We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.
The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed “enteroids” when derived from small intestine and “colonoids” when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.
Foringen epitel af mavetarmkanalen er i konstant fornyelse. Denne proces er udløst af proliferation af intestinale stamceller (HTT), som kontinuerligt producerer afkom hurtigt erstatte tarmepitelet som det vender. Den proliferative rum omfattende individuelle servicekontrakter er begrænset til bunden af krypter. De ISC giver anledning til afkom, der i sidste ende differentiere til absorberende eller sekretorisk afstamninger. Flytning af krypten og på villus eller overfladen epitel celler differentiere gradvist, når de trækker opad før eksfoliering i lumen 1. ISC giver anledning til alle intestinale epitelceller celletyper, herunder enterocytter, microfold celler, enteroendocrine celler, bægerceller, tuftede celler og Paneth celler. Den kolon er præget af langstrakte krypter sammensat hovedsageligt af colonocytter og slimceller, med spredte enteroendokrin og tot celler 2.
Ex vivo cultidige systemer udgør lovende redskab til at studere ISC vedligeholdelse og tarm vævshomeostase. Det er imidlertid vanskeligt at stole på vævskultur teknologier fysiologiske betingelser ikke gengivet i deres helhed, og epitel mikromiljø ofte ændret 3,4. En stor avancement i ISC felt var etableringen af vævsdyrkningsteknikker at fastholde og udbygge de enkelte murine individuelle servicekontrakter hjælp definerede vækstfaktorer til at erstatte de normale tarm niche signaler. Dyrkningsbetingelser Langsigtede blev beskrevet af Sato et al., Hvori en enkelt krypter eller isolerede stamceller fra tarmepitelet vokse til dannelse af 3-dimensionelle epiteliale strukturer, herunder flere crypt-lignende domæner 5-7. Disse tredimensionale strukturer undergår fission arrangementer til løbende udvide. Interessant er alle intestinale celletyper specifikke væv produceret og såvel ekstruderes i et lumen 8. Brug modifikationer af dette system, epithelialorganoids kan genereres fra maven, tyndtarmen og tyktarmen. Mere specifikt epiteliale organoids fra tyndtarmen er enteroids 9, og dem fra tyktarmen er colonoids 9,10. Disse epitelceller organoide kultur er blevet anvendt til at teste evnen af isolerede enkeltceller til at fungere som stamceller in vitro, således at teste "stemness" af isolerede celler 5,6,10-15. Andre forskere har anvendt både enteroids og colonoids at undersøge funktionen af de enkelte epitelceller 16-21. Således kan enteroid og colonoid kulturer anvendes til at evaluere både stamceller og ikke-stamceller funktioner og give ny indsigt i de grundlæggende cellulære interaktioner inden tarmene.
I 2011 Sato og kolleger genereret langsigtede kultur af epitelial organoids afledt af human tyndtarm og tyktarm 22,23. Udover forskelle i medier sammensætning, de humane epiteliale enteroidsog colonoids udviser de samme funktioner som deres murine modstykke. Desuden kan de genereres fra syge væv, såsom Barretts øsofagus, adenom eller adenocarcinom, og cystisk fibrose 22,24. Menneskelige enteroids udgør et værdifuldt system til at studere intestinal stamceller og epithelial mucosal biologi og tjene som et nyt eksperimentelt system til at undersøge både normal og unormal gastrointestinal fysiologi 3.
Her beskriver vi metoder til at etablere enteroids og colonoids fra human tyndtarm og colon krypter (Figur 1). I denne metodiske gennemgang, understreger vi krypten samling fra hele væv og biopsier. Vi rekapitulere kultur- modaliteter, der er afgørende for en vellykket vækst og vedligeholdelse af menneskelige enteroids og colonoids og de mulige eksperimentelle strategier udført af denne model.
Denne metode giver et komplet system gengivelse tarm epiteliale slægter og epiteliale dynamik, der udgør et nyttigt redskab til at studere intestinal epitel biologi. Den præsenteret heri metode blev tilpasset fra den oprindelige murine undersøgelse fra Sato og Clevers 22, der effektivt resulterer i menneskelige enteroids og colonoids. Her har vi manuelt hentet krypter af mikrodissektion at undgå cellulære kontaminanter. Denne metode giver en direkte visualisering af krypter og fører til ensartethed overarbejde i forhold til den oprindelige krypten samling ved "ryste". Andre grupper har udviklet lignende teknik hjælp lidt forskellige tilgange især erstatter chelatering af EDTA med collagenase 25. Ud over de forskelle i krypt samling disse teknikker anvender et definerede medier, der kræves til dyrkning af humane enteroids i kultur 22. For at øge væksten effektivitet på krypt såning, tilføjer vi en GSK3 hæmmer (CHIR99021)for de første to dage 12.
Håndteringen af væv eller biopsier er vigtig, og krypten isolation skal udføres, så snart vævet ankommer i laboratoriet. Imidlertid kunne forsinket crypt isolation og kultur udføres op til 24 timer efter væv indsamling (data ikke vist) som tidligere beskrevet for murine væv 26. Tarmvævet bør placeres i et konisk rør helt fyldt med DPBS at undgå vævsødelæggelse og bør holdes på 4 ° C. Den forsinkede forberedelse tillader væv skibsfart men temperaturudsving bør undgås under transport. Den samlede tid, der kræves til den indledende krypt plating er ca. 2 timer med 15 til 30 min at behandle vævet og 1 til 2 timer for at isolere og pladen krypten. Den mikrodissektion af vævet er en kritisk determinant og prædikat af en ren krypt præparat. Imidlertid krypten frigivelse ved hånd-omrystning som beskrevet i forskellige protokoller er muligt 22,23.
På trods af de ligheder med systemet murine enteroid (enteroids), de menneskelige enteroids kræver specifikke molekyler kan styrke og bevare deres vækst over tid. De vækstfaktorer er EGF, Noggin, R-spondin bruges på samme måde som de murine epitel organoids. Men anvendelsen af Wnt-3A er kritisk. Vi bemærkede, at formationen samt effektiviteten vækst er større ved anvendelse af et Wnt-3A konditioneret medium end det humane rekombinante protein. Sideløbende har vi demonstreret forbedrede dyrkningsbetingelser under anvendelse af en inhibitor af glycogen synthase kinase 3 (CHIR99021) 12. Rekombinante vækstfaktorer kunne erstattes af Wnt-3A, R-spondin, og Noggin konditioneret-medier. En Wnt-3A-udtrykkende L-cellelinie er kommercielt tilgængelig (ATCC). Andre grupper har udviklet R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19, og Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 udtrykker cellelinjer. To små molekyle inhibitorer anvendes i kulturen migdia og er nødvendige til opretholdelse af kulturen 29. A-83-01 er en selektiv inhibitor af transformerende vækstfaktor β og activin / Nodal receptorer (activin-lignende kinase 4, 5, 7) og SB202190 er en p38 mitogen-aktiveret protein kinase inhibitor (MAPK). Begge inhibitorer er blevet anvendt henholdsvis at opretholde menneskeskabte pluripotente stamceller selvfornyelse og etablere menneskelige naive pluripotente stamceller 30-32. Også nikotinamid, en forløber for nikotinamidadenindinucleotid, er forpligtet til at opretholde enteroids og colonoids ekspansion i en langsigtet måde 22,29.
EDTA chelation er et vigtigt skridt, da det bestemmer udbyttet fra præparatet krypt. Vi har haft succes med 2 mM EDTA-behandling. Imidlertid kan EDTA koncentrationen ændres fra 2 mM til 15 mM med hensyn til typen af væv. I dette tilfælde inkubationstid skal bestemmes empirisk. Efter den første plating, vil krypten runde-up og i sidste ende danne enteroids. Men enteroids eller colonoids ofte demonstrere en "stamme" fænotype ved at danne kugler med lidt at ingen differentierede celler. I dette tilfælde kan differentiering initieres ved at trække Wnt-3A, nicotinamid og p38 MAPK inhibitor. Brugen af Notch inhibitor såsom DAPT eller DBZ hjælper øge differentieringen inden for enteroids 22.
Denne model rekapitulerer tarmens fysiologi med løbende krypt-spirende hændelser skyldes en knoglemarven samt villus-lignende epiteliale domæner, der indeholder både absorberende og sekretoriske differentierede afstamninger. Interessant, er dette system ikke indeholder nogen mesenkymale celler og bruger særlige medieforhold at opfylde niche signal krav.
Ligesom murin model kan humane enteroids genereres fra isolerede intestinale epitelceller til at teste kapaciteten af disse celler til at fungere som en stamcelle. SeveRAL undersøgelser har brugt klynge af differentieringsmarkører (CD44, CD24 eller CD166) og EPHB2 positive celler til at berige for celler med stamceller egenskaber 12,23,33. Tilsammen udgør disse undersøgelser viser nytten af menneskelige enteroids kulturer for at teste stemness. Andre forskere bruger denne model til at undersøge tarmsygdomme såsom smitsomme diarrésygdomme, cystisk fibrose eller kolorektale cancere 22,34-37. Disse undersøgelser viser, at menneskelige enteroids udgør en pålidelig sygdomsmodel menneske med mulighed for at arbejde hen imod en personlig screening. Menneskelige enteroids kan genetisk modificeret ved hjælp af DNA-transfektion eller infektion med virale partikler 38. Dette giver et kraftfuldt værktøj til at studere gen-specifikke funktioner i det menneskelige epiteliale organoids eller rette genetiske mutationer. For nylig Schwank og kolleger viste muligheden for at redigere genomet med CRISPR / Cas9 systemet og korrigere mutationen på CFTR-genet forårsager acystic fibrose 24. Menneskelige enteroids udgør et værdifuldt system til at studere intestinal stamceller og epithelial mucosal biologi og tjene som et nyt eksperimentelt system til at undersøge både normal og unormal gastrointestinal fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).
Name of Reagent | Company | Catalog Number |
Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 |
Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 |
Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 |
Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 |
Wnt-3A conditionned medium | in house | – |
Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 |
HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 |
GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 |
N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 |
B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G |
Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 |
Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 |
human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF |
human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 |
human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
A-83-01 | Tocris | 2939 |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG |
human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 |
Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 |
Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 |
CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 |
L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 |
Renilla luciferase assay | Promega | E2710 |
human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF |
HEK293 TOPflash cell line | – | – |