所需的其免疫抑制作用23。每个模型可以用于解决特定问题，即，在白细胞募集组织驻留基质细胞（基于过滤器的模型）或治疗性施用基质细胞（Ibidi microslides和其它市售的系统）的影响。在这两种情况下，我们滴定不同的基质细胞类型，以确保其可行性，并建立基质细胞的一个合适的比例，EC评估招聘15,25的影响。同样培养基必须与并入模型中的每个细胞类型相容。在我们手中共培养物中的基质细胞米典型地edium 11,18,23,31。
使用基于过滤器的模型，我们以前曾表明，各种基质细胞调制EC中以支持粘附和白细胞的迁移以组织特异性方式的能力，并且这些效果变得改变在慢性病3。这导致了基质细胞建立的组织特异性“地址代码”，它积极调节白细胞的募集至发炎的组织24的概念。这些模型是专门设计来检查招募的初始阶段的很详细，但无法研究内皮下空间内的后续的迁移（ 即，远离内皮进入组织）。多细胞，多层次的三维结构，如静态胶原凝胶实验12,32会更适合学习后者的招聘阶段。
我们基于流的黏附模式具有很强的通用性。我们有DEScribed其在中性粒细胞募集的上下文中的使用，但其它的白细胞亚群可以以类似的方式进行研究。我们还使用了Ibidi系统的MicroSlide调查循环MSC通过EC 23的招聘，以及是否发生过同样的附着力级联报道了白细胞。同样地，这些模型可用于研究招募和转移性的肿瘤细胞系的结合，以及它们对内皮反应和白细胞募集后续影响。可替代地，基于过滤器的模型可以适合于从健康组织13,21和疾病11,18,20的部位结合的不同类型的基质细胞（ 例如，成纤维细胞，足细胞，平滑肌细胞）的。这将使得能够组织特异性作用于对EC和/或白细胞的水平调节途径的研究。在所有情况下，在一个范围内的疾病状况正常调节过程的破坏可以被检查，以确定柯ÿ调节介质（如IL-6和TGF-β）和潜在的新的治疗靶点。在慢性炎症的情况下，这些药物可以用来关闭招聘过程，而在癌症生物学人能想象他们的使用，以打开招聘靶向肿瘤。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT. |
| 1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle. |
| Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20 °C in 10 µl aliquots. |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots. |
| Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots. |
| Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots. |
| 100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
| DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| 25 cc tissue culture flask | SLS | 353109 | |
| 75 cc tissue culture flask | SLS | 353136 | |
| Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
| Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
| EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
| Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
| Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM. |
| Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots. |
| 6-well, 0.4 µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
| K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at RT. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4 °C. Warm to RT before use. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4 °C. Warm to RT before use. |
| 10 ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4 °C. |
| 20 ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
| 5 ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
| 2 ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
| 3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
| Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
| Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
| 3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 50 ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
| Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
| Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm. | |
| Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
| Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
| Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate. |
| L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
| Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
| Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. | |||
References
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